專利名稱：一種快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種通過辣椒花藥培養(yǎng)快速獲得再生植抹的方法。
背景技術(shù)：
單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個(gè)體或組織，僅由一個(gè)染色體組所構(gòu)成的個(gè)體稱為單倍體(D. F. I. Langlet， 1927),相當(dāng)于二倍體的半數(shù)體。在作物基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際育種實(shí)踐中均具有重要意義。在遺傳研究中，單倍體是良好的實(shí)驗(yàn)材料，尤其在作物數(shù)量遺傳和轉(zhuǎn)基因研究中。如經(jīng)單倍體加倍后獲得的雙單倍體是分子標(biāo)記和遺傳圖譜繪制研究的良好材料；利用單倍體細(xì)胞作為受體，獲得的轉(zhuǎn)基因材料經(jīng)加倍后從理論上講就是一個(gè)穩(wěn)定的群體。而在育種實(shí)踐中，利用單倍體獲得雙單倍體(DH)群體不僅可以快速獲得純系，縮短育種周期，提高選擇效率，還可以進(jìn)行突變體和新型自交系的篩選。
單倍體材料的獲得途徑包括自然產(chǎn)生和誘發(fā)產(chǎn)生。前者發(fā)生頻率極低，難以應(yīng)用。目前，誘發(fā)植物產(chǎn)生單倍體主要有以下幾種方法l)種間和屬間雜交、2)物理照射和化學(xué)誘變、3)雙生苗的篩選、4)未授粉子房和胚珠培養(yǎng)和5)花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)等。其中，前3種方法需要種植較大的植林群體進(jìn)行人工誘導(dǎo)，工作量巨大，周期長，耗時(shí)耗力，成本較高且誘導(dǎo)率低，難以利用。而利用后兩種方法誘導(dǎo)單倍體或雙單倍體已在很多作物上有成功的"^艮道，同時(shí)利用獲得的新種質(zhì)資源已進(jìn)行了新品種的選育和推廣，并取得了良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
辣椒為茄科辣椒屬蔬菜作物，是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一。目前。關(guān)于辣椒單倍體誘導(dǎo)工作的研究主要集中花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)上，但誘導(dǎo)過程仍存在一些主要問題限制了辣椒花(粉)藥培養(yǎng)在實(shí)際育種中的應(yīng)用，如培養(yǎng)過程中外植體易愈傷化、培養(yǎng)周期長和胚狀體發(fā)生率和植株再生頻率低等。
通常，通過花藥(粉)培養(yǎng)獲得再生植抹，其形態(tài)發(fā)生方式主要有兩種途徑，即胚狀體發(fā)育途徑(直接發(fā)生途徑)和愈傷組織發(fā)育途徑(間接發(fā)生途
3徑)。第一種途徑中小孢子的行為與合子的一樣，經(jīng)歷了如同活體條件下誘導(dǎo)胚發(fā)生的各個(gè)階段。而第二種途徑與第一種相比，小孢子沒有經(jīng)歷胚發(fā)生階段，而是分裂數(shù)次形成愈傷，從花藥壁上形成。這種發(fā)育方式很普遍，通常是由復(fù)雜的培養(yǎng)基打破了小孢子的極性造成的。這種愈傷組織要么在同一培養(yǎng)基上只能分化形成胚、根、芽，要么必須轉(zhuǎn)到另一培養(yǎng)基中分化。 一般來說這種途徑是不希望出現(xiàn)的，因?yàn)榇朔N途徑產(chǎn)生的植林會(huì)出現(xiàn)遺傳變異且倍性復(fù)雜。目前，在辣椒的單倍體誘導(dǎo)過程中，再生植林主要以第二種途徑產(chǎn)生，必須經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接和更換培養(yǎng)基類型，這無疑延長了培養(yǎng)時(shí)間、增加了培養(yǎng)難度，導(dǎo)致再生植抹獲得率很低。因此，如何通過對(duì)影響辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體和植林再生因素的研究，以期利用第一種途徑直接獲得花粉植抹已是辣椒單倍體誘導(dǎo)工作中急需解決的一個(gè)難題。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種通過辣椒花藥培養(yǎng)快速獲得再生植抹的方法。該方法可用于辣椒通過花藥培養(yǎng)快速獲得單倍體、雙單倍體等材料，也為其他作物的花藥培養(yǎng)提供參考。
技術(shù)方案 一種快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植林的方法，制備方法為選取小孢子處于單核靠邊期的花藥，置于3 ~ 5。C低溫下預(yù)處理24~72小時(shí)；低溫預(yù)處理后的花蕾用75%酒精和0.1%升汞消毒，最后用無菌水沖洗干凈；無菌條件下從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，將花藥接種在MS基本培養(yǎng)基+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/LKT+2wt。/。麥芽糖+0.8wt。/。瓊脂+0.5wt。/?；钚蕴康呐囵B(yǎng)基上，33 ~ 37。C下熱激處理6~10天，后在光照度2000k、光照時(shí)間12h、室溫25。C下繼續(xù)培養(yǎng)，直至形成根芽葉俱全的完整植抹。
所述花藥接種前預(yù)處理溫度為4'C。
所述花藥接種前預(yù)處理時(shí)間為48小時(shí)。
所述花藥接種后熱激處理溫度為35°C。
所述花藥接種后熱激處理時(shí)間為8天。
有益效果
1)首次在辣椒花藥培養(yǎng)中利用胚狀體發(fā)生途徑快速地獲得再生植林。該發(fā)明縮短了培養(yǎng)時(shí)間，提高了培養(yǎng)效率，獲得的胚狀體和再生植抹可用于研究辣椒
4生植抹確定為單倍體后可作為新的種質(zhì)資源，用于遺傳分析、遺傳圖譜繪制等理論研究。
2) 辣椒(Cfl/w/o/w fl朋m/w L.)屬茄科辣椒屬，是一種被廣泛種才直的重要蔬菜作物。然而，由于辣椒遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源有限，僅采用常規(guī)育種手段選育新品種不僅耗時(shí)耗力、效率低，且難以使新品種在抗性和品質(zhì)等方面有顯著提高。而利用本發(fā)明方法可快速獲得純系和突變體，不僅可以縮短育種年限，提高育種效率，而且可以提供新的種質(zhì)資源，使新品種在抗性和品質(zhì)等方面得到顯著提高。應(yīng)用本發(fā)明獲得的雙單倍體中性狀優(yōu)良的個(gè)體當(dāng)代即可作為育種材料直接用于新品種的培育。
3) 雙單倍體在遺傳上是純合的，可避免二倍體由于來自雙親的兩條染色體在DNA堿基序列的細(xì)微差異，從而大大提高基因定位標(biāo)圖的準(zhǔn)確性，所以是進(jìn)行AFLP、 RFLP和RAPD等分子標(biāo)記和遺傳圖鐠繪制研究，以及物種進(jìn)化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選等的理想材料。
4) 本發(fā)明是建立在對(duì)辣椒花藥培養(yǎng)影響因素包括基因型、取蕾時(shí)期、溫度處理和培養(yǎng)基成分等系統(tǒng)研究工作基礎(chǔ)上的。通過胚狀體發(fā)生途徑獲得花藥培養(yǎng)再生植林可以縮短培養(yǎng)時(shí)間、提高培養(yǎng)效果。而花藥具有取材方面、結(jié)構(gòu)簡單、基因型豐富等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)可以準(zhǔn)確地控制雄核發(fā)育條件和研究雄核發(fā)育機(jī)制，以及可以快速獲得多種基因型的單倍體或雙單倍體材料。同時(shí)，通過花藥培養(yǎng)可以進(jìn)行優(yōu)良辣4R無性系變異材料的篩選，創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，擴(kuò)大
辣椒基因池。總之，本方法具有堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，科學(xué)性強(qiáng)、方法簡便，易于操作和實(shí)際應(yīng)用。


圖1 辣椒花藥培養(yǎng)的流程圖
圖2單核靠邊期小孢子(200 x )
圖3辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)生和植抹再生。A.剛接種的辣椒花藥；B.膨大的辣椒花藥；C.胚狀體萌發(fā)；D.子葉形胚；E.根芽葉俱全的再生植抹
具體實(shí)施例方式
單倍體和雙單倍體在作物遺傳理論研究和實(shí)際育種實(shí)踐中具有重要意義和良好的應(yīng)用前景。單倍體材料的起源可以自發(fā)產(chǎn)生，也可誘發(fā)產(chǎn)生。前者發(fā)生頻率極低；后者以花藥(粉)培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛?；ǚ壑擦值男螒B(tài)發(fā)生有兩種途徑，即胚狀體發(fā)生途徑和愈傷組織發(fā)育途徑。第一種發(fā)育途徑中小孢子的行為與合子一樣，經(jīng)歷了如同活體條件下誘導(dǎo)胚發(fā)生的各個(gè)階段，可以在花藥上見到花粉植抹，是花藥(粉)培養(yǎng)中植林再生的理想發(fā)育途徑。同時(shí)，由于花藥培養(yǎng)是把完整花藥從花蕾中取出，作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的一種方法，使其取材方便、基因型豐富、群體數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)可以更好地控制雄核發(fā)育條件，快速獲得多種基因型的單倍體或雙單倍體材料，以及容易獲得體細(xì)胞無性系變異材料。
大量研究表明， 一套單倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系的建立受多種因素的影響，尤其是培養(yǎng)基配方、溫度處理、碳源和激素。對(duì)于有些物種，培養(yǎng)前或培養(yǎng)后對(duì)花藥進(jìn)行處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。如大麥花藥，在4。C處理28天能收到最好效果，且認(rèn)為4。C是其最適的處理溫度。而對(duì)洋蔥花蕾進(jìn)行熱激處理后發(fā)現(xiàn)，15。C熱激處理后的胚狀體獲得率相對(duì)l(TC處理的提高了 10倍。另一方面，離體植物細(xì)胞難于合成足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，它們必須依賴于外界碳源才能生存。在單倍體誘導(dǎo)過程中，添加一種合適的碳源對(duì)胚狀體的發(fā)生和植抹再生是十分必要的。目前，最常用的碳源有蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖等，而不同作物不同器官培養(yǎng)最適的碳源來源又是不同的。同時(shí)，在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，除了營養(yǎng)物種之外，為了促進(jìn)組織和器官的生長，在培養(yǎng)基中添加一種或一種以上的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(激素)是必要。植物組織培養(yǎng)常用的激素有生長素和細(xì)胞分裂素兩類。不過，對(duì)這些物質(zhì)的要求因組織的不同而有很大變化，主要取決于組織自身的內(nèi)源激素水平。此外，研究結(jié)果表明，生長素和細(xì)胞分裂素之間的比例決定著植林再生途徑的類型。我們應(yīng)用本發(fā)明的方法，在研究溫度處理、碳源來源和激素配比的基礎(chǔ)上，通過胚狀體發(fā)生途徑在短時(shí)間內(nèi)直接獲得了再生植林。
本實(shí)例就以辣椒'003，作為材料，采用本發(fā)明方法通過胚狀體發(fā)育途徑在40天內(nèi)獲得了胚狀體和再生植抹。實(shí)施過程如下
1. 在盛花期(第一朵雄花盛開后2周)于晴天上午8: 00 ~ 9: OO從健壯植林上取花蕾。采用顯微鏡鏡檢的方法鑒定小孢子發(fā)育時(shí)期，即將花藥從花蕾中剝出，置于載玻片上，滴少許去離子水浸沒花藥，用鑷子輕軋花藥使小孢子游離出來，去除殘留的花藥組織，蓋上蓋玻片，在OLYMPUS顯微鏡下鑒定小孢子發(fā)育時(shí)期。選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期(圖2)的花蕾用于花藥培養(yǎng)。
2. 將小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾置于4。C下低溫預(yù)處理2天。
3. 將花蕾先在醫(yī)用酒精(75%體積分?jǐn)?shù))溶液里浸30秒，然后用0.1%升汞(配制時(shí)取升汞1克加1000毫升蒸鎦水即可得到0.1%的升汞溶液)消毒8分鐘，最
后用無菌水沖洗3次，每次3分鐘。
64. 在無菌濾紙上用無菌的鑷子剝?nèi)』ㄋ?，避免損傷、損壞花藥，并把花絲去除干凈，隨后接種在MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/L萘乙酸(NAA) +1.0mg/L激動(dòng)素(KT) +2^%麥芽糖+0.8\^%瓊脂+0.5^%活性炭的培養(yǎng)基上(圖3-A)。花藥接種后，在35。C下熱激處理8天，后在光照度20001x、光照時(shí)間12h、室溫25。C下繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 培養(yǎng)一周后，離體花藥明顯膨大(圖3-B)。大約三周后，可陸續(xù)觀察到心形胚(圖3-C)、子葉形胚(圖3-D)的出現(xiàn)，隨后胚狀體進(jìn)一步發(fā)育，直至形成根芽葉倶全的完整植4朱(圖3-E)。
權(quán)利要求
1.一種快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植株的方法，其特征在于制備方法為a.選取小孢子處于單核靠邊期的花藥，置于3～5℃低溫下預(yù)處理24～72小時(shí)；b.低溫預(yù)處理后的花蕾用75％酒精和0.1％升汞消毒，最后用無菌水沖洗干凈；c.無菌條件下從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，將花藥接種在MS基本培養(yǎng)基+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/L KT+2wt％麥芽糖+0.8wt％瓊脂+0.5wt％活性炭的培養(yǎng)基上，33～37℃下熱激處理6～10天，后在光照度2000lx、光照時(shí)間12h、室溫25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，直至形成根芽葉俱全的完整植株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植林的方法，其特征在于 花藥接種前預(yù)處理溫度為4°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植林的方法，其特征在于 花藥4秦種前預(yù)處理時(shí)間為48小時(shí)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植林的方法，其特征在于 花藥接種后熱激處理溫度為35°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植抹的方法，其特征在于 花藥接種后熱激處理時(shí)間為8天。
全文摘要
一種快速獲得辣椒花藥培養(yǎng)再生植株的方法，制備方法為選取小孢子處于單核靠邊期的花藥，置于3～5℃低溫下預(yù)處理24～72小時(shí)；低溫預(yù)處理后的花蕾用75％酒精和0.1％升汞消毒，最后用無菌水沖洗干凈；無菌條件下從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，將花藥接種在MS基本培養(yǎng)基+0.5-1.0mg/LNAA+1.0-2.0mg/L KT+2wt％麥芽糖+0.8wt％瓊脂+0.5wt％活性炭的培養(yǎng)基上，33～37℃下熱激處理6～10天，后在光照度2000lx、光照時(shí)間12h、室溫25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，直至形成根芽葉俱全的完整植株。本發(fā)明可在一種培養(yǎng)基上完成花藥膨大、不同類型胚狀體的形成以及再生植株的獲得，從花藥開始培養(yǎng)到再生植株的形成一般需要7周時(shí)間。此項(xiàng)發(fā)明的目的是提供一種通過辣椒花藥培養(yǎng)快速獲得再生植株的方法。該方法可用于辣椒通過花藥培養(yǎng)快速獲得單倍體、雙單倍體等材料。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101622960SQ20091018364
公開日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者刁衛(wèi)平, 劉金兵, 偉 戈, 潘寶貴, 王述彬 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院