專利名稱：Rim2蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Rim2蛋白，它是Rim的一種新的同種型，即該蛋白能與低分子量G蛋白R(shí)ab3相互作用，并提出它起著Rab3依賴性突觸小泡融合調(diào)節(jié)劑作用，并且與GDP／GTP交換因子(GEFII；一種cAMP傳感物)起特異性相互作用。更具體地說，本發(fā)明涉及胞內(nèi)小泡運(yùn)輸和分泌機(jī)制的闡述，涉及可用來診斷與內(nèi)分泌有關(guān)的疾病或神經(jīng)病并能用來開發(fā)預(yù)防和治療這些疾病的制劑的新的Rim2蛋白，編碼Rim2的基因以及針對(duì)Rim2蛋白的抗體。
Rim2被認(rèn)為是小泡融合的調(diào)控因子。在本發(fā)明期間發(fā)現(xiàn)該蛋白主要表達(dá)在內(nèi)分泌組織和內(nèi)分泌細(xì)胞系和神經(jīng)內(nèi)分泌衍生的細(xì)胞系中。認(rèn)為GTP／Rab3／GEFII／Rim復(fù)合物以依賴于cAMP和不依賴于蛋白激酶A(PKA)的方式，參與神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞胞吐作用的調(diào)節(jié)。
具有單位膜閉合結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))之間的物質(zhì)運(yùn)輸通過胞內(nèi)小泡運(yùn)輸來進(jìn)行。在內(nèi)分泌細(xì)胞(包括胰β細(xì)胞和垂體細(xì)胞)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)收到核糖體處合成的肽／蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)以小泡形式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸，這些小泡通過高爾基體轉(zhuǎn)化成分泌性小泡并運(yùn)輸至細(xì)胞膜，通過與細(xì)胞膜融合的步驟被釋放出細(xì)胞。在神經(jīng)元中，突觸小泡的含神經(jīng)遞質(zhì)的前體在高爾基體中形成，通過微管沿軸突運(yùn)輸，并儲(chǔ)藏在突觸中。突觸前膜的去極化引起小泡與突觸前膜融合，從而釋放出神經(jīng)遞質(zhì)?；谛∨菖c細(xì)胞膜融合的這種分泌作用稱為胞吐作用。
相反，當(dāng)胞外物質(zhì)如激素(包括細(xì)胞生長因子)與細(xì)胞膜結(jié)合后，形成的復(fù)合物內(nèi)陷入細(xì)胞中形成內(nèi)體。這種攝取環(huán)境物質(zhì)的作用稱為胞吞作用。
小泡的形成，例如通過出芽(通常見于胞吐和胞吞中)、對(duì)接和融合(在它們的運(yùn)輸和與其它膜系統(tǒng)結(jié)合過程中所觀察到的現(xiàn)象)，受GTP-結(jié)合的低分子量蛋白(稱為G蛋白)的調(diào)節(jié)。30種以上的此類蛋白是已知的。也歸類于Rab家族的此組蛋白調(diào)節(jié)著胞內(nèi)小泡運(yùn)輸系統(tǒng)。
關(guān)于胞內(nèi)小泡運(yùn)輸系統(tǒng)，目前已經(jīng)知道，當(dāng)Rab蛋白以結(jié)合鳥嘌呤核苷酸二磷酸(GDP)形式出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，由于具有GEF活性的蛋白作用于Rab蛋白并將其轉(zhuǎn)變成結(jié)合GTP的Rab蛋白，GTP與該蛋白結(jié)合形成GTP-Rab復(fù)合物，進(jìn)而再結(jié)合于膜上對(duì)應(yīng)的靶蛋白，結(jié)果引起出芽、對(duì)接和融合。
刺激-分泌的偶聯(lián)在包括神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞的許多細(xì)胞類型中所見的胞吐中起重要作用[J．E．Rothman，Nature 37255(1994)；T．C．Sudhof，Nature 375645(1995)]盡管胞內(nèi)Ca2+濃度的升高在胞吐的調(diào)節(jié)中很重要，但是也知道其它信號(hào)起著重要的作用。已知cAMP(環(huán)腺苷酸-3′，5′-單磷酸)／PKA(依賴于cAMP的蛋白激酶A)信號(hào)傳導(dǎo)通道調(diào)節(jié)許多神經(jīng)元、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞中的胞吐作用。尤其是，認(rèn)為cAMP通過增加腦中的神經(jīng)遞質(zhì)釋放來介導(dǎo)長期強(qiáng)化[R．D．Hawkins等人Ann．Rev．Neurosci．16625(1993)；G．Lonart等人，Neuron 211141(1998)]。cAMP還調(diào)節(jié)導(dǎo)致胰β細(xì)胞釋放胰島素以及腮腺腺泡細(xì)胞釋放淀粉酶的胞吐作用[P．M．Jones和S．J．Persaud，Endocrine．Rev．19429(1998)；E．Renstrom，等人，J．Physiol．502105(1997)；K．Yoshimura，Biochim．Biophys．Acta 1402171(1998)]。
除了在與胞吐過程有關(guān)的調(diào)控蛋白的依賴于PKA的磷酸化中的作用外，已知cAMP還直接作用于神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中的胞吐機(jī)制[G．Lonart等人，Neuron211141(1998)；E．Renstrom等人，J．Physiol．502105(1997)；K．Yoshimura，Biochim．Biophys．Acta 1402171(1998)]。
在用酵母雙雜交篩選(即一種用來檢測(cè)酵母細(xì)胞中兩個(gè)蛋白之間相互作用的方法)搜索直接偶聯(lián)磺酰脲受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子(胰β細(xì)胞ATP-敏感性K+(KATP)通道的一個(gè)組分[N．Inagaki等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91，2679(1994)])期間，鑒定到一個(gè)cAMP傳感蛋白(稱為“CAMPS”)，發(fā)現(xiàn)該蛋白有兩個(gè)推定的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)普雷克底物蛋白(Pleckstrin)同源結(jié)構(gòu)域(PH結(jié)構(gòu)域)，以及一個(gè)鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)同源結(jié)構(gòu)域。
在此研究期間，兩個(gè)研究小組獨(dú)立地報(bào)道了激活Rap1(小G結(jié)合蛋白的一個(gè)成員)的cAMP結(jié)合蛋白[J．de Rooiji等人，Nature 396474(1998)；H．Kawasaki等人，Science 2822275(1998)]，并且偶然揭示CAMPS是cAMP-GEFII的小鼠同系物[H．Kawasaki等人，Science 2822275(1998)]。
盡管胞內(nèi)小泡運(yùn)輸系統(tǒng)的機(jī)制已經(jīng)逐漸被闡明，但是它們的大部分仍是未知的。為了理解該機(jī)制，需要有進(jìn)一步的進(jìn)展，以便為涉及神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞的各種疾病提供診斷劑或治療劑。
與以前cAMP-GEFII中僅有一個(gè)cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的提法不同，本發(fā)明者的研究提示，根據(jù)cAMP-GEFII序列和PKA的調(diào)控亞基的序列對(duì)比，它存在兩個(gè)推定的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cAMP-A和cAMP-B)。


圖1顯示了cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)比。圖中示出了cAMP-GEFII的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域A和B(分別為cAMP-A和cAMP-B)以及PKA調(diào)控亞基Iα的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域A和B(分別為RIα-A和RIα-B)。不同cAMP-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的不變的殘基用黑框表示。
如圖2所示，谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-cAMP-A融合蛋白以約10μM的解離常數(shù)(Kd)與[3H]cAMP結(jié)合，而[3H]cAMP與GST-cAMP-B融合蛋白的結(jié)合在相同條件下卻不明顯。
圖2顯示了cAMP與cAMP-A的結(jié)合。將GST-cAMP-A(實(shí)心圓圈)或GST-PKARIα(空心圓圈)與不同濃度的[3H]cAMP(0至50μM)一起培育。cAMP-A或PKA RIα的數(shù)據(jù)相對(duì)于最大的cAMP結(jié)合活性作標(biāo)準(zhǔn)化。cAMP和PKA RIα的Kd數(shù)值分別為10．0±2．3μM和23．7±0．6nM。
在cAMP-B結(jié)構(gòu)域中，最初為谷氨酸(Glu)的氨基酸殘基423被賴氨酸(Lys)代替。該谷氨酸殘基對(duì)于cAMP結(jié)合是很重要的?？紤]到具有等效突變(E-200-K)的PKA調(diào)節(jié)亞基比野生型的解離更迅速，因此cAMP-B也可能迅速地解離cAMP。因此，cAMP可能能與cAMP-B結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
由于CAMPUS的靶分子cAMP-GEFII的鑒定起著顯示其生理作用的作用，因此本發(fā)明者試圖利用在MIN6 cDNA文庫上的酵母雙雜交篩選(YTH)方法來尋找與cAMP-GEFII相互作用的分子(見“用YTH方法鑒定相互作用的分子”)。
本發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)cAMP-GEFII能與Rim(一種與Rab3特異性相互作用的分子，即Rab3-相互作用型分子；后稱“Rim1”)的一種新的同種型(本發(fā)明者命名為“Rim2”)相互作用。Rim1蛋白是小G蛋白R(shí)ab3的推定的效應(yīng)物，有人提出它起著突觸小泡融合的依賴于Rab3的調(diào)節(jié)劑作用[Y．Wang等人，Nature 388593(1997)]。
本發(fā)明者測(cè)序了新的全長Rim2蛋白，它由1590個(gè)氨基酸殘基組成，發(fā)現(xiàn)其與大鼠Rim1有61．6％的相同性。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)鋅指、PDZ和兩個(gè)C2結(jié)構(gòu)域在Rim1和Rim2之間是高度保守的。
根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明者提供了一種具有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列相對(duì)于序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代、插入或增加，且該蛋白質(zhì)具有與GDP／GTP交換因子II相互作用的性質(zhì)。
本發(fā)明還提供編碼下列蛋白(1)或(2)的小鼠基因(1)具有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(2)具有相對(duì)于上述氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代、插入或增加的氨基酸序列、且具有與GDP／GTP交換因子II相互作用性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
在本說明書中，“一個(gè)或多個(gè)”氨基酸殘基通常為數(shù)個(gè)(例如3或4個(gè))到10個(gè)殘基。
本發(fā)明還提供具有序列表中SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA，該DNA是對(duì)應(yīng)于具有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的上述蛋白質(zhì)的cDNA。
本發(fā)明還提供具有相對(duì)于序列表中SEQ ID NO2所示核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、替代、插入或增加的核苷酸序列、且編碼上述任何一種蛋白質(zhì)的DNA。在這里，“一個(gè)或多個(gè)”核苷酸通常是數(shù)個(gè)(例如3或4個(gè))至10個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用關(guān)于遺傳密碼簡并性的熟知的知識(shí)很容易制得具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、替代、插入或增加各種這些核苷酸序列。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供具有上述任一DNA或具有序列表中SEQ ID NO2所示核苷酸序列之編碼區(qū)域的核苷酸序列的DNA。
本發(fā)明還提供由上述任一DNA之一部分組成的DNA片段。
本發(fā)明還提供一種探針，該探針包含的DNA能與由上述任一核苷酸序列組成的DNA雜交。
本發(fā)明還提供一個(gè)引物DNA片段，它由上述任一核苷酸序列的部分序列組成。
本發(fā)明還提供一個(gè)具有上述任一DNA的重組載體。
本發(fā)明還提供針對(duì)上述任一蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體。
本發(fā)明還提供包含上述任一探針或抗體的人用診斷試劑。該診斷試劑可用于以下這些疾病的測(cè)試，例如包括垂體、下丘腦、胰β細(xì)胞和腮腺等分泌性系統(tǒng)中的分泌失調(diào)，或用于腦-神經(jīng)系統(tǒng)疾病的測(cè)試。
本發(fā)明還提供針對(duì)上述任一疾病的治療制劑。
圖1描述了cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)比。
圖2顯示了cAMP與cAMP-A的結(jié)合。
圖3描述了Rim1和Rim2之間在鋅指、PDZ和C2結(jié)構(gòu)域中氨基酸相同性的比較結(jié)果。
圖4顯示了表明cAMP-GEFII與Rim1或Rim2之間相互作用的免疫印跡的結(jié)果。
圖5顯示了在各種大鼠組織和內(nèi)分泌細(xì)胞系以及神經(jīng)內(nèi)分泌衍生的細(xì)胞系中Northern印跡分析cAMP-GEFII、Rim1和Rim2的結(jié)果。
圖6是表明Rim1和Rim2在小鼠腦和垂體中的位置的原位雜交結(jié)果。
圖7顯示了酵母雙雜交試驗(yàn)的結(jié)果。
圖8描述了表明Rab3A與Rim1或Rim2體外相互作用的免疫印跡結(jié)果。
圖9顯示了高K+誘導(dǎo)共轉(zhuǎn)染GH和cAMP-GEFII的PC12細(xì)胞分泌GH的時(shí)程。
圖10顯示了毛喉素對(duì)于轉(zhuǎn)染的PC細(xì)胞分泌GH的影響。
圖11顯示了毛喉素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了各種突變型cAMP-GEFII的PC12細(xì)胞分泌GH。
圖12顯示了H-89對(duì)于毛喉素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了cAMP-GEFII的PC12細(xì)胞分泌GH的影響。
圖13示意性地描述了依賴于cAMP的胞吐作用模型。
利用重組DNA技術(shù)能提供各種突變體。首先，可以通過不同的化學(xué)和／或酶促方法將突變引入DNA克隆片段中，然后對(duì)這樣獲得的突變型DNA進(jìn)行測(cè)序，以選擇具有預(yù)期優(yōu)點(diǎn)的特定突變體。該方法能系統(tǒng)性地制備不同的突變體而不管它們的表型如何。制備突變型克隆DNA的常用方法如下。
1．在一個(gè)寡核苷酸的幫助下，可在給定的DNA序列中直接進(jìn)行替代、缺失、插入或增加。該方法能將多個(gè)突變引入給定DNA的小區(qū)域中。
2．利用較長的寡核苷酸，可以合成所需的基因。
3．利用區(qū)域特異性誘變技術(shù)，可以將所需的突變引入大(1-3kb)的DNA區(qū)域內(nèi)。
4．DNA的接頭分區(qū)誘變是適合將一簇點(diǎn)突變引入較小(4-10bp)的DNA區(qū)域內(nèi)的方法。
5．PCR也被用作直接引入突變的方法。制備能表達(dá)包括上述方法所得不同突變的所需基因的質(zhì)?；蜉d體的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。即，用限制性酶和連接酶的組合將攜帶所需基因的DNA插入表達(dá)載體DNA中，很容易構(gòu)建攜帶所需基因的重組質(zhì)粒。然后將這樣獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入不同細(xì)胞中以轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。可采用的細(xì)胞范圍包括原核細(xì)胞如大腸桿菌，到酵母、昆蟲、植物和動(dòng)物細(xì)胞。重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過氯化鈣方法或電穿孔來實(shí)現(xiàn)。氯化鈣方法提供了有效的轉(zhuǎn)化而無需任何特殊的裝置。為了獲得較高的效率，建議采用電穿孔。通常在動(dòng)物細(xì)胞系上進(jìn)行的轉(zhuǎn)染已知有兩類，即瞬時(shí)和永久型。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，培育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞1至4天，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，然后收獲細(xì)胞分析它們的DNA。或者，在許多研究中，產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞系，其中將轉(zhuǎn)染的基因摻入染色體中。轉(zhuǎn)染方法的例子包括磷酸鈣法、電穿孔以及脂質(zhì)融合方法。用本領(lǐng)域熟知的方法很容易制得針對(duì)本發(fā)明的Rim2基因所編碼的蛋白質(zhì)(多肽)的多克隆和單克隆抗體、或它們的片段和類似物。獲得的抗體可用作實(shí)驗(yàn)室制劑以及診斷與Rim2基因有關(guān)的疾病的制劑。獲得的抗體還可用來制備抗體柱，用于免疫沉淀以及用于Western印跡鑒定抗原。
以毫克規(guī)模制得針對(duì)本發(fā)明Rim2基因編碼的蛋白質(zhì)的單克隆抗體的通用方法如下用抗原蛋白接種小鼠進(jìn)行免疫。從表現(xiàn)出足夠抗體滴度的小鼠中取出脾臟。分離脾細(xì)胞，使所選B細(xì)胞與B細(xì)胞來源的骨髓瘤細(xì)胞融合形成分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞。用親和層析、離子交換或凝膠過濾等方法從培養(yǎng)液中純化雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。本發(fā)明的多克隆抗體可用以下的常規(guī)方法制得用家兔、馬、小鼠或豚鼠作為受免疫動(dòng)物，按照本領(lǐng)域已知的一個(gè)方案接種抗原蛋白來免疫動(dòng)物，然后從收集的血清中分離出IgG等。為了評(píng)價(jià)cAMP-GEFII與Rim2之間相互作用的特異性，本發(fā)明者評(píng)價(jià)了FLAG標(biāo)記的cAMP-GEFII蛋白與固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim2融合蛋白之間的結(jié)合(見“Rim2和cAMP-GEFII之間相互作用的研究I”)。
簡言之，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染了FLAG標(biāo)記的cAMP-GEFII的COS-1細(xì)胞的裂解液、MIN6細(xì)胞裂解液或小鼠腦勻漿裂解液與GST-Riml、GST-Rim2或單獨(dú)GST的結(jié)合。分別用抗-FLAG抗體(圖4左側(cè))或抗cAMP-GEFII抗體(圖4右側(cè))通過免疫印跡檢測(cè)cAMP。這些結(jié)果表明，cAMP-GEFII蛋白與GST-Rim2蛋白相互作用。同樣，GST-Rim1蛋白也結(jié)合小鼠腦勻漿中的cAMP-GEFII(見“Rim1與cAMP-GEFII相互作用的研究”)(圖4，右側(cè))。這些結(jié)果確認(rèn)cAMP-GEFII與Rim1以及Rim2相互作用。
圖5顯示了在各種大鼠組織以及內(nèi)分泌細(xì)胞系和神經(jīng)內(nèi)分泌衍生細(xì)胞系中用Northern印跡分析cAMP-GEFII、Rim1和Rim2的結(jié)果(見“大鼠組織中的Northern印跡”)。采用各組織和細(xì)胞系中10微克總RNA(除胰島用5微克外)標(biāo)本。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行雜交和洗滌。在大腦和小腦的Rim2 mRNA印跡分析中所見的微弱的信號(hào)是由于與所用的Rim1 cDNA探針交叉雜交的緣故。圖5表明Rim2 mRNA主要在內(nèi)分泌組織以及內(nèi)分泌細(xì)胞系和神經(jīng)內(nèi)分泌衍生細(xì)胞系中表達(dá)，包括垂體、胰島郎格漢斯細(xì)胞、MIN6細(xì)胞和PC12細(xì)胞。通過反轉(zhuǎn)錄酶-PCR，在腦中檢測(cè)到Rim2mRNA(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，通過類似的分析，發(fā)現(xiàn)Rim1 mRNA在大腦、小腦和垂體中表達(dá)。
Rim1的主要轉(zhuǎn)錄物有6．4kb，Rim2的主要轉(zhuǎn)錄物有7．2kb和5．4kb。還發(fā)現(xiàn)幾個(gè)較小的轉(zhuǎn)錄物，它們可能由于可變剪接而產(chǎn)生的。
cAMP-GEFII mRNA通常在已知發(fā)生受到調(diào)節(jié)的胞吐作用的組織和細(xì)胞系中與Rim1或Rim2共同表達(dá)。圖6描述了表明Rim1和Rim2在小鼠腦和垂體中位置的原位雜交的結(jié)果。在該圖中(a)cAMP-GEFII；(b)Rim1；(c)Rim2；(d)垂體。比例柱對(duì)應(yīng)于1毫米。縮寫Cb=小腦；Cp=尾狀核，Cx=皮質(zhì)，Hi=海馬，Ob=嗅球，Po=腦橋，Th=丘腦。
Rim2 mRNA表達(dá)僅見于小腦皮質(zhì)，而Rim1 mRNA則在大腦皮質(zhì)、海馬(尤其是CA3和齒狀腦回)、嗅球和小腦皮質(zhì)中表達(dá)(見“小鼠腦中的原位雜交”)。cAMP-GEFII的分布與腦中Rim1 mRNA的分布大部分重疊。經(jīng)確認(rèn)，Rim2 mRNA和cAMP-GEFII mRNA在垂體前葉中共同表達(dá)。
已提出Rim1是一種Rab3效應(yīng)物，一種低分子量G蛋白[Y．Wang，等人，Nature，388593(1997)]。利用酵母雙雜交試驗(yàn)(見“Rim2和Rab3A之間相互作用的研究”)，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)Rim2與Rim1一樣，和活性Rab3A(Q81L)相互作用(圖7)。圖7顯示了酵母雙雜交試驗(yàn)的結(jié)果。通過液體β-半乳糖苷酶活性的反式激活，測(cè)定了各種組合中的Rim1、Rim2或rabphilin3與野生型Rab3A或組成型活性Rab3A(Q81L)。
另外，固定的GST-Rim2只和Rab3A的GTPγS-結(jié)合形式結(jié)合(圖8)。圖8顯示Rab3A與Rim1或Rim2之間在體內(nèi)的相互作用，該結(jié)果是通過使Rab3A的GTPγS-或GDPγS-結(jié)合形式分別與固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim1(殘基1-201)和GST-Rim2(殘基1-345)一起培育而獲得的。以抗Rab3A抗體通過免疫印跡檢測(cè)Rab3A。這些結(jié)果表明Rim2和Rim1一樣，與Rab3A的GTP-激活形式結(jié)合。
cAMP-GEFII與Rim2蛋白的相互作用強(qiáng)烈提示，cAMP-GEFII參與調(diào)控的胞吐作用。為了測(cè)定其功能作用，本發(fā)明者測(cè)定了cAMP對(duì)于用生長激素(GH)和cAMP-GEFII共同轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞中不依賴于Ca2+的分泌的影響(見“轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞分泌GH的研究”)。
由于PC12細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)Rim2但不表達(dá)cAMP-GEFII，因此外源性引入的cAMP-GEFII可能與內(nèi)源的Rim2形成一種復(fù)合物。
圖9顯示了用GH和cAMP-GEFII共轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞受高K+誘導(dǎo)分泌GH的時(shí)程。
圖10顯示了毛喉素對(duì)于轉(zhuǎn)染的PC細(xì)胞分泌GH的影響。在與低K+(4．7毫摩爾)或高K+(60毫摩爾)溶液一起培育前10分鐘，加入毛喉素(50微摩爾)。符號(hào)的意義如下對(duì)于基礎(chǔ)性(低K+誘導(dǎo))分泌cAMP-GEFII-轉(zhuǎn)染子(實(shí)心三角)β-半乳糖苷酶-轉(zhuǎn)染子(對(duì)照)(空心圓圈)；高K+誘導(dǎo)的分泌cAMP-GEFII-轉(zhuǎn)染子(實(shí)心圓圈)；β-半乳糖苷酶-轉(zhuǎn)染子(對(duì)照)(空心圓圈)。數(shù)值代表釋放入培養(yǎng)液的GH量相對(duì)于細(xì)胞總GH量的百分?jǐn)?shù)。
如圖9所示，在共同轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞中，與對(duì)照相比，cAMP-GEFII沒有改變共同轉(zhuǎn)染的GH依賴于Ca2+(60毫摩爾K+)的分泌，但顯著增強(qiáng)了毛喉素(50微摩爾)誘導(dǎo)的依賴于Ca2+的GH分泌(
圖10)。毛喉素主要作用于腺苷酸環(huán)化酶，起提高細(xì)胞中cAMP水平的作用。cAMP-GEFII也增強(qiáng)了8-Br-cAMP(1毫摩爾)誘導(dǎo)的、依賴于Ca2+的GH分泌(cAMP-GEFII-轉(zhuǎn)染子，34．9±1．3％；對(duì)照，25．1±1．8％，n=9，p＜0．001)。
圖11顯示轉(zhuǎn)染了各種突變型cAMP-GEFII的PC12細(xì)胞受毛喉素誘導(dǎo)的GH分泌，其中對(duì)于每個(gè)突變型cAMP-GEFII，在15分鐘培育期間毛喉素(50微摩爾)誘導(dǎo)的GH分泌(在高K+存在下)高于基礎(chǔ)水平的增量，被表示成相對(duì)于野生型cAMP-GEFII(100％)的百分?jǐn)?shù)。在該圖中，WT=野生型cAMP-GEFII，T810A=突變型cAMP-GEFII(T810A)；G114E，G422D=雙突變CMAP-GEFII(G114E，G422D)。
在突變型cAMP-GEFII(T810A)中，毛喉素誘導(dǎo)的GH分泌不受影響，其中通過其一個(gè)氨基酸置換，一個(gè)潛在的PKA磷酸化位點(diǎn)被破壞(
圖11)。在兩個(gè)cAMP結(jié)合位點(diǎn)被破壞的突變型cAMP-GEFII(G114E，G422D)中，毛喉素誘導(dǎo)的GH分泌減少至野生型中的大約40％。
這些結(jié)果表明，cAMP通過結(jié)合cAMP-GEFII促進(jìn)了依賴于Ca2+的GH分泌，而不涉及其被PKA磷酸化。
圖12顯示了H-89對(duì)于毛喉素誘導(dǎo)cAMP-GEFII轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞分泌GH的影響。在毛喉素(50微摩爾)處理前10分鐘在培育緩沖液中加入H-89(10微摩爾)。H-89(10微摩爾)的處理減少了cAMP-GEFII轉(zhuǎn)染的和β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞中高K+誘導(dǎo)的GH分泌。數(shù)據(jù)從3-5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(A-D)獲得。這些數(shù)值是平均值±SEM(p＜0．01)。
重要的是，經(jīng)cAMP-GEFII轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞受PKA抑制劑H-89處理后的毛喉素誘導(dǎo)的不依賴于Ca2+的GH分泌明顯高于對(duì)照細(xì)胞。這表明cAMP-GFEII介導(dǎo)了依賴于cAMP、而不依賴于PKA的胞吐作用。
為了確認(rèn)cAMP-GEFII的生理相關(guān)性，本發(fā)明者調(diào)查了內(nèi)源性cAMP-GEFII在分泌中的作用。在胰β細(xì)胞的胰島素分泌中，據(jù)稱cAMP通過依賴于PKA以及不依賴于PKA的機(jī)制刺激胞吐作用[M．Prentki，F(xiàn)．M．Matschinsky，Phsiol．Rev．671185(1987)／P．M．Jones，S．J．Persaund，Endocrine．Rev．19429(1998)]。
在16．7毫摩爾高濃度葡萄糖條件下，經(jīng)針對(duì)cAMP-GEFII的反義寡核苷酸處理過的MIN6細(xì)胞受8-Br-cAMP誘導(dǎo)的胰島素分泌明顯減少(為對(duì)照寡核苷酸處理過的MIN6細(xì)胞的分泌的87．5±2．3％，n=27，p＜0．005)(見“cAMP-GEFII在依賴于cAMP的胞吐作用中的作用研究”)，這提示cAMP-GEFII參與了天然細(xì)胞中依賴于cAMP的胞吐作用。
Rab3與胞吐作用的最后步驟有關(guān)。結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白rabphilin3[H．Shirataki等人，Mol．Cell．Biol．13，2061(1993)]和Rim1均與Rab3A結(jié)合，提示多個(gè)Rab3A效應(yīng)物可在觸發(fā)小泡與質(zhì)膜對(duì)接和融合中起作用。
在本發(fā)明的過程中，發(fā)現(xiàn)cAMP傳感物cAMP-GEFII通過與Rab3效應(yīng)物Rim2的相互作用而介導(dǎo)cAMP誘導(dǎo)的、依賴于Ca2+的胞吐作用。
除了在與分泌過程有關(guān)的蛋白質(zhì)的PKA磷酸化中起作用外，以前的研究已經(jīng)提出cAMP可能直接作用于胞吐作用[G．Lonart，等人，Neuron 211141(1998)；E．Renstrom，等人，J．Physiol．502105(1997)；K．Yoshimura等人，Biochim．Biophys．Acta1402171(1998)]。在胰β細(xì)胞中，也提出了cAMP依賴于PKA和不依賴于PKA來刺激胰島素的釋放[E．Renstrom，等人，J．Physiol．502105(1997)]。認(rèn)為cAMP可能直接刺激腮腺腺泡細(xì)胞釋放淀粉酶[G．Lonart，等人，Neuron 211141(1998)]。另外，最近的研究提出cAMP增強(qiáng)腦中的谷氨酸釋放部分是通過直接作用于胞吐機(jī)制[G．Lonart，等人，Neuron 21，1141(1998)]。
然而，盡管rabphilin3和Rim1在腦中的大多數(shù)突觸中是普遍表達(dá)的[C．Li等人，Neuron 13885(1994)]，但是cAMP增強(qiáng)的谷氨酸釋放發(fā)生在海馬CA3區(qū)域而不是CA1區(qū)域的突觸小體中，該發(fā)現(xiàn)與cAMP-GEFII和Rim1主要在CA3中共同表達(dá)相符合。
因此認(rèn)為，除了分泌過程中依賴于PKA的磷酸化外，cAMP還通過直接作用于一些神經(jīng)元以及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞中cAMP-GEFII(一種cAMP傳感物)和Rim(一種Rab3效應(yīng)物)的復(fù)合物以不依賴于PKA的方式促進(jìn)受調(diào)節(jié)的胞吐作用，如
圖13所示。
這些發(fā)現(xiàn)表明本發(fā)明的Rim2也在調(diào)節(jié)神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞的胞吐作用中起重要的作用。
下面將通過參照實(shí)施例表述的本發(fā)明具體程序來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
<CAMPS(cAMP-GEFII)cDNA的測(cè)序>
從小鼠胰島素分泌型細(xì)胞系MIN6制得在載體pVP16中的質(zhì)粒cDNA文庫。用編碼部分大鼠SUR1(氨基酸殘基598-1003)(GenBank登錄號(hào)L40624，胰β細(xì)胞KATP通道的一個(gè)亞基)的DNA片段在質(zhì)粒pBTM116中構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體。
如K．Kotake等人，J．Biol．Chem．27229407(1997)所述的那樣，對(duì)質(zhì)粒MIN6cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選。分離編碼部分CAMPS-一種cAMP傳感物(殘基187-730)的捕食克隆(prey clone)。從λMIN6 cDNA文庫獲得全長小鼠CAMPS cDNA[N．Inagaki等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 912679(1994)]。小鼠CAMPS(cAMP-GEFII)的序列已經(jīng)登錄在Genbakn中，登錄號(hào)為AB021132。
<GST融合蛋白的制備和測(cè)試>
按照生產(chǎn)商說明書，用pGEX-4T-1(Amersham-Pharmacia)將cAMP-A(氨基酸殘基43-153)、cAMP-B(氨基酸殘基357-469)和大鼠PKA調(diào)控亞基(RIα)(全長)表達(dá)成GST-融合蛋白，并純化。如R．A．Steiberg，等人，J．Biol．Chem．2622664(1987)所述的那樣稍作改動(dòng)，進(jìn)行cAMP結(jié)合試驗(yàn)。
簡言之，將GST-融合蛋白(1微克)在冰上在結(jié)合緩沖液(200微升)中培育2小時(shí)，該結(jié)合緩沖液含有各種濃度的[3H]cAMP，50毫摩爾磷酸鉀緩沖液(pH 6．8)、150毫摩爾NaCl，1毫摩爾EDTA，5毫摩爾2-巰基乙醇和0．5毫克／毫升牛血清白蛋白以及有或沒有40毫摩爾未標(biāo)記的cAMP。
<用YTH方法鑒定相互作用的分子>
用全長小鼠cAMP-GEFII cDNA在質(zhì)粒pBTM116中構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體。從質(zhì)粒MIN6 cDNA文庫中分離編碼Rim2部分序列(氨基酸殘基53-863)的捕食克隆。從λMIN6 cDNA文庫獲得Rim2的全長cDNA。
<Rim2與cAMP-GEFII之間相互作用的研究I>
按照“GST融合蛋白的制備和測(cè)試”中所述的方法，將Rim2(氨基酸殘基538-863)表達(dá)成GST融合蛋白并純化。將全長cAMP-GEFII cDNA亞克隆到質(zhì)粒pFLAG-CMV-2(Sigma)中。用LipofectAMINE(“Life Technologies)將所得構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞中。使COS-1細(xì)胞的裂解液和固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim2 4℃培育2小時(shí)。用蒸餾水洗滌如此獲得的復(fù)合物，用SDS-PAGE分離，并用抗FLAG M2抗體作免疫印跡(Sigma)。
<Rim2與cAMP-GEFII之間相互作用的研究II>
使MIN6細(xì)胞的裂解液與GST-Rim2一起培育，根據(jù)“Rim2與cAMP-GEFII之間相互作用的研究I”中所述的方法，用針對(duì)小鼠cAMP-GEFII C 端(氨基酸殘基1001-1011，Gln-Met-Ser-His-Arg-Leu-Glu-Pro-Arg-Arg-Pro)(SEQ ID NO5)產(chǎn)生的IgG抗體評(píng)價(jià)cAMP-GEFII和Rim2之間的相互作用。
<Rim1和cAMP-GEFII之間相互作用的研究>
按照“GST融合蛋白的制備和測(cè)試”所述的方法，將Rim1部分序列(530-806)表達(dá)成GST融合蛋白，然后純化。使三只小鼠的腦勻漿物與固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim1 4℃培育過夜。如“Rim2與cAMP-GEFII之間相互作用的研究II”中所述的那樣檢測(cè)cAMP-GEFII。
<大鼠組織中的Northern印跡>
用小鼠cAMP-GEFII(核酸606-2237)、大鼠Rim1(1035-1491)和小鼠Rim2(586-1490)cDNA作為探針，對(duì)大鼠的各個(gè)組織進(jìn)行Northern印跡。
<小鼠腦中的原位雜交>
如J．Tanaka，M．Murate，C．Z．Wang，S．Seino，T．Iwanaga，Arch．Histol．Cytol．59485(1996)中所述的那樣，在小鼠腦中進(jìn)行原位雜交。
用于小鼠cAMP-GEFII和Rim2的反義寡核苷酸探針(45聚體)分別對(duì)應(yīng)于核酸2746-2790和1376-1420的區(qū)域。
對(duì)于Rim1的反義寡核苷酸，從小鼠腦部分克隆得到Rim1 cDNA用于此的探針是5′-ttgcgc tcactct tctggcc tccctt gccatt ctgctc tgaaagc-3′(SEQ ID NO3)。
<Rim2和Rab3A之間相互作用的研究>
根據(jù)“用YTH方法鑒定相互作用的分子”中所述的方法，將野生型小鼠Rab3A和組成型活性牛Rab3A(Q81L)的全長cDNA克隆到酵母誘餌載體pBTM116中。
將牛rabphilin3(氨基酸殘基1-238)、大鼠Rim1(氨基酸殘基1-204)和小鼠Rim2(氨基酸殘基1-345)的鋅指結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列克隆到捕食載體pVP16中。按照生產(chǎn)商說明書(Clontech)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的液體培養(yǎng)試驗(yàn)。從3個(gè)獨(dú)立的克隆獲得各轉(zhuǎn)化子的活性數(shù)值，用OD600確定的細(xì)胞數(shù)予以標(biāo)準(zhǔn)化。
從表達(dá)Rab3A的Sf9細(xì)胞的膜組分純化得到脂質(zhì)修飾的Rab3A。將大鼠Rim1(氨基酸殘基1-204)和小鼠Rim2(氨基酸殘基1-345)表達(dá)成GST融合蛋白并純化。使Rab3A的GTPγS-或GDPβS-結(jié)合形式與固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim1或GST-Rim2(各30pmol)于反應(yīng)緩沖液中一起4℃培育90分鐘。用抗Rab3A抗體作免疫印跡檢測(cè)Rab3A。
<轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞分泌GH的研究>
如K．Korake等人，J．Biol．Chem27229407(1997)中所述的那樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的GH分泌。制備野生型cAMP-GEFII、突變型cAMP-GEFII(T810A)以及雙突變cAMP-GEFII(G114E，G422D)的表達(dá)質(zhì)粒載體(pSRα)。用β-半乳糖苷酶(β-gal)作為對(duì)照。用GH表達(dá)載體(pXGH5Nichols Institute)加上上述每個(gè)載體，通過LipofectAMINE轉(zhuǎn)染PC細(xì)胞。
在毛喉素(50微摩爾)或8-溴腺苷3′，5′環(huán)化單磷酸(8-Br-cAMP)(1毫摩爾)存在或不存在下，用低濃度K+(4．7毫摩爾)或高濃度K+(60毫摩爾)溶液培育PC12細(xì)胞。毛喉素或8-Br-cAMP在用低濃度或高濃度K+溶液進(jìn)行培育前10分鐘加入。在一些實(shí)驗(yàn)中，在毛喉素刺激前10分鐘加入PKA抑制劑H-89(10微摩爾)。
<cAMP-GEFII在依賴于cAMP的胞吐作用中作用的研究>
為了干擾MIN6細(xì)胞中cAMP-GEFII的合成，合成了(BIOGNOSTIK)針對(duì)小鼠cAMP-GEFII(對(duì)應(yīng)于核酸104-119的區(qū)域)的反義硫代磷酸酯替代的寡DNA(16聚體)和對(duì)照寡DNA(5′-aacctac gtgact acgt-3′)(SEQ ID NO4)。
在胰島素分泌實(shí)驗(yàn)前，用4微摩爾的反義寡DNA或?qū)φ展袲NA處理MIN6細(xì)胞24小時(shí)。用抗cAMP-GEFII抗體，通過免疫印跡分析經(jīng)反義寡DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染處理過的MIN6過度表達(dá)的cAMP-GEFII，評(píng)價(jià)反義寡DNA的效率。cAMP-GEFII在反義寡DNA處理過的MIN6細(xì)胞中的水平顯著降低。在高濃度葡萄糖(16．7毫摩爾)存在下評(píng)價(jià)這些MIN6細(xì)胞對(duì)8-Br-cAMP(1毫摩爾)的胰島素分泌反應(yīng)。分開進(jìn)行了5個(gè)實(shí)驗(yàn)，如T．Gonoi等人，J．Biol．Chem．26916989(1994)所述的那樣測(cè)定胰島素。
序列表<110>Seino，Susumu；JCR Pharmaceuticals CoLtd．<120>Rim2蛋白<130>GP35<160>4<210>1<211>1590<212>蛋白質(zhì)<213>小家鼠<400> 1Met Ser Ala Pro Leu Gly Pro Arg Gly Arg Pro Ala Pro Thr Pro Ala1 5 10 15Ala Ser Gln Pro Pro Pro Gln Pro Glu Met Pro Asp Leu Ser His Leu20 25 30Thr Glu Glu Glu Arg Lys Ile Ile Leu Ala Val Met Asp Arg Gln Lys35 40 45Lys Glu Glu Glu Lys Glu Gln Ser Val Leu Lys Ile Lys Glu Glu His50 55 60Lys Ala Gln Pro Thr Gln Trp Phe Pro Phe Ser Gly Ile Thr Glu Leu65 70 75 80Val Asn Asn Val Leu Gln Pro Gln Gln Lys Gln Pro Asn Glu Lys Glu85 90 95Pro Gln Thr Lys Leu His Gln Gln Phe Glu Met Tyr Lys Glu Gln Val100 105 110Lys Lys Met Gly Glu Glu Ser Gln Gln Gln Gln Glu Gln Lys Gly Asp115 120 125Ala Pro Thr Cys Gly Ile Cys His Lys Thr Lys Phe Ala Asp Gly Cys130 135 140Gly His Asn Cys Ser Tyr Cys Gln Thr Lys Phe Cys Ala Arg Cys Gly145 150 155 160Gly Arg Val Ser Leu Arg Ser Asn Lys Val Met Trp Val Cys Asn Leu165 170 175Cys Arg Lys Gln Gln Glu Ile Leu Thr Lys Ser Gly Ala Trp Phe Tyr180 185 190Asn Ser Gly Ser Ash Thr Leu Gln Gln Pro Asp Gln Lys Val Pro Arg195 200 205Gly Leu Arg Asn Glu Glu Ala Pro Gln Glu Lys Lys Ala Lys Leu His210 215 220Glu Gln Pro Gln Phe Gln Gly Ala Pro Gly Asp Leu Ser Val Pro Ala225 230 235 240Val Glu Lys Gly Arg Ala His Gly Leu Thr Arg Gln Asp Thr Ile Lys245 250 255Asn Gly Ser Gly Val Lys His Gln Ile Ala Ser Asp Met Pro Ser Asp260 265 270Arg Lys Arg Ser Pro Ser Val Ser Arg Asp Gln Asn Arg Arg Tyr Glu275 280 285Gln Ser Glu Glu Arg Glu Asp Tyr Ser Gln Tyr Val Pro Ser Asp Gly290 295 300Thr Met Pro Arg Ser Pro Ser Asp Tyr Ala Asp Arg Arg Ser Gln Arg305 310 315 320Glu Pro Gln Phe Tyr Glu Glu Pro Gly His Leu Asn Tyr Arg Asp Ser325 330 335Asn Arg Arg Gly His Arg His Ser Lys Glu Tyr Ile Val Asp Asp Glu340 345 350Asp Val Glu Ser Arg Asp Glu Tyr Glu Arg Gln Arg Arg Glu Glu Glu355 360 365Tyr Gln Ala Arg Tyr Arg Ser Asp Pro Asn Leu Ala Arg Tyr Pro Val370 375 380Lys Pro Gln Pro Tyr Glu Glu Gln Met Arg Ile His Ala Glu Val Ser385 390 395 400Arg Ala Arg His Glu Arg Arg His Ser Asp Val Ser Leu Ala Asn Ala405 410 415Glu Leu Glu Asp Ser Arg Ile Ser Leu Leu Arg Met Asp Arg Pro Ser420 425 430Arg Gln Arg Ser Val Ser Glu Arg Arg Ala Ala Met Glu Ash Gln Arg435 440 445Ser Tyr Ser Met Glu Arg Thr Arg Glu Ala Gln Gly Gln Ser Ser Tyr450 455 460Pro Gln Arg Thr Ser Asn His Ser Pro Pro Thr Pro Arg Arg Ser Pro465 470 475 480Ile Pro Leu Asp Arg Pro Asp Met Arg Arg Ala Asp Ser Leu Arg Lys485 490 495Gln His His Leu Asp Pro Ser Ser Ala Val Arg Lys Thr Lys Arg Glu500 505 510Lys Met Glu Thr Met Leu Arg Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asp Gln Ser515 520 525Glu Ser Val Arg Pro Pro Pro Pro Arg Pro His Lys Ser Lys Lys Gly530 535 540Gly Lys Met Arg Gln Val Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Leu Ala545 550 555 560Ser Thr Pro Glu Tyr Thr Ser Cys Asp Asp Val Glu Leu Glu Ser Glu565 570 575Ser Val Ser Glu Lys Gly Asp Ser Gin Lys Gly Lys Arg Lys Thr Ser580 585 590Glu Gln Gly Val Leu Ser Asp Ser Asn Thr Arg Ser Glu Arg Gln Lys595 600 605Lys Arg Met Tyr Tyr Gly Gly His Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Trp610 615 620Ser Glu Pro Gln Ile Lys Asp Ser Gly Val Asp Thr Cys Ser Ser Thr625 630 635 640Thr Leu Asn Glu Glu His Ser His Ser Asp Lys His Pro Val Thr Trp645 650 655Gln Pro Ser Lys Asp Gly Asp Arg Leu Ile Gly Arg Ile Leu Leu Asn660 665 670Lys Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Pro Arg Asp Ser Gly Ala Met Leu675 680 685Gly Leu Lys Val Val Gly Gly Lys Met Thr Glu Ser Gly Arg Leu Cys690 695 700Ala Phe Ile Thr Lys Val Lys Lys Gly Ser Leu Ala Asp Thr Val Gly705 710 715 720His Leu Arg Pro Gly Asp Glu Val Leu Glu Trp Asn Gly Arg Leu Leu725 730 735Gln Gly Ala Thr Phe Glu Glu Val Tyr Asn Ile Ile Leu Glu Ser Lys740 745 750Pro Glu Pro Gln Val Glu Leu Val Val Ser Arg Pro Ile Gly Asp Ile755 760 765Pro Arg Ile Pro Asp Ser Thr His Ala Gln Leu Glu Ser Ser Ser Ser770 775 780Ser Phe Glu Ser Gln Lys Met Asp Arg Pro Ser Ile Ser Val Thr Ser785 790 795 800Pro Met Ser Pro Gly Met Leu Arg Asp Val Pro Gln Phe Leu Ser Gly805 810 815Gln Leu Ser Ile Lys Leu Trp Phe Asp Lys Val Gly His Gln Leu Ile820 825 830Val Thr Ile Leu Gly Ala Lys Asp Leu Pro Ser Arg Glu Asp Gly Arg835 840 845Pro Arg Asn Pro Tyr Val Lys Ile Tyr Phe Leu Pro Asp Arg Ser Asp850 855 860Lys Asn Lys Arg Arg Thr Lys Thr Val Lys Lys Thr Leu Glu Pro Lys865 870 875 880Trp Ash Gln Thr Phe Ile Tyr Ser Pro Val His Arg Arg Glu Phe Arg885 890 895Glu Arg Met Leu Glu Ile Thr Leu Trp Asp Gln Ala Arg Val Arg Glu900 905 910Glu Glu Ser Glu Phe Leu Gly Glu Ile Leu Ile Glu Leu Glu Thr Ala915 920 925Leu Leu Asp Asp Glu Pro His Trp Tyr Lys Leu Gln Thr His Asp Val930 935 940Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg Pro Ser Pro Tyr Leu Pro Arg Arg Gln945 950 955 960Leu His Gly Glu Ser Pro Thr Arg Arg Leu Gln Arg Ser Lys Arg Ile965 970 975Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp Tyr Asp Cys Glu Asp Gly Val Gly Val980 985 990Val Ser Asp Tyr Arg His Asn Gly Arg Asp Leu Gln Ser Ser Thr Leu995 10001005Ser Val Pro Glu Gln Val Met Ser Ser Asn His Cys Ser Pro Ser Gly101010151020Ser Pro His Arg Val Asp Val Ile Gly Arg Thr Arg Ser Trp Ser Pro1025103010351040Ser Ala Pro Pro Pro Gln Arg Asn Val Glu Gln Gly His Arg Gly Thr104510501055Arg Ala Thr Gly His Tyr Asn Thr Ile Ser Arg Met Asp Arg His Arg106010651070Val Met Asp Asp His Tyr Ser Ser Asp Arg Asp Arg Asp Cys Glu Ala107510801085Ala Asp Arg Gln Pro Tyr His Arg Ser Arg Ser Thr Glu Gln Arg Pro109010951100Leu Leu Glu Arg Thr Thr Thr Arg Ser Arg Ser Ser Glu Arg Pro Asp1105111011151120Thr Asn Leu Met Arg Ser Met Pro Ser Leu Met Thr Gly Arg Ser Ala112511301135Pro Pro Ser Pro Ala Leu Ser Arg Ser His Pro Arg Thr Gly Ser Val114011451150Gln Thr Ser Pro Ser Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Arg Gly Arg Gln115511601165Leu Pro Gln Leu Pro Pro Lys Gly Thr Leu Glu Arg Ser Ala Met Asp117011751180Ile Glu Glu Arg Ash Arg Gln Met Lys Leu Asn Lys Tyr Lys Gln Val1185119011951200Ala Gly Ser Asp Pro Arg Leu Glu Gln Asp Tyr His Ser Lys Tyr Arg120512101215Ser Gly Trp Asp Pro His Arg Gly Ala Asp Thr Val Ser Thr Lys Ser122012251230Ser Asp Ser Asp Val Ser Asp Val Ser Ala Val Ser Arg Thr Ser Ser123512401245Ala Ser Arg Phe Ser Ser Thr Ser Tyr Met Ser Val 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權(quán)利要求
1．一種蛋白質(zhì)，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2．一種蛋白質(zhì)，它具有的氨基酸序列相對(duì)于序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代、插入或增加，并且該蛋白質(zhì)具有與GDP／GTP交換因子II相互作用的性質(zhì)。
3．一種編碼權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)的小鼠基因。
4．一種DNA，它具有序列表中SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，該DNA是對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的cDNA。
5．一種DNA，它具有的核苷酸序列相對(duì)于序列表中SEQ ID NO2所示的核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、替代、插入或增加，并編碼權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)。
6．一種DNA，它含有權(quán)利要求4所述的DNA之編碼區(qū)的核苷酸序列。
7．一種DNA，它含有權(quán)利要求5所述的DNA之編碼區(qū)的核苷酸序列。
8．一種DNA片段，它由權(quán)利要求4所述的DNA的一部分組成。
9．一種探針，它包含與權(quán)利要求4所述的DNA雜交的DNA。
10．一種引物DNA片段，它由權(quán)利要求4至7之一項(xiàng)所述的序列的一部分序列組成。
11．一種重組載體，它含有權(quán)利要求4所述的DNA。
12．一種重組載體，它含有權(quán)利要求5所述的DNA。
13．一種單克隆或多克隆抗體，它針對(duì)于權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)。
14．一種用于診斷分泌失調(diào)或腦一神經(jīng)系統(tǒng)疾病的制劑，它包含權(quán)利要求9所述的探針。
15．一種用于診斷分泌失調(diào)或腦一神經(jīng)系統(tǒng)疾病的制劑，它包含權(quán)利要求13所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于開發(fā)涉及運(yùn)輸系統(tǒng)的神經(jīng)元、或內(nèi)分泌細(xì)胞有關(guān)疾病的治療制劑的一種蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列相對(duì)于序列表中SEQ ID NO∶1所述的氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替代、插入或增加,該蛋白質(zhì)具有與GDP/GTP交換因子Ⅱ相互作用的性質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1291617SQ0012419
公開日2001年4月18日 申請(qǐng)日期2000年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月8日
發(fā)明者清野進(jìn), 柴崎忠雄, 尾崎信曉 申請(qǐng)人:日本化學(xué)研究株式會(huì)社, 清野進(jìn)