一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，該脫毒方法詳細(xì)步驟包括：（1）配制香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基；（2）接種花藥的選材；（3）花藥消毒與接種；（4）花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)；（5）胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng)；（6）香水百合鱗莖的煉苗與移栽；（7）香水百合單倍體植株的剔除。本發(fā)明的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法通過香水百合花藥培養(yǎng)獲得了香水百合花粉植株，進(jìn)而剔除群體中摻雜的單倍體植株獲得香水百合二倍體植株，進(jìn)一步進(jìn)行百合病毒檢測發(fā)現(xiàn)，該脫毒方法幾乎達(dá)到100%脫毒，大大提高了百合種質(zhì)，獲得了產(chǎn)量和品質(zhì)得到極大提升的百合脫毒植株。
【專利說明】
_種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及園藝學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過花藥培養(yǎng)途徑高效脫除百合病毒的香 水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合spp.)是百合科(Zi7iaceae)百合屬(Zi7i腫)多年生球根花丼，其花 大、花色豐富、花形優(yōu)美、寓意純潔而深受人們喜愛，是當(dāng)今世界上重要的切花品種之一。西 方人以百合為圣潔象征，在公元約1000年前以色列國王所羅門的寺廟柱頂就是用百合花作 裝飾。百合花的花名是為了紀(jì)念圣母瑪利亞，自古以來圣母就被基督教視為清純的象征，因 此它的花語就是純潔。目前全世界約有100多種百合品種，我國栽培約有60多種。百合切花 是目前世界上發(fā)展最快的花卉之一。
[0003] 香水百合是百合中的一種，別名卡薩布蘭卡，天上百合，原產(chǎn)地為喜馬拉雅山區(qū)、 澳洲等各個(gè)地區(qū)。香水百合是百合中的女王，花語為"偉大純潔的愛"，送的是心儀的女子， 香水百合發(fā)展?jié)摿薮?，市場前景廣闊。
[0004] 百合以有性方式(種子繁殖)和無性方式進(jìn)行繁殖，商業(yè)上主要以扦插繁殖和分球 繁殖等無性繁殖為主，長期的無性繁殖將會使體內(nèi)逐漸積累大量病毒致使植物發(fā)生病毒 病，并導(dǎo)致種性退化，百合也不例外。病毒病經(jīng)常對百合生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。自Stewart (1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報(bào)道了百合的病毒病原19種，其中發(fā)生普遍、危害嚴(yán) 重的病毒有4種，即百合無病癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、百合X病毒(LVX)和郁金 香頂裂病毒等4種病毒危害。近年來，隨著百合引種數(shù)量的增加、種植面積的擴(kuò)大以及不規(guī) 范的種球自繁，病毒病已開始在我國各百合種植區(qū)發(fā)生流行，一般發(fā)病率為40%_50%，二代 種球的帶毒率在90%以上。病毒病對百合的危害表現(xiàn)主要有:植株嚴(yán)重矮化，脈明，花葉，畸 形，壞死斑，鱗莖變小，產(chǎn)量下降，種質(zhì)明顯退化，開花少且小，有的甚至盲花，嚴(yán)重時(shí)整株枯 死，嚴(yán)重制約了我國百合的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0005] 百合在中國鮮切花中屬于高端花卉，年銷量不斷攀升，這使得百合脫毒技術(shù)的研 究成為百合產(chǎn)量和品質(zhì)發(fā)展的重要手段，如何減少和消除病毒病，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無毒種苗，是百 合種球商品化生產(chǎn)面臨的一個(gè)重要問題。目前，百合病毒病已成為僅次于真菌病害的主要 病害，由于病毒復(fù)制與植物代謝密切相關(guān)，而且有些病毒的抗逆性很強(qiáng)，一直沒有有效的防 治措施，因此，獲得無病毒苗成為生產(chǎn)高品質(zhì)百合的關(guān)鍵。對百合脫毒研究最早的是 Phi lhps (1962年），利用百合莖尖培養(yǎng)脫毒苗，試驗(yàn)獲得成功后，又有許多外國學(xué)者也成功 獲得莖尖脫毒苗。1966年Mori和Hamaya通過莖尖培養(yǎng)獲得了百合無病毒植株。目前，生產(chǎn) 上主要是通過熱處理、組培莖尖脫毒和化學(xué)處理等方法進(jìn)行脫毒。然而，目前的百合脫毒方 法并不完善，各種脫毒方法均有其不足之處。熱處理是利用病毒和植物對溫度敏感性的差 異不同，利用高溫對植物進(jìn)行處理，高溫使病毒鈍化，在植物體內(nèi)很難繁殖，部分植物細(xì)胞 耐高溫加速細(xì)胞分裂和繁殖，從而獲得無病毒的新生植物組織部分，再進(jìn)一步繁殖得到無 病毒苗，然而熱處理不能脫除所有病毒，且影響百合存活率;莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植 物體內(nèi)分布不均勾，在根尖和莖尖病毒含量很少或不含病毒，因此，米用莖尖1?體培養(yǎng)的方 法可以脫除病毒，其缺點(diǎn)是植物的存活率很低;化學(xué)處理法是將抗病毒藥劑注射進(jìn)植物體 內(nèi)或者加入培養(yǎng)基中，以達(dá)到除去病毒的目的，一般要與莖尖組織培養(yǎng)相結(jié)合應(yīng)用，可一定 程度的提高莖尖脫毒效率和存活率。
[0006] 花藥離體培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，來改變花藥內(nèi)花 粉粒的發(fā)育程序，使其分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而分化成胚狀體，形成愈傷組織，由愈傷組織再 分化成植株的一種技術(shù)，花藥培養(yǎng)主要用途為培育單倍體植株，然而，由于小孢子基本不攜 帶病毒，通過花藥培養(yǎng)培育的植株幾乎能達(dá)到完全脫毒的目的，因此，若將離體的百合花藥 培育成單倍體植株，進(jìn)而選擇百合的單倍體植株加倍的正常植株來育苗，可以較好的達(dá)到 百合脫毒的目的。
[0007] 目前，在百合脫毒技術(shù)研究中，還是以熱處理和莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)研究和利用的 比較多，百合花藥培養(yǎng)脫毒法研究和利用的較少，但在一些園藝作物上已見報(bào)道。主要原因 還是在于現(xiàn)有的百合花藥培養(yǎng)效率較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到生產(chǎn)的要求。培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)的物 質(zhì)基礎(chǔ)，直接關(guān)系到培養(yǎng)物的生長與分化，培養(yǎng)基組分是影響花培效率的一個(gè)很重要的因 素。培養(yǎng)基各組分的合適用量，以及它們之間一定的組合關(guān)系，可導(dǎo)致花培效率的大幅度提 高。繼續(xù)篩選和優(yōu)化基本培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基選用的針對性，是提高花藥培養(yǎng)力的有效措 施;大量的研究發(fā)現(xiàn)一些附加物可以顯著提高花藥培養(yǎng)力，發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化組合花藥培養(yǎng)附加 物質(zhì)，可進(jìn)一步提高花藥培養(yǎng)力。
[0008] 通過大量香水百合花藥培養(yǎng)的摸索和實(shí)踐，我們進(jìn)一步優(yōu)化了基本培養(yǎng)基配方， 并且不斷嘗試加入一些提高花藥誘導(dǎo)力的添加物并組合其種類搭配及濃度，摸索出了一種 高效率地誘導(dǎo)香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，達(dá)到了通過香水百合花藥培養(yǎng)進(jìn)行脫 毒的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用效率。我們的研究結(jié)果對于香水百合的脫毒技術(shù)的進(jìn)步具有較大的實(shí)用價(jià) 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供了一種通過香水百合花藥培養(yǎng)途 徑高效脫除百合病毒的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的： 一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:該花藥培養(yǎng)脫毒方法的詳細(xì)步驟如 下： (1)配制香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基 香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成： 大量元素：KN〇3 2500~2700mg/L，NH4N〇3 1600~1800mg/L，KH2P〇4 440~480mg/L， MgS〇4.7H2〇 350~390mg/L，CaCl2.2H2〇 820~860mg/L; 微量元素：MnS〇4.4H20 20~25mg/L，ZnS〇4.7H20 8.0~9.0mg/L，H3B03 6.0~6.5mg/L， KI0.8~0.85mg/L，CuS04.5H20 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H20 0.02~0.03mg/L，NaMo04.2H20 0 · 2~0·3mg/L; 鐵鹽：恥240了厶.2!12〇35~4〇11^/1，卩65〇4.7!12〇25~3〇11^/1; 有機(jī)成分：肌醇90~110mg/L，維生素 B1 0.09~0.11mg/L，維生素 B6 0.45~0.55mg/ 1^，煙酸0.45~0.5511^/1^，甘氛酸1.8~2.211^/1^，絲氛酸0.75~0.8511^/1^; 激素 :2,4-D 3.2~3.6mg/L，KT 2.0~2.4mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.0~6.5g/L; 活性添加劑:椰乳14~16g/L，甘露醇20~24g/L，水解蛋白0.8~1.0g/L，活性炭0.35 ~0·45g/L; 碳源：鹿糖55~65g/L; 將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分和激素分別配制成一定濃度倍數(shù)的母液貯備， 配制時(shí)，預(yù)先量出配制培養(yǎng)基總量一半體積的蒸餾水，分別加入一定體積或質(zhì)量的大量元 素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、活性添加劑，定容，加熱至60-80°C，然后加入碳源、凝固劑和 激素，攪拌至沸騰后，培養(yǎng)基完全融解，停止加熱，調(diào)節(jié)pH為5.8-6.0，然后將培養(yǎng)基分裝于 500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml~150ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa 高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷卻凝固； (2 )接種花藥的選材 在香水百合正?，F(xiàn)蕾開花季節(jié)，上午取材，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室； (3) 花藥消毒與接種 將花蕾用自來水沖洗10~20min，在超凈工作臺無菌條件下，先用75%酒精消毒2min，再 用0.1%升汞+2-3滴吐溫-80消毒15min，無菌水沖洗3~4次后，從花蕾中取出帶有花絲的花 藥，接種到步驟(1)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上； (4) 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，50-65d后誘導(dǎo)出花藥胚性愈傷； (5) 胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng) 無菌條件下將誘導(dǎo)成功的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，光照條件下分化培養(yǎng) 25-40天至小芽長至0.6cm以上，將高于0.6cm的小芽切下，轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)， 2-3個(gè)月后即可得到直徑0.8-2.0cm的百合小鱗莖； (6) 香水百合鱗莖的煉苗與移栽 將香水百合小鱗莖的三角瓶封口膜打開煉苗，7~10d后將小鱗莖從三角瓶中取出，清 洗掉根部的培養(yǎng)基殘留，移栽入溫室內(nèi)，定期噴施百合壯苗營養(yǎng)液來壯苗； (7) 香水百合單倍體植株的剔除 采用根尖壓片法觀察所得香水百合植株的倍性，剔除僅含12條染色體的百合單倍體植 株。
[0011]所述步驟(1)的香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配方為： 按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成： 大量元素：KN〇3 2600mg/L，NH4N〇3 1700mg/L，KH2P〇4 460mg/L，MgS〇4.7H20 370mg/L， CaCl2-2H20 840mg/L； 微量元素：MnS〇4.4H20 22.5mg/L，ZnS〇4.7H20 8.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.825mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4_2H2〇 0.25mg/L; 鐵鹽：Na2-EDTA.2H2〇 37.5mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.5mg/L; 有機(jī)成分:肌醇l〇〇mg/L，維生素 B1 0.1mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨 酸 2.0mg/L，絲氨酸 0.8mg/L; 激素:2,4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.25g/L; 活性添加劑:椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白0.9g/L，活性炭0.4g/L; 碳源:鹿糖60g/L。
[0012] 所述步驟(2)中的篩選百合花蕾的標(biāo)準(zhǔn)為:按照花蕾長度為22~28_、花蕾內(nèi)花藥 中的小孢子大都處于單核期的標(biāo)準(zhǔn)選擇花蕾。
[0013] 所述步驟(4)中花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件控制為:溫度控制為24°c-27°c，濕度控 制為65%-80%，黑暗條件。
[0014] 所述步驟(5)中分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:MS+6 · 5%蔗糖+0 · 8mg/L2，4-D+0 · 25mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制為:溫度25°C_28°C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周期為14h光/ 10h 暗。
[0015] 所述步驟（5)中繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2MS+6 · 0%蔗糖+0 · 6mg/L6-BA + 0.15mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制為:溫度25°C_28°C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周 期為14h光/10h暗。
[0016] 所述步驟(6)中百合壯苗營養(yǎng)液的配方為:1?2?〇4〇.38/1，0&3〇4〇.18/1，1^3〇4· 7H20 0.1g/L，ZnS〇4_7H20 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4_7H20 0.6mg/L，CuS〇4 0.1mg/L，MnS〇4_4H20 0.5mg/L，H3B〇3 0.2mg/L;將以上個(gè)成分定量充分溶解在純凈水里即成營養(yǎng)液； 所述的百合壯苗營養(yǎng)液的用法為:百合鱗莖移栽時(shí)澆一次，以后每7-10天澆一次，每次 用量為50-80ml/株百合。
[0017] 所述步驟(7)中香水百合單倍體植株的剔除在生產(chǎn)上的標(biāo)準(zhǔn)可以簡化為:移栽后 的香水百合生長到現(xiàn)蕾期時(shí)，根據(jù)植株高度差異，將群體植株高度后30%的植株剔除。
[0018] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明通過優(yōu)化香水百合花藥培養(yǎng)途徑的培養(yǎng)基配方，摸索出了一種高效率地誘導(dǎo)香 水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基，使得香水百合的花培效率達(dá)到了通過香水百合花藥培養(yǎng)進(jìn) 行脫毒生產(chǎn)脫毒植株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用要求。
[0019] 由于百合花藥中的花粉基本不攜帶病毒，通過花藥培養(yǎng)培育的花粉植株幾乎能達(dá) 到完全脫毒的目的，我們將花粉植株進(jìn)行百合病毒檢測也發(fā)現(xiàn)，該脫毒方法幾乎達(dá)到100% 脫毒，大大提高了百合種質(zhì)，獲得了產(chǎn)量和品質(zhì)均得到極大提升的百合脫毒植株。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施案例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而非限制本發(fā)明。
[0021] 實(shí)施例1 2012年7月，選擇大田栽培的香水百合品種白精靈和元帥的花藥分別進(jìn)行花培誘導(dǎo)脫 毒，其詳細(xì)步驟如下： (1)配制香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基 按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成： 大量元素：KN〇3 2600mg/L，NH4N03 1700mg/L，KH2P〇4 460mg/L，MgS〇4.7H20 370mg/L， CaCl2-2H20 840mg/L； 微量元素：MnS〇4.4H20 22.5mg/L，ZnS〇4.7H20 8.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.825mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4_2H2〇 0.25mg/L; 鐵鹽：Na2-EDTA.2H2〇 37.5mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.5mg/L; 有機(jī)成分:肌醇l〇〇mg/L，維生素 B1 O.lmg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨 酸 2.0mg/L，絲氨酸 0.8mg/L; 激素:2,4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.25g/L; 活性添加劑:椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白0.9g/L，活性炭0.4g/L; 碳源:蔗糖60g/L; 將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分和激素分別配制成一定濃度倍數(shù)的母液貯備， 配制時(shí)，預(yù)先量出配制培養(yǎng)基總量一半體積的蒸餾水，分別加入一定體積或質(zhì)量的大量元 素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、活性添加劑，定容，加熱至70°C左右，然后加入碳源、植物凝 膠和激素，攪拌至沸騰后，培養(yǎng)基完全融解，停止加熱，調(diào)節(jié)pH為5.9，然后將培養(yǎng)基分裝于 500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml~150ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa 高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷卻凝固即得； (2 )接種花藥的選材 在白精靈和元帥正?，F(xiàn)蕾開花季節(jié)，上午取材，按照花蕾長度為22~28mm、花蕾內(nèi)花藥 中的小孢子大都處于單核期的標(biāo)準(zhǔn)選擇花蕾，分別用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室； (3) 花藥消毒與接種 將花蕾用自來水沖洗10~20min，在超凈工作臺無菌條件下，先用75%酒精消毒2min，再 用0.1%升汞+2-3滴吐溫-80消毒15min，無菌水沖洗3~4次后，從花蕾中取出帶有花絲的花 藥，接種到步驟(1)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上； (4) 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng) 將接種白精靈和元帥花藥后的培養(yǎng)基分別進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)室環(huán)境控制為:溫 度24°C_27°C，濕度65%-80%，黑暗條件;花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)50-65d后，白精靈和元帥均誘導(dǎo)出幼 嫩黃白、松散狀的花藥胚性愈傷，統(tǒng)計(jì)白精靈和元帥愈傷組織誘導(dǎo)率，分別達(dá)到了25.3%和 18.7%； (5) 胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng) 無菌條件下將誘導(dǎo)成功的白精靈和元帥的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上(分化培 養(yǎng)基配方為:MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA)，光照條件下(培養(yǎng)條件控制為： 溫度25°C_28°C，濕度65%-80%，光照為1200-1800LX，光周期為14h光/10h暗）分化培養(yǎng)25-40 天至小芽長至0.6cm以上，此時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率，白精靈和元帥愈傷組織分化率分別為 87.6%和78.9%;將高于0.6cm的小芽切下，轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基上(繼代培養(yǎng)基配方為：1/2MS+ 6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA)繼代培養(yǎng)(培養(yǎng)條件控制為:溫度25°C_28°C，濕度 65%-80%，光照為1200-1800LX，光周期為14h光/10h暗），2-3個(gè)月后得到直徑0.8-2.0cm的 百合小鱗莖； (6) 鱗莖的煉苗與移栽 將白精靈和元帥小鱗莖的三角瓶封口膜打開煉苗，7~10d后將小鱗莖從三角瓶中取 出，清洗掉根部的培養(yǎng)基殘留，移栽入溫室內(nèi)，噴施百合壯苗營養(yǎng)液壯苗（百合壯苗營養(yǎng)液 的配方為：KH2PO4 0.3g/L，CaS〇4 0.1g/L，MgS〇4.7H20 0.1g/L，ZnS〇4.7H20 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4· 7H20 0.6mg/L，CuS〇4 0.1mg/L，MnS〇4.4H2〇 0.5mg/L，H3B03 0.2mg/L;將以上個(gè)成分定量充 分溶解在純凈水里即成營養(yǎng)液），百合壯苗營養(yǎng)液的施用用法為：百合鱗莖移栽時(shí)澆一次， 以后每7-10天饒一次，每次用量為50-80ml/株百合； (7)單倍體植株的剔除 采用根尖壓片法觀察所得白精靈和元帥植株的倍性，剔除僅含12條染色體的百合單倍 體植株;統(tǒng)計(jì)白精靈和元帥單倍體植株的比例，分別為22.7%和26.5%，且白精靈和元帥單倍 體植株在各自的花培群體中均表現(xiàn)為最矮，生長至現(xiàn)蕾期時(shí)差異尤為明顯，因此，在生產(chǎn)上 剔除百合單倍體植株的標(biāo)準(zhǔn)可以簡化為:移栽后的香水百合生長到現(xiàn)蕾期時(shí)，根據(jù)植株高 度差異，將群體植株高度后30%的植株剔除。
[0022] 實(shí)施例2 2013年4月，采用目前常用的莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合熱處理和莖尖培養(yǎng)結(jié)合病毒唑化 學(xué)處理的兩種常規(guī)百合脫毒方法對百合品種白精靈和元帥進(jìn)行脫毒處理，分別獲得白精靈 和元帥脫毒苗，將實(shí)施例1采用本發(fā)明的技術(shù)路線獲得的白精靈和元帥脫毒苗冷凍株，一起 檢測侵染百合的3種主要病毒:黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無癥病毒(LSV)和百合斑駁病毒 (LMoV)，比較本發(fā)明的技術(shù)路線與常規(guī)脫毒方法對百合常見病毒的脫毒效果差異。鑒定方 法采用多重RT-PCR技術(shù)(參照陳進(jìn)等《百合三種主要病毒的RT-PCR檢測及脫毒技術(shù)研究》）， 三種脫毒方法對白精靈和元帥三種病毒的脫毒效果如表1。
[0023] 由表1可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法基本可以達(dá)到完全脫毒 的效果，相比目前常規(guī)的百合脫毒方法，脫毒效果有了極大的進(jìn)步，而且百合花藥培養(yǎng)操作 技術(shù)較常規(guī)莖尖培養(yǎng)操作技術(shù)要求低，更便于產(chǎn)業(yè)化實(shí)施。因此，本發(fā)明對香水百合的脫毒 需求具有巨大的進(jìn)步和極大的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。
[0024] 上述實(shí)例只是為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思以及技術(shù)特點(diǎn)，并不能以此限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:該花藥培養(yǎng)脫毒方法的詳細(xì)步驟 如下： (1) 配制香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基 香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成： 大量元素：KN〇3 2500~2700mg/L，NH4N〇3 1600~1800mg/L，KH2P〇4 440~480mg/L， MgS〇4.7H2〇 350~390mg/L，CaCl2.2H2〇 820~860mg/L; 微量元素：]?115〇4.4!12〇20~2511^/1，2115〇4.7!12〇8.0~9.〇11^/1，!138〇3 6.0~6.511^/1， KI0.8~0.85mg/L，CuS04.5H20 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H20 0.02~0.03mg/L，NaMo04.2H20 0 · 2~0·3mg/L; 鐵鹽：恥240了厶.2!12〇35~4〇11^/1，卩65〇4.7!12〇25~3〇11^/1; 有機(jī)成分：肌醇90~110mg/L，維生素 B1 0.09~0.11mg/L，維生素 B6 0.45~0.55mg/ 1^，煙酸0.45~0.5511^/1^，甘氛酸1.8~2.211^/1^，絲氛酸0.75~0.8511^/1^; 激素：2,4-D 3.2~3.6mg/L，KT 2.0~2.4mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.0~6.5g/L; 活性添加劑:椰乳14~16g/L，甘露醇20~24g/L，水解蛋白0 · 8~1 · Og/L，活性炭0 · 35 ~0·45g/L; 碳源：鹿糖55~65g/L; 將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分和激素分別配制成一定濃度倍數(shù)的母液貯備， 配制時(shí)，預(yù)先量出配制培養(yǎng)基總量一半體積的蒸餾水，分別加入一定體積或質(zhì)量的大量元 素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、活性添加劑，定容，加熱至60-80°C，然后加入碳源、凝固劑和 激素，攪拌至沸騰后，培養(yǎng)基完全融解，停止加熱，調(diào)節(jié)pH為5.8-6.0，然后將培養(yǎng)基分裝于 500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml~150ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa 高壓蒸汽條件下滅菌20min，自然冷卻凝固； (2) 接種花藥的選材 在香水百合正?，F(xiàn)蕾開花季節(jié)，上午取材，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室； (3) 花藥消毒與接種 將花蕾用自來水沖洗10~20min，在超凈工作臺無菌條件下，先用75%酒精消毒2min，再 用0.1%升汞+2-3滴吐溫-80消毒15min，無菌水沖洗3~4次后，從花蕾中取出帶有花絲的花 藥，接種到步驟(1)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上； (4) 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，50-65d后誘導(dǎo)出花藥胚性愈傷； (5) 胚性愈傷分化與繼代培養(yǎng) 無菌條件下將誘導(dǎo)成功的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，光照條件下分化培養(yǎng) 25-40天至小芽長至0.6cm以上，將高于0.6cm的小芽切下，轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)， 2-3個(gè)月后即可得到直徑0.8-2.0cm的百合小鱗莖； (6) 香水百合鱗莖的煉苗與移栽 將香水百合小鱗莖的三角瓶封口膜打開煉苗，7~10d后將小鱗莖從三角瓶中取出，清 洗掉根部的培養(yǎng)基殘留，移栽入溫室內(nèi)，定期噴施百合壯苗營養(yǎng)液來壯苗； (7) 香水百合單倍體植株的剔除 采用根尖壓片法觀察所得香水百合植株的倍性，剔除僅含12條染色體的百合單倍體植 株。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟（1)的 香水百合花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配方為： 按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成： 大量元素：KN〇3 2600mg/L，NH4N03 1700mg/L，KH2P〇4 460mg/L，MgS〇4.7H20 370mg/L， CaCl2-2H20 840mg/L； 微量元素：MnS〇4.4H20 22.5mg/L，ZnS〇4.7H20 8.5mg/L，H3B03 6.25mg/L，KI 0.825mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4_2H2〇 0.25mg/L; 鐵鹽：Na2-EDTA.2H2〇 37.5mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 27.5mg/L; 有機(jī)成分:肌醇l〇〇mg/L，維生素 B1 O.lmg/L，維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，甘氨 酸 2.0mg/L，絲氨酸 0.8mg/L; 激素：2,4-D 3.4mg/L，KT 2.2mg/L; 凝固劑:植物凝膠6.25g/L; 活性添加劑:椰乳15g/L，甘露醇22g/L，水解蛋白0.9g/L，活性炭0.4g/L; 碳源:鹿糖60g/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(2)中 的篩選百合花蕾的標(biāo)準(zhǔn)為:按照花蕾長度為22~28mm、花蕾內(nèi)花藥中的小孢子大都處于單 核期的標(biāo)準(zhǔn)選擇花蕾。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(4)中 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件控制為:溫度控制為24°C_27°C，濕度控制為65%-80%，黑暗條件。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(5)中 分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:MS+6.5%蔗糖+0.8mg/L2，4-D+0.25mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制為： 溫度25 °C -28 °C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周期為14h光/1 Oh暗。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(5)中 繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2MS+6.0%蔗糖+0.6mg/L6-BA +0.15mg/L NAA;培養(yǎng)條件控制 為:溫度25 °C -28 °C，濕度65%-80%，光照為1200-1800Lx，光周期為14h光/1 Oh暗。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(6)中 百合壯苗營養(yǎng)液的配方為:KH2P〇4 0.3g/L，CaS〇4 0.1g/L，MgS(V7H20 0.1g/L，ZnS(V7H20 0.2mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.6mg/L，CuS〇4 0.1mg/L，MnS〇4.4H2〇 0.5mg/L，H3B03 0.2mg/L;將以 上個(gè)成分定量充分溶解在純凈水里即成營養(yǎng)液； 所述的百合壯苗營養(yǎng)液的用法為:百合鱗莖移栽時(shí)澆一次，以后每7-10天澆一次，每次 用量為50-80ml/株百合。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香水百合的花藥培養(yǎng)脫毒方法，其特征在于:所述步驟(7)中 香水百合單倍體植株的剔除在生產(chǎn)上的標(biāo)準(zhǔn)可以簡化為:移栽后的香水百合生長到現(xiàn)蕾期 時(shí)，根據(jù)植株高度差異，將群體植株高度后30%的植株剔除。
【文檔編號】A01H4/00GK105993948SQ201610354390
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】王紀(jì)芝, 宋曉燕
【申請人】王紀(jì)芝