專利名稱：使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，特別涉及一種使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法。
農(nóng)藥是用來保護(hù)農(nóng)、林、牧業(yè)不受害蟲、病菌和雜草等危害以及用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的藥劑，全世界的化學(xué)農(nóng)藥品種大約為14000多種，年產(chǎn)量以原藥計(jì)達(dá)300萬噸。我國1993年農(nóng)藥產(chǎn)量為26.2萬噸，居世界第二位(中國農(nóng)業(yè)年鑒編委會，1994)。農(nóng)藥、化肥的使用在防治害蟲，保障農(nóng)業(yè)增產(chǎn)方面起到了積極作用，使農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量迅速增加，但大量、不合理使用化學(xué)農(nóng)藥，引起害蟲抗性的迅速發(fā)展和害蟲天敵的減少，使得有害生物的再猖獗更加難以對付，產(chǎn)生了一系列的環(huán)境與社會問題。特別是有機(jī)氯農(nóng)藥“666”、“DDT”等已對環(huán)境造成極大危害。據(jù)估計(jì)，全世界每年有1百萬人農(nóng)藥中毒，2萬人死亡(Pimentel et al.1992)。
農(nóng)藥的使用量只有0.1％左右的農(nóng)藥到達(dá)目標(biāo)害蟲，而99.9％的農(nóng)藥或附著于作物與土壤，或飄散在大氣中，通過降雨等經(jīng)地表流入地表水和地下水，污染水體、土壤和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)。據(jù)《1997年中國環(huán)境狀況公報(bào)》報(bào)告，我國七大水系、湖泊、水庫、部分地下水和近岸海域均受到不同程度污染，全國532條河流已有432條嚴(yán)重污染。如不迅速采取行動，30年內(nèi)我國干凈的飲用水將會枯竭。長江、黃河、珠江等主要河流均能檢測到農(nóng)藥，其中1980年長江攜帶的有機(jī)氯農(nóng)藥為該流域上游農(nóng)藥使用量的2.51％(彭小平，1994)。在湖北省天門縣棉區(qū)，由于大量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致飲水中農(nóng)藥1605(對硫磷)含量達(dá)1.125 mg/L，超標(biāo)375倍；DDT含量超標(biāo)1.25倍(魏子昌，1988)。
另外，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用使得農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，直接危害人類健康。在食品的五大污染源(化學(xué)農(nóng)藥、工廠“三廢”、城市垃圾、化肥及人為因素)中，農(nóng)藥的污染面最廣，持續(xù)時(shí)間最長，對人體健康影響最大。棉花和糧食生產(chǎn)中，農(nóng)藥的大量使用還會引起土壤退化、環(huán)境污染、人畜中毒受害等問題。蔬菜、水果在生產(chǎn)、加工、包裝及遠(yuǎn)距離運(yùn)輸中的防腐、防蟲都借助于農(nóng)藥，也都會帶來農(nóng)藥污染。在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，農(nóng)藥不斷地通過生物富集與食物鏈的傳遞，逐級濃縮，人類處于食物鏈的最高位，受害最為嚴(yán)重。同時(shí)，農(nóng)藥對農(nóng)產(chǎn)品的污染已經(jīng)對糧食、水果、蔬菜的銷售和出口產(chǎn)生了負(fù)面影響。據(jù)農(nóng)業(yè)部門1992～1993年對全國主要農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量(化學(xué)農(nóng)藥殘留)調(diào)查檢測分析，上海市近郊常年蔬菜中敵敵畏最大檢出值達(dá)3.51mg/kg，超標(biāo)17.6倍，擬除蟲菊酯農(nóng)藥最大檢出值為8.53mg/kg，超標(biāo)8.53倍。(陶思明，1996)濟(jì)南市郊蔬菜農(nóng)藥殘留調(diào)查表明，超標(biāo)的樣品達(dá)到23.7％(劉炳海等，1994)。據(jù)估計(jì)，江蘇省每年因農(nóng)藥污染超標(biāo)造成的糧食損失超過3.4億元(顏夕生，1993)生物技術(shù)是人類二十世紀(jì)的巨大成就之一。利用生物技術(shù)手段治理環(huán)境污染無疑為人類解決環(huán)境問題提供了又一新的選擇，為徹底解決環(huán)境污染問題提供了新的途徑。生物整治可在污染現(xiàn)場處理被污染土壤或被污染水體，最大限度地降低污染物濃度，環(huán)境負(fù)面影響小。
抗性昆蟲產(chǎn)生的解毒酶可以將大劑量的農(nóng)藥脫去毒性，因此，帶有昆蟲抗性基因的脫毒工程菌可用于降解水源、土壤，以及水果、蔬菜中殘留的有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑，并可以用于人、畜殺蟲劑中毒的治療。
本發(fā)明目的在于提供一種使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法。該方法生產(chǎn)的解毒酶可用于降解水源、土壤，以及水果、蔬菜中殘留的有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑，也可以用于人、畜殺蟲劑中毒的解毒。
本發(fā)明的實(shí)施方案如下本發(fā)明提供的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于工藝步驟如下1)制備脫毒工程菌種子液使用保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊編號為CGMCC No.0290，名稱為Escherichia coli pRL-B1的脫毒工程菌；取瓊脂斜面上生長良好的上述脫毒工程菌，加入無菌水，制成細(xì)胞懸液，并將該細(xì)胞懸液以占液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基體積1％～10％的接種量接種于液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35～37℃范圍內(nèi)，180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)12～16小時(shí)，制備脫毒工程菌種子液；所述的液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基組份及配比為每升液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀4克，NaNO31.2克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克，pH值為7.0；2)分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶將上述脫毒工程菌種子液以占發(fā)酵培養(yǎng)基體積1～10％的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)解毒酶；發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的條件為發(fā)酵起始pH值為6.0～8.0，發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速200～800轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度15～42℃，發(fā)酵液與通氣量的通氣比為1∶1.0～2.0，發(fā)酵時(shí)間22～30小時(shí)，發(fā)酵過程中，隨時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液的糖濃度、溶解氧濃度和pH值的變化，在糖濃度低于每升0.2克時(shí)，開始流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度低于每升0.2-0.4克；在pH值低于7.0時(shí)，開始流加氨水，以保持發(fā)酵液pH值在7.0～7.5之間；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成和配比為每升半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸鹽4.0～30.0克，硝酸鹽1.0～5.0克，硫酸鎂0.1～2.0克，鈣鹽0.01～0.1克，酵母膏5.0～20.0克，蛋白胨5.0～20.0克，葡萄糖5.0～20.0克，消泡劑0.2～1.0毫升；所述半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽為NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4；所述半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鹽為NaNO3、KNO3或NH4NO3；所述半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈣鹽為CaCO3或CaCl2；所述發(fā)酵培養(yǎng)基還可為合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸鹽4.0～30.0克，硝酸鹽1.0～5.0克，硫酸鎂0.1～2.0克，鈣鹽0.01～0.1克，EDTA0.001～0.02克，鈷鹽0.001～0.01克，鐵鹽0.05～0.5克，錳鹽0.005～0.05克，銅鹽0.001～0.01克，鉬酸鹽0.001～0.005克，鋅鹽0.001～0.005克，葡萄糖5.0～20.0克，消泡劑0.2～1.0毫升；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽為NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鹽為NaNO3、KNO3或NH4NO3；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈣鹽為CaCO3或CaCl2；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈷鹽為CoCl2或CoSO4；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鐵鹽為FeSO4或FeCl2；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的錳鹽為MnSO4或MnCl2；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的銅鹽為CuSO4或CuCl2；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鉬酸鹽為NaMoO4或KMoO4；所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鋅鹽為ZnSO4或ZnCl2。
用本發(fā)明提供的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法生產(chǎn)，其脫毒工程菌的生長量可以達(dá)到每升20克干重細(xì)胞以上，每升解毒酶的總產(chǎn)量超過1.0克，有生物活性的、可溶性解毒酶的每升含量可達(dá)50毫克以上，解毒酶在細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體中解毒酶的純度超過80％；本發(fā)明方法生產(chǎn)的解毒酶，可用于降解被污染的水源、土壤，以及水果、蔬菜中的有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑，也可以用于人、畜殺蟲劑中毒的解毒治療。
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述分發(fā)明附


圖1為實(shí)施例1發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖；附圖2為實(shí)施例2發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖；附圖3為實(shí)施例3發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖；附圖4為實(shí)施例4發(fā)酵的時(shí)間過程曲線其中橫坐標(biāo)培養(yǎng)時(shí)間，用H表示，單位為小時(shí)；縱坐標(biāo)分別+表示溶氧(％)；▲表示葡萄糖(g/L)；◆表示酶(g/L)；■表示細(xì)胞干重(g/L)；●表示pH值。
實(shí)施例1用本發(fā)明的方法發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶1)制備脫毒工程菌種子液使用保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊編號為CGMCC No.0290，名稱為Escherichia coli pRL-B1的脫毒工程菌；取在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的上述脫毒工程菌五支，加入無菌水，制成細(xì)胞懸液；將該細(xì)胞懸液以占液體種子培養(yǎng)基體積1％的接種量分別接入五個(gè)裝有200毫升液體種子培養(yǎng)基的1000毫升三角瓶中，在35～37℃、180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)16小時(shí)，作為一級種子液；將上述五瓶一級種子液接種于裝有700升液體種子培養(yǎng)基的1噸發(fā)酵罐中，發(fā)酵通氣量1∶1，發(fā)酵溫度35～37℃，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵18小時(shí)作為二級種子液；所使用的液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基的組份及配比為每升液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀4克，NaNO31.2克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克，pH7.0；2)分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶將上述二級種子液以2％的接種量接入裝有30噸發(fā)酵培養(yǎng)基LB316的50噸發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)解毒酶；其培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)的條件為發(fā)酵起始pH值為6.8-7.0，發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速度200～300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度為15～35℃，通氣量為1∶1.0，發(fā)酵時(shí)間22小時(shí)；在發(fā)酵過程中，隨時(shí)監(jiān)控溶解氧濃度、糖濃度和pH值的變化，調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，使發(fā)酵液內(nèi)的溶解氧濃度高于飽和濃度的25％，當(dāng)糖濃度下降到低于每升0.2克時(shí)，開始流加葡萄糖，流速為每小時(shí)每升發(fā)酵液流加5～15克葡萄糖，控制葡萄糖濃度低于每升0.4克；當(dāng)pH值低于7.0時(shí)，開始流加氨水，保持發(fā)酵液pH值在7.0～7.5之間；發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀2克，NaNO31.0克，硫酸鎂0.4克，氯化鈣0.1克，酵母膏15.0克，蛋白胨15.0克，葡萄糖20.0克，消泡劑1.0毫升。
附
圖1為實(shí)施例1發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖，從圖中可以看出，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，脫毒工程菌的生長量達(dá)到每升培養(yǎng)基42克干重細(xì)胞，解毒酶的總產(chǎn)量達(dá)到每升1.5克。
本實(shí)施例步驟2)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基也可為合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀2克，NaNO31.0克，硫酸鎂0.4克，氯化鈣0.1克，EDTA0.001克，氯化鈷0.001克，硫酸鐵0.5克，硫酸錳0.005克，硫酸銅0.001克，鉬酸鉀0.001克，硫酸鋅0.005克，葡萄糖10.0克，消泡劑1.0毫升。
實(shí)施例2用本發(fā)明的方法發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶1)制備脫毒工程菌種子液使用保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊編號為CGMCC No.0290，名稱為Escherichia coli pRL-B1的脫毒工程菌；取在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的上述脫毒工程菌五支，加入無菌水，制成細(xì)胞懸液；將該細(xì)胞懸液以占液體種子培養(yǎng)基體積5％的接種量分別接入五個(gè)裝有200毫升液體種子培養(yǎng)基的1000毫升三角瓶中，在35～37℃、180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)12小時(shí)，作為一級種子液；將上述五瓶一級種子液接種于裝有700升液體種子培養(yǎng)基的1噸發(fā)酵罐中，發(fā)酵通氣量1∶1.0，發(fā)酵溫度35～37℃，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵18小時(shí)作為二級種子液；所使用的液體種子培養(yǎng)基的組份及配比為每升液體種子培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀4克，NaNO31.2克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克，pH7.0；2)分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶將上述二級種子液以1％的接種量接入裝有30噸發(fā)酵培養(yǎng)基SM310的50噸發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶；其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為發(fā)酵起始pH值為6.8-7.0，發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速度300～500轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度為35～42℃，通氣量為1∶2.0，發(fā)酵時(shí)間30小時(shí)；在發(fā)酵過程中，隨時(shí)監(jiān)控溶解氧濃度、糖濃度和pH值的變化，調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，使發(fā)酵液內(nèi)的溶解氧濃度高于飽和濃度的30％，在糖濃度下降到低于每升0.2克時(shí)，開始流加葡萄糖，流速為每小時(shí)每升發(fā)酵液流加5～15克葡萄糖，控制葡萄糖濃度低于每升0.3克；在pH值低于7.0時(shí)，開始流加氨水，保持發(fā)酵液pH值在7.0～7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉4克，磷酸二氫鉀4克，(NH4)2HPO42克，NaNO32.2克，硫酸鎂2.0克，碳酸鈣0.01克，葡萄糖10.0克，酵母膏20克，蛋白胨5克，消泡劑0.2毫升。
附圖2為實(shí)施例2發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖，從圖中可以看出，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，脫毒工程菌的生長量達(dá)到每升培養(yǎng)基75克干重細(xì)胞，解毒酶的總產(chǎn)量達(dá)到每升3.9克。
本實(shí)施例步驟2)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基也可為合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉4克，磷酸二氫鉀4克，磷酸氫二銨2克，NaNO32.2克，硫酸鎂2.0克，氯化鈣0.01克，EDTA0.02克，硫酸鈷0.01克，硫酸鐵0.05克，氯化錳0.05克，氯化銅0.01克，鉬酸鈉0.005克，氯化鋅0.001克，葡萄糖20.0克，消泡劑0.2毫升。
實(shí)施例3用本發(fā)明的方法發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶1)制備脫毒工程菌種子液使用保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊編號為CGMCC No.0290，名稱為Escherichia coli pRL-B1的脫毒工程菌；取在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的上述脫毒工程菌五支，加入無菌水，制成細(xì)胞懸液；將該細(xì)胞懸液以占液體種子培養(yǎng)基體積10％的接種量分別接入五個(gè)裝有200毫升液體種子培養(yǎng)基的1000毫升三角瓶中，在pH7.0、35～37℃、180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)14小時(shí)，作為種子液；所使用的液體種子培養(yǎng)基的組份及配比為每升液體種子培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀4克，NaNO31.2克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克；2)分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶將上述二級種子液以10％的接種量接入裝有5升發(fā)酵培養(yǎng)基LB316的10升發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶；其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為發(fā)酵起始pH值為7.0，發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速度500～800轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度35～37℃，通氣量為1∶1.5，發(fā)酵時(shí)間27小時(shí)；在發(fā)酵過程中，隨時(shí)監(jiān)控溶解氧濃度、糖濃度和pH值的變化，調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，使發(fā)酵液內(nèi)的溶解氧濃度高于飽和濃度的25％，在糖濃度下降到低于每升0.2克時(shí)，開始流加葡萄糖，流速為每小時(shí)每升發(fā)酵液流加5～15克葡萄糖，控制葡萄糖濃度低于每升0.3克；在pH值低于7.0時(shí)，開始流加氨水，保持發(fā)酵液pH值在7.0～7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉15克，磷酸二氫鉀8克，硝酸銨3.0克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.01克，酵母膏12.0克，蛋白胨20.0克，葡萄糖5.0克，消泡劑0.6毫升。
附圖3為實(shí)施例3發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖，從圖中可以看出，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，脫毒工程菌的生長量達(dá)到每升培養(yǎng)基57克干重細(xì)胞，解毒酶的總產(chǎn)量達(dá)到每升1.6克。
本實(shí)施例步驟2)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基也可為合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉4克，磷酸二氫鉀8克，硝酸銨3克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.01克，EDTA0.09克，硫酸鈷0.09克，硫酸鐵0.03克，氯化錳0.04克，氯化銅0.008克，鉬酸鉀0.004克，硫酸鋅0.003克，葡萄糖5.0克，消泡劑0.6毫升。
實(shí)施例4用本發(fā)明的方法發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶1)制備脫毒工程菌種子液使用保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊編號為CGMCC No.0290，名稱為Escherichia coli pRL-B1的脫毒工程菌；取在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的上述脫毒工程菌一支，加入無菌水，制成細(xì)胞懸液；將該細(xì)胞懸液以占液體種子培養(yǎng)基體積1％的接種量接入裝有200毫升液體種子培養(yǎng)基的1000毫升三角瓶中，在35～37℃、180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)16小時(shí)，作為種子液；所使用的液體種子培養(yǎng)基的組份及配比為每升液體種子培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀4克，NaNO31.2克，硫酸鎂0.4克，氯化鈣0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克，pH7.0；2)分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶將上述二級種子液以2％的接種量接入裝有5升發(fā)酵培養(yǎng)基SM310的10升發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶；其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為發(fā)酵起始pH值為6.8，發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速度600～800轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度20～35℃，通氣量為1∶2.0，發(fā)酵時(shí)間22小時(shí)；在發(fā)酵過程中，隨時(shí)監(jiān)控溶解氧濃度、糖濃度和pH值的變化，調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，使發(fā)酵液內(nèi)的溶解氧濃度高于飽和濃度的30％，糖濃度下降到低于每升0.2克時(shí)，開始流加葡萄糖，流速為每小時(shí)每升發(fā)酵液流加5～15克葡萄糖，控制葡萄糖濃度低于每升0.4克；pH值低于7.0時(shí)，開始流加氨水，保持發(fā)酵液pH值在7.0～7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉16克，磷酸二氫鉀8克，(NH4)2HPO46克，NaNO35.0克，硫酸鎂0.2克，氯化鈣0.05克，葡萄糖5.0克，酵母膏5克，蛋白胨18克，消泡劑0.2毫升。
附圖4為實(shí)施例4發(fā)酵的時(shí)間過程曲線圖，從圖中可以看出，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，脫毒工程菌的生長量達(dá)到每升培養(yǎng)基58克干重細(xì)胞，解毒酶的總產(chǎn)量達(dá)到每升2.8克。
本實(shí)施例步驟2)中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基也可為合成發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份及配比為每升合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉16克，磷酸二氫鉀8克，磷酸二氫銨6克，NaNO35.0克，硫酸鎂0.2克，碳酸鈣0.05克，EDTA0.02克，硫酸鈷0.07克，氯化鐵0.4克，氯化錳0.01克，氯化銅0.005克，鉬酸鈉0.003克，氯化鋅0.004克，葡萄糖5.0克，消泡劑0.2克。
權(quán)利要求
1.一種使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于工藝步驟如下1)制備脫毒工程菌種子液使用保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊編號為CGMCC No.0290，名稱為Escherichia coli pRL-B1的脫毒工程菌；取瓊脂斜面上生長良好的上述脫毒工程菌，加入無菌水，制成細(xì)胞懸液，并將該細(xì)胞懸液以占液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基體積1％～10％的接種量接種于液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35～37℃范圍內(nèi)，180轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)12～16小時(shí)，制備脫毒工程菌種子液；所述的液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基組份及配比為每升液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸氫二鈉2克，磷酸二氫鉀4克，NaNO31.2克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克，pH值為7.0；2)分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶將上述脫毒工程菌種子液以占發(fā)酵培養(yǎng)基體積1～10％的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)解毒酶，其發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的條件為發(fā)酵起始pH值為6.0～8.0，發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速200～800轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度15～42℃，發(fā)酵液與通氣量的通氣比為1∶1.0～2.0，發(fā)酵時(shí)間22～30小時(shí)，發(fā)酵過程中，隨時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液的糖濃度、溶解氧濃度和pH值的變化，在糖濃度低于每升0.2克時(shí)，開始流加葡萄糖，以保證細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成所需要的碳源和能源；在pH值低于7.0時(shí)，開始流加氨水，以保持發(fā)酵液pH值在7.0～7.5之間；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，其半合成培養(yǎng)基的組成和配比為每升半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸鹽4.0～30.0克，硝酸鹽1.0～5.0克，硫酸鎂0.1～2.0克鈣鹽0.01～0.1克，酵母膏5.0～20.0克，蛋白胨5.0～20.0克，葡萄糖5.0～20.0克，消泡劑0.2～1.0毫升；其合成培養(yǎng)基的組成和配比為每升合成發(fā)酵培養(yǎng)基中含磷酸鹽4.0～30.0克，硝酸鹽1.0～5.0克，硫酸鎂0.1～2.0克，鈣鹽0.01～0.1克，EDTA 0.001～0.02克，鈷鹽0.001～0.01克，鐵鹽0.05～0.5克，錳鹽0.005～0.05克，銅鹽0.001～0.01克，鉬酸鹽0.001～0.005克，鋅鹽0.001～0.005克，葡萄糖5.0～20.0克，消泡劑0.2～1.0毫升。
2.按權(quán)利要求1所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽為NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4。
3.按權(quán)利要求1所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鹽為NaNO3、KNO3或NH4NO3；
4.按權(quán)利要求1所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈣鹽為CaCO3或CaCl2。
5.按權(quán)利要求1所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽為NH4H2PO4、(NH4)2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4。
6.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鹽為NaNO3、KNO3或NH4NO3。
7.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈣鹽為CaCO3或CaCl2。
8.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鈷鹽為CoCl2或CoSO4。
9.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鐵鹽為FeSO4或FeCl2。
10.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的錳鹽為MnSO4或MnCl2。
11.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的銅鹽為CuSO4或CuCl2。
12.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鉬酸鹽為NaMoO4或KMoO4。
13.按權(quán)利要求5所述的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法，其特征在于所述合成發(fā)酵培養(yǎng)基中的鋅鹽為ZnSO4或ZnCl2。
全文摘要
本發(fā)明涉及的使用脫毒工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶的方法:使用Escherichia coli pRL－B1脫毒工程菌,采用半合成或合成培養(yǎng)基,在攪拌式生物反應(yīng)器內(nèi)高密度發(fā)酵生產(chǎn)解毒酶,生產(chǎn)過程中,保持溶解氧濃度高于飽和濃度20%,流加氨水以補(bǔ)充氮源,流加葡萄糖為菌體生長提供碳源,保持葡萄糖濃度1.0g/L以下pH6.5～7.5,有生物活性的、可溶性解毒酶每升含量可達(dá)50毫克以上,解毒酶在細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體中解毒酶純度超過80%,所生產(chǎn)的解毒酶,可用于降解被污染的水源、土壤,水果、蔬菜中的有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑,人、畜殺蟲劑中毒的解毒治療。
文檔編號C12N1/20GK1341712SQ0012377
公開日2002年3月27日 申請日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月7日
發(fā)明者喬傳令, 邢建民, 黃菁, 李典謨 申請人:中國科學(xué)院動物研究所