專利名稱：汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用微生物生產(chǎn)纖維素酶的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法。
纖維素酶解轉(zhuǎn)化應(yīng)用的最大障礙在于成本太高，纖維素酶制劑的成本是纖維質(zhì)原料的五十倍。許多絲狀真菌可以合成大量的胞外纖維素酶，被認為是最有希望投入實際生產(chǎn)的微生物菌群。象里氏木霉(Tricherma reesei)等絲狀真菌，其胞外纖維素酶蛋白質(zhì)已達30-40g/l，接近或已達到高產(chǎn)淀粉酶的胞外蛋白質(zhì)濃度，似乎已無大幅度提高的可能。但這些工作多數(shù)是采用純的纖維素粉，無機鹽等配制而成的合成培養(yǎng)基，進行液態(tài)發(fā)酵。正如《發(fā)酵與生物技術(shù)雜志》(Chahal，PS.，Chahal，D.S.，and Andre，G.，J.Ferment.Bioengng)，1992，74126-128所指出的液態(tài)發(fā)酵存在著對培養(yǎng)基要求高，酶系不齊全和易造成環(huán)境污染等問題。而利用天然秸稈如麥草、玉米秸稈等，固體發(fā)酵纖維素酶得率低，并且所產(chǎn)纖維素酶的β葡萄糖苷酶活也很低。為了提高纖維素酶中的β葡萄糖苷酶活，在《酶與微生物技術(shù)》(Zhao，X.，et al.，Enzyme Microb.Technol.)，1993，1562-68一文中報道了在纖維素酶的使用中，需要復(fù)配β葡萄糖苷酶活，或在纖維素酶的發(fā)酵過程中混合接種高產(chǎn)β葡萄糖苷酶活的菌株，但這樣就增加了纖維素酶的生產(chǎn)成本，所以目前難于推廣。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的酶活低、組分不全、生產(chǎn)成本高、易染菌、生產(chǎn)不穩(wěn)定的缺點；利用密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器，提供一種新的、廉價的汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以汽爆處理的秸稈為主要培養(yǎng)料，按一定配方制成發(fā)酵用培養(yǎng)料，以斜臥青霉(Penicillium decumbens JUAIO)為菌種，用密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器生產(chǎn)纖維素酶，所產(chǎn)生的纖維素酶酶活較高，組分齊全，濾紙酶活為53.0 IU/g干曲，β葡萄糖苷酶活51.1 IU/g干曲，生產(chǎn)穩(wěn)定。而纖維素酶的浸提和純化仍采用傳統(tǒng)的酶提取純化的方法，對于酶泥采用真空冷凝干燥。
本發(fā)明方法以重量百分比計，向發(fā)酵原料為80-95％經(jīng)汽爆處理的秸稈和5-20％麩皮中加入無機鹽溶液，制成發(fā)酵培養(yǎng)料，其中，固液比以W/V計為1∶2-2.5，無機鹽溶液含(NH4)2SO41.5％，MgSO40.6％，KH2PO40.3％；調(diào)pH值5-6；滅菌，接液體菌種，將發(fā)酵培養(yǎng)料送入密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器中進行固態(tài)發(fā)酵；向固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中加入pH值4.8的乙酸緩沖溶液浸提一段時間后，離心除去固形物，上清液為所得高活性纖維素酶。
所述的汽爆處理是將秸稈粗切至20-30mm長，再裝入汽爆罐，于1.3-1.7Mpa的蒸汽壓力下維壓5-10分鐘，瞬間減壓釋放即得汽爆料；所述的秸稈是指麥草、稻草或玉米稈；所述的以密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵是指在0.05Mpa-0.25Mpa壓力范圍內(nèi)，以15-60分鐘為周期進行周期充壓和瀉壓，培養(yǎng)溫度28℃-32℃，發(fā)酵周期3.5-4.5天；所述的液體菌種為以10％麩皮浸汁(已滅菌)為培養(yǎng)基，接入斜臥青霉試管斜面種子30℃發(fā)酵24小時而成液體種子，接入量為相對于固體料重的7-12％；滅菌方法為常規(guī)蒸汽滅菌方式。
本發(fā)明所用壓力脈動固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器是一環(huán)行耐壓容器。本發(fā)明纖維素酶的浸提和純化可采用傳統(tǒng)的酶提取純化的方法，對于酶泥采用真空冷凝干燥。其是將95％乙醇和浸提酶液按1∶1比例混合，靜止5小時后，壓濾得濾餅；濾餅在50000-90000Pa下，35℃干燥24小時后，粉碎至60目。
本發(fā)明纖維素酶活測定按照國際化學(xué)會制定的方法。
汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性纖維素酶的主要條件結(jié)論(1)本發(fā)明采用的蒸氣爆碎處理技術(shù)，使秸稈中的半纖維素和木質(zhì)素部分降解，以此利用汽爆秸稈作為纖維素酶固態(tài)發(fā)酵的主要原料，它既是營養(yǎng)物，膨松劑，又是纖維素酶的很好誘導(dǎo)物，因此，用汽爆秸稈作底物固態(tài)發(fā)酵與直接用碎麥草作底物相比，不僅使濾紙酶提高了2-5倍，而且使β葡萄糖苷酶活接近了FPA水平，免去了混合培養(yǎng)的麻煩和復(fù)配纖維素酶中的β葡萄糖苷酶成本，這樣大大降低了高活性纖維素酶生產(chǎn)成本。
(2)密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵方式不僅提高了纖維素酶的酶活，而且大大降低了染菌的幾率，提高了固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性(3)不同纖維質(zhì)原料對產(chǎn)酶的影響(培養(yǎng)箱發(fā)酵)見表1。
表.1不同纖維質(zhì)原料對產(chǎn)酶的影響
(4)不同固態(tài)發(fā)酵方式對產(chǎn)酶的影響見表2。
表2不同固態(tài)發(fā)酵方式對產(chǎn)酶的影響
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述。


圖1.本發(fā)明的工藝流程圖。
實施例1汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶1.汽爆麥草將已粗切至約25mm長的麥草80kg裝入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.5Mpa，維壓10分鐘，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2.發(fā)酵用培養(yǎng)料的制備及滅菌向發(fā)酵原料為90％汽爆處理的麥草和10％麩皮中加入無機鹽溶液，制成發(fā)酵培養(yǎng)料，其中，固液比為1∶2.5，無機鹽溶液含(NH4)2SO41.5％，MgSO40.6％，KH2PO40.3％，pH值為5左右。將發(fā)酵培養(yǎng)料分成幾份用白棉布和紙包好放在大型滅菌鍋中，在0.1Mpa壓力下維持50分鐘滅菌。
3.接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)料打散，在無菌室中接入已經(jīng)準備好的斜臥青霉液體種子(以10％麩皮浸汁為培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵24小時而成)，接種量為相對于固體料重的7％，混勻，裝入已滅菌的不銹鋼盤中，送入密閉式壓力脈動發(fā)酵反應(yīng)器中進行固態(tài)發(fā)酵，在0.05Mpa-0.20Mpa壓力范圍內(nèi)，以15分鐘為周期，進行周期充壓和瀉壓，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵周期4天。
4.酶液的制備向固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中加入相對于發(fā)酵產(chǎn)物重20倍的pH值4.8的乙酸緩沖溶液浸提5小時，離心除去固形物，上清液為纖維素酶液。
汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活為59.7 IU/g干曲，β-葡萄糖苷酶活56.2 IU/g干曲。
實施例2汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶1.汽爆麥草將已粗切至約25mm長的麥草80kg裝入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.7Mpa，維壓5分鐘，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2.發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌向發(fā)酵原料為80％汽爆處理的麥草和20％麩皮中加入無機鹽溶液，制成發(fā)酵培養(yǎng)料，其中，固液比1∶2，無機鹽溶液含(NH4)2SO41.5％，MgSO40.6％，KH2PO40.3％，pH值為6左右。將發(fā)酵培養(yǎng)料分成幾份用白棉布和紙包好放在大型滅菌鍋中，在0.1Mpa壓力下維持50分鐘滅菌。
3.接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)料打散，在無菌室中接入已經(jīng)準備好的斜臥青霉液體種子(以10％麩皮浸汁為培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵24小時而成)，接種量為相對于固體料重的10％，混勻，裝入已滅菌的不銹鋼盤中，送入密閉式壓力脈動發(fā)酵反應(yīng)器中進行固態(tài)發(fā)酵，在0.05Mpa-0.15Mpa壓力范圍內(nèi)，以30分鐘為周期，進行周期充壓和瀉壓，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵周期4天。
4.酶液的制備向固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中加入相對于發(fā)酵產(chǎn)物重20倍的pH值4.8的乙酸緩沖液浸提5小時，離心除去固形物，上清液為纖維素酶液。
汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活為59.7 IU/g干曲，β-葡萄糖苷酶活56.2 IU/g干曲。
實施例3汽爆玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶1.汽爆玉米秸稈將已粗切至約30mm長的玉米秸稈80kg裝入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.7Mpa，維壓5分鐘，打開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆玉米秸稈。
2.發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌向發(fā)酵原料為80％汽爆處理的玉米秸稈和20％麩皮中加入無機鹽溶液，制成發(fā)酵培養(yǎng)料，其中，固液比1∶2，無機鹽溶液含(NH4)2SO41.5％，MgSO40.6％，KH2PO40.3％，pH值為5.5左右。將發(fā)酵培養(yǎng)料分成幾份用白棉布和報紙包好放在大型滅菌鍋中，在0.1Mpa壓力下維持50分鐘滅菌。
3.接種及裝盤發(fā)酵將已滅菌的培養(yǎng)基打散，在無菌室中接入已經(jīng)準備好的斜臥青霉液體種子(以10％麩皮浸汁為培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵24小時而成)，接種量為相對于固體料重的12％，混勻，裝入已滅菌的不銹鋼盤中，送入密閉式壓力脈動發(fā)酵反應(yīng)器中進行固態(tài)發(fā)酵，在0.05Mpa-0.15Mpa壓力范圍內(nèi)，以60分鐘為周期，進行周期充壓和瀉壓，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵周期4天。
4.酶液的制備向固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中加入相對于發(fā)酵產(chǎn)物重20倍的pH值4.8的乙酸緩沖液浸提5小時，離心除去固形物，上清液為纖維素酶液。
汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活為62.0 IU/g干曲，β-葡萄糖苷酶活58.6 IU/g干曲。
權(quán)利要求
1.一種汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法，其特征在于該方法以重量百分比計，向發(fā)酵原料為80-95％經(jīng)汽爆處理的秸稈和5-20％麩皮中加入無機鹽溶液，制成發(fā)酵培養(yǎng)料，其中，固液比以W/V計為1∶2-2.5，無機鹽溶液含(NH4)2SO41.5％，MgSO40.6％，KH2PO40.3％，調(diào)pH值5-6；滅菌，接液體菌種，將發(fā)酵培養(yǎng)料送入密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器中進行固態(tài)發(fā)酵；向固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中加入pH值4.8的乙酸緩沖溶液浸提一段時間后，離心除去固形物，上清液為所得高活性纖維素酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的汽爆處理是指在汽爆罐中裝入粗切的秸稈，于1.3-1.7Mpa的蒸汽壓力下維壓5-10分鐘，瞬間減壓釋放。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的秸稈是指麥草、稻草或玉米稈。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的菌種為斜臥青霉。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的以密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵是指在0.05Mpa-0.25Mpa壓力范圍內(nèi)，以15-60分鐘為周期進行周期充壓和瀉壓，培養(yǎng)溫度28℃-32℃，發(fā)酵周期3.5-4.5天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的液體種子接種量為相對于固體料重的7-12％。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用微生物生產(chǎn)纖維素酶的技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高活性纖維素酶的方法。向發(fā)酵原料為80-95%經(jīng)汽爆處理的秸稈和5-20%麩皮中加入無機鹽溶液,其中,固液比以W/V計為1∶2-2.5,調(diào)pH值5-6;滅菌,接液體菌種,用密閉式壓力脈動固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器發(fā)酵;浸提發(fā)酵產(chǎn)物,上清液為高活性纖維素酶。本發(fā)明可生產(chǎn)高活性組分齊全的纖維素酶;其纖維素酶的β葡萄糖苷酶活接近于濾紙酶水平。
文檔編號C12N1/22GK1339585SQ0012382
公開日2002年3月13日 申請日期2000年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月21日
發(fā)明者陳洪章, 梁淑蘭, 劉健, 田忠厚, 李佐虎 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所