專利名稱：一種新的松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病蟲害的檢疫領(lǐng)域，提供了一種利用PCR擴增和核酸試紙條聯(lián)合檢測技術(shù)快速檢測松材線蟲的方法及其試劑盒，適用于口岸檢驗檢疫機構(gòu)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是當(dāng)前嚴(yán)重威脅和危害松林安全的最主要的有害生物，其引發(fā)的松材線蟲病是當(dāng)前世界四大林木病害之一。該病害主要是通過松類植物及其產(chǎn)品的調(diào)運傳播，是一種松樹毀滅性的病害，一旦發(fā)生，難防難治，會造成巨大的經(jīng)濟損失。該病害主要分布于美國、加拿大、日本等多個國家。我國于1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲，隨后，又相繼在江蘇、安徽、廣東等地的局部地區(qū)以及香港、臺灣地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，對我國局部地區(qū)的森林造成了巨大的破壞，因此加強口岸檢疫尤為重要。 研究高效、快速、靈敏的松材線蟲檢驗檢測技術(shù)是有效地發(fā)現(xiàn)和控制病害的重要手段。為了尋找準(zhǔn)確、快速的檢測方法，很多學(xué)者在線蟲的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)和生物化學(xué)方面做了深入研究，并研究出了如pH值檢測法、纖維素酶擴散檢測法等檢測方法，對于松材線蟲的檢測起到了積極的作用，但這些方法受到松材線蟲生長發(fā)育期、蟲口數(shù)量、實驗條件穩(wěn)定性等方面的限制，在實際應(yīng)用過程中具有一定的局限性。近些年來，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員應(yīng)用分子生物學(xué)的方法來檢測松材線蟲，以克服由于傳統(tǒng)方法帶來的不足。PCR-RAPDL、PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù)等分子生物檢測方法雖然提高了檢測的準(zhǔn)確性，但這些方法對技術(shù)人員和實驗條件要求較高，從而這些方法在的推廣使用，因此尋求一種簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測方法仍是當(dāng)前在生廣實際中急需解決的問題。本研究通過巧妙地設(shè)計針對松材線蟲的帶標(biāo)記的特異性引物和競爭性引物，應(yīng)用PCR擴增和核酸試紙條聯(lián)合檢測技術(shù)，實現(xiàn)了松材線蟲的高效快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于提高線蟲檢測的準(zhǔn)確性、縮短檢測時間具有重要的作用。方便快捷，節(jié)約成本和時間，原理和操作簡單，不需特殊儀器，適合檢驗檢疫部門運用和推廣，同時對其他線蟲的快速檢測也具有重要的借鑒意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供用于檢測松材線蟲的特異性引物和競爭性引物。本發(fā)明需要解決的另一問題是提供包含上述引物的PCR檢測試劑盒。本發(fā)明用于檢測松材線蟲的PCR引物序列為上游引物Bx-F3_bio :5，biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3，下游引物Bx-B3-fit :5’ fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3’競爭引物Bx-B3-comp :5’ -GTCAGGGACGTTCGGAACT-3’本發(fā)明的松材線蟲檢測試劑盒，包括以下成分
(I)松材線蟲DNA模板和陰性對照擬松材線蟲DNA模板(2)松材線蟲上下游引物和競爭引物上游引物Bx-F3-bio :5，biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3’下游引物Bx-B3-fit :5’ fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3 競爭引物Bx-B3-comp :5’ -GTCAGGGACGTTCGGAACT-3’(3)10XExTaq PCR Buffer, DDH2O,2. 5mM dNTP,5U/μ I ExTaq 酶用上述方法對待測樣品DNA進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用試紙條檢測，若控制線正常，檢測線呈現(xiàn)陽性，則說明該樣品含有松材線蟲，若呈現(xiàn)陰性，則說明該樣品中不含有松材線蟲。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進(jìn)步在于使用儀器簡單，無需瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像，從而避免了溴化乙錠的污染，節(jié)省時間，特異性強，靈敏度高，穩(wěn)定性好，降低了實驗室的投入，適合基層實驗室推廣使用。


圖I為松材線蟲試劑盒特異性測試結(jié)果，I為陰性對照，2、3為擬松材線蟲，4為豆傘滑刃線蟲，5為食菌傘滑刃線蟲，6為萊奴爾夫傘滑刃線蟲，7為真滑刃屬線蟲(AphelenchusSP.)的一種，8、9為松材線蟲，從圖I可以產(chǎn)出本試劑盒能準(zhǔn)確地檢測出松材線蟲
具體實施例方式PCR引物設(shè)計ICGTAACMGG TAGCTGTAGG TGMCCTTCG GCTGGATCAT TACCGATCCT ATGACACATT61TATTCGTGCT CGTCACGATG ATGCGATTGG TGACTTCGGT TGCCGCGCAT GATGGCGGTT121CGATTCGCGT CGTTCCGCCT ACTTATGGTT CGCATGGAAG CCGAGAGGCG ACCGTGCAAC181GGTGMGTCT GGGTTTCTAC GTGCTGTTGT TGAGTTGGCG TTTTACCGTG CCGACAGATG241AGACCAGCCA GCTGCTTGCC GATTCGTTCT GGCGAGCGTA GGATTGAAAA GCCCGAGAGG301CTGCCCTGAC AAAACATTCA TTTTACATTT ATTTTGTTGG AAAAGAGCTT TAAGTTACTC361CGGTGGATCA CTTGGCTCGC GGGTCGATGA AGMCGCAGT GMTTGCGAT MTAAGTACG421MTTACAGAT ATTATGAGTA CCATGTTTTT GAATGCATAT TGCGCTCTTG GGCTTTGCTC481TTGAGCATAT TCGATTCAGG GTGTGTTTTT AAACTCGAGC AGAMCGCCG ACTTGTTTTT541TTCAAGTTTC TGCACGTTGT GACAGTCGTC TCGCATTGTT CACGCMTGT TAGGCACCATF3601CTGTTTTACG CGGTTTGTTC CGCGACCMT ATCTTCTACG CACTGTTTGT TCGTGCGGCG661AGAGGGCTTC GTGCTCGATT GTCGTGCGGC TAMCCGTTT GGTGATGTTG TTTCMCGGC721GCGGCCGTCA GGGACGTTCG GATGAGAATG TTTGGAGTCC TGGCTGCGGT TTGTTGAGCTΒ3781TCGTCGTGM GCCTTGCGGG CAGTGTTGTC GGMTTGGTT GAAACCACCT GAGTTGGGTA841TGACTACCTG CTGMCTTAA GCATATCAGT MGCAGAGGA AMGAMCAA ACATGGATTC901CCTTAGTAAC GGCGAGTGAA A
根據(jù)Genbank公布的松材線蟲的DNA序列，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計一組引物，片段大小為197bp，上、下游引物的5'端分別用生物素(Biotin)和熒光素(Fitc)修飾，由Invitrogen (上海英俊生物技術(shù)有限公司)公司合成上游引物Bx-F3-bio :5’ Biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3 下游引物Bx-B3-fit :5’ Fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3
競爭引物Bx-B3-comp :5’ -GTC AGGGACGTTCGGAACT-3’標(biāo)本來源本實驗測試了近年來天津出入境植物中來源不同的8個線蟲種群，其中包括2個松材線蟲種群,2個擬松材線蟲種群，3個傘滑刃線蟲種群，I個真滑刃屬線蟲，見下表
權(quán)利要求
1.一種用于松材線蟲檢測的特異性引物和競爭性引物，其特征在于，序列為上游引物 Bx-F3-bi0 :5’ Biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3’下游引物 Bx-B3-fit :5’ Fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3’競爭引物 Bx-B3-comp :5’ -GTCAGGGACGTTCGGAACT-3，
2.一種用于檢測松材線蟲的試劑盒其特征在于，包括如下成分 (1)陽性對照松材線蟲DNA模板和陰性對照擬松材線蟲DNA模板 (2)松材線蟲上下游引物和競爭引物上游引物 Bx-F3-bio :5’ Biotin-TCTGCACGTTGTGACAGTC-3’下游引物 Bx-B3-fit :5’ Fitc-TCATCCGAACGTCCCTGAC-3’競爭引物 Bx-B3-comp :5’ -GTCAGGGACGTTCGGAACT-3，(3)IOXExTaq PCR Buffer, ddH20, 2. 5mM dNTP,5U/y I ExTaq 酶 (4)生物素(Biotin)、熒光素(Fitc)抗原標(biāo)記的薄膜層析試紙條。
3.一種松材線蟲的快速檢測方法，包括如下步驟(2)PCR 反應(yīng)體系
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的松材線蟲檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明通過巧妙地設(shè)計松材線蟲的帶標(biāo)記的特異性引物和競爭性引物，應(yīng)用PCR擴增和試紙條聯(lián)合檢測技術(shù)，實現(xiàn)了松材線蟲的高效快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于提高線蟲檢測的準(zhǔn)確性、縮短檢測時間具有重要的作用。方便快捷，節(jié)約成本和時間，原理和操作簡單，不需特殊儀器，適合檢驗檢疫部門運用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102925545SQ20121023155
公開日2013年2月13日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者張裕君, 鄭文杰, 賀艷, 王金成, 廖芳 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心