專利名稱：焦磷酸測序法檢測gstp1基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測序法檢測GSTPl基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
人類谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Pl (GSTPl)是體內(nèi)最重要的II相解毒酶，主要催化GSH與多種外源性化學物在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物結(jié)合，在很多癌癥化療藥物的解毒代謝中起重要作用。鉬類抗癌藥是臨床上的一線化療藥物，用于多種腫瘤的化療。常見的有順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、奈達鉬、樂鉬等。GSTPl rsl695 (Ilel05Val)突變導(dǎo)致酶活性顯著降低，降低 了鉬類化療藥物的代謝清除率，延長了鉬類化療藥物對腫瘤的作用，因此患者化療后生存率顯著增加，但應(yīng)關(guān)注藥物毒副作用。有研究報道奧沙利鉬治療的患者中，發(fā)生3級神經(jīng)毒性23%為Ilel05Ile野生型純合子，77%為105Val突變攜帶者。經(jīng)正規(guī)治療的Vall05Val突變純合子患者晚期結(jié)直腸癌患者的相同時間生存率約為75% ； Vall05Val雜合子患者晚期結(jié)腸直腸癌患者的相同時間生存率約為40% ；Ilel05Ile野生型純合子相同時間生存率僅為5%。蒽環(huán)類(Anthracyclines)化療藥物是臨床常用的抗腫瘤抗生素藥物，主要包括阿霉素、表阿霉素等，是一類細胞周期非特異性化療藥。其主要藥理作用是通過嵌入DNA堿基對之間，抑制拓撲異構(gòu)酶II的催化活性，導(dǎo)致DNA斷裂。GSTPl參與蒽環(huán)類的代謝過程，是影響蒽環(huán)類藥物需經(jīng)肝臟代謝活化后起效的重要酶。GSTPl遺傳多態(tài)性對蒽環(huán)類化療藥物的療效或毒性反應(yīng)有重要影響。其rsl695位點發(fā)生A>G將引起Ilel05Val，從而降低酶的活性，導(dǎo)致蒽環(huán)類藥物的活化效率降低。攜帶A/A (70. 5%)基因型療效較差。反之，攜帶G/G (2. 6%)等位基因患者對化療更為敏感，療效較好。有研究表明、接受蒽環(huán)類抗生素化療的結(jié)直腸癌患者中攜帶G/G等位基因較攜帶A/A基因型對化療更為敏感，療效更好。綜上所述，GSTPl基因多態(tài)性可作為鉬類化療藥物、蒽環(huán)類抗生素等藥物療效預(yù)測的有效指標，開發(fā)快速、高效、準確、便捷、經(jīng)濟的檢測GSTPl基因多態(tài)性的試劑盒將為GSTPl底物藥(如鉬類、蒽環(huán)類抗生素等)的臨床個體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種焦磷酸測序法檢測GSTPl基因(SEQ ID NO. I)多態(tài)性的試劑盒及方法，以實現(xiàn)快速、簡便、準確、高效、實用、經(jīng)濟的檢測GSTPl基因多態(tài)性，利于臨床個體化使用GSTPl的底物藥(如鉬類、蒽環(huán)類抗生素等)。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為所述焦磷酸測序發(fā)檢測GSTPl基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物
(1)擴增引物
上游引物5’ -CTG GTG GAC ATG GTG AAT-3’ (SEQ ID NO. 2)；
下游引物5’ -CCC AGT GCC CAA CCC TGG-3，(SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5 進行生物素標記；
(2)測序引物:5，-CCTCCG CTG CAA ATA-3，(SEQ ID NO. 4)；
在實際應(yīng)用中，可以對上述引物作適當改變，只要保證設(shè)計的引物與上述引物同源性達95%以上即可；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。所述應(yīng)用上述試劑盒檢測GSTPl基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟
(1)DNA 提??；
(2)聚合酶鏈反應(yīng)
配制 50 ill PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 5. Oy I，dNTP I. 5 y I，GSTPl-上游引物 0. 5iil，GSTPl 下游引物 0. 5iil，rTaqO. 5iil，水 40iil，模板 2iil ;循環(huán)程序為95V 5min預(yù)變性；依次在95°C 30S,55°C 30S,72°C 15S，進行35個循環(huán)；72°C保持5min，最終保持在4°C，得擴增產(chǎn)物；
(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對GSTPl rsl695 (A>G)目標序列，該目標序列包括野生型AATACATCTCC (SEQ ID NO. 5)和突變型 AATACGTCTCC (SEQ ID NO. 6);擴增出的片段長為104bp。由于設(shè)計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)STPl基因多態(tài)性進行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于臨床上鉬類、蒽環(huán)類抗生素等個體化用藥方案制定的基因檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發(fā)明GSTPl rsl695 (AA)焦磷酸測序結(jié)果；
圖2為本發(fā)明GSTPl rsl695 (AG)焦磷酸測序結(jié)果；
圖3為本發(fā)明GSTPl rsl695 (GG)焦磷酸測序結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I :
GSTPl-pyroF (上游引物):5，- CTG GTG GAC ATG GTG AAT -3，(SEQ ID NO. 2)； GSTPl-pyroR (下游引物):5’ - CCC AGT GCC CAA CCC TGG -3’ (SEQ ID NO. 3)；
測序引物:5，- CCT CCG CTG CAA ATA -3，(SEQ ID NO. 4)；
I. DNA提取1.1實驗前試劑材料準備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標識處打勾V ; (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應(yīng)標本唯一性標識做好標記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管,振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；
I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I.19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；
I.20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側(cè)放風干；
I. 21目測沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；
1.24保存核酸標本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應(yīng)
2.I在試劑準備區(qū)配制50 Ul PCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測序發(fā)檢測GSTPl基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物 (1)擴增引物上游引物:5，-CTG GTG GAC ATG GTG AAT-3’ ；下游引物5’ -CCC AGT GCC CAA CCC TGG-3，； 其中，下游引物的5’進行生物素標記； (2)測序引物:5，-CCTCCG CTG CAA ATA-3，。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測GSTPl基因多態(tài)性的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)DNA 提取； (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 ill PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 5. Ou I, dNTP I. 5 y I，GSTPl-上游引物0. 5iU，GSTPl下游引物0. 5iU，rTaqO. 5iU，水40iU，模板2iil ;循環(huán)程序為95°C 5min 預(yù)變性；依次在 95°C 30S,55°C 30S,72°C 15S，進行 35 個循環(huán)；72°C 保持 5min，最終保持在4°C，得擴增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測GSTP1基因多態(tài)性的試劑盒及方法。所述試劑盒GSTP1基因多態(tài)性進行檢查，具體的是指rs1695(A>G)單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQIDNO.2—4引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實現(xiàn)準確、快捷、高通量GSTP1基因多態(tài)性的檢測，從而達到對其底物鉑類化療藥物、蒽環(huán)類抗生素等實現(xiàn)安全合理有效的個體化給藥。
文檔編號C12Q1/68GK102776281SQ20121023135
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者周宏灝 申請人:周宏灝