一種昆蟲轉(zhuǎn)錄因子在害蟲防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及昆蟲轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在斜紋夜蛾防治中的應(yīng)用，具體涉及Nrf2影響斜 紋夜蛾抗多種殺蟲劑這一功能，從而圍繞Nrf2開展轉(zhuǎn)基因或抑制劑研發(fā)，提尚殺蟲劑的殺 蟲效率，降低化學(xué)殺蟲劑的使用量，達(dá)到高效和環(huán)保進(jìn)行害蟲防治的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 各類化學(xué)殺蟲劑和植物次生物質(zhì)皆可引起昆蟲體內(nèi)氧脅迫。如2007年，Giordano 等人在小鼠小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞中證明有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱能夠引起細(xì)胞內(nèi)R0S水平的 上升，進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化等一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Ahmad等在1995年證實(shí)殺蟲劑二氯 萘醌在模式昆蟲亞熱帶粘蟲中也能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。擬除蟲菊酯類殺蟲劑除了神經(jīng)毒性 外，也能夠引起昆蟲的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
[0003] 活性氧（reactive oxygen species，R0S)是生物體在有氧代謝過程中由氧分子 直接或間接轉(zhuǎn)化而來的，對(duì)生物體有害的一類含氧物，其主要包括超氧陰離子（superoxide anion，0 2 )、過氧化氫（hydrogen peroxide，H202)、單線態(tài)氧（singlet molecular oxygen, l〇2)、輕自由基（hydroxyl radical，HO*)、烷氧基（alkoxyl，RO)和燒過氧基（Peroxyl， R00O等。當(dāng)機(jī)體受到外界有毒物質(zhì)的危害時(shí)，R0S過度積累。過量的過氧化物和自由基 將損害DNA、蛋白質(zhì)、糖類等生物大分子物質(zhì)，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的紊亂、細(xì)胞膜的損 傷、細(xì)胞離子通道的損傷、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至細(xì)胞的死亡。
[0004] 然而在生物體內(nèi)存在著R0S的清除系統(tǒng)(抗氧化酶系統(tǒng)和非酶活性的抗氧化小分 子)，來抵抗活性氧對(duì)生物體的傷害，從而維持機(jī)體氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。其中抗氧化 酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（S0D，將體內(nèi)的超氧化物陰離子0 2轉(zhuǎn)化成H202和02 );過 氧化氫酶（CAT，主要在過氧化物酶體和線粒體中將H202分解成H 20和02);硒依賴谷胱甘肽 過氧化物酶（SeGSH-Px，將H20 2還原為H 20,阻斷H202生成高度活潑的膜過氧化劑H0?，從而 防止細(xì)胞受到羥自由基的傷害)?？寡趸》肿游镔|(zhì)如GSH、胡蘿卜素、視黃醇、維生素 C、維生素E、硫氧還蛋白等也參與R0S的清除。
[0005] 轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 (NF-E2_related factor2, Nrf2)在細(xì)胞抵抗氧脅迫和親電物 質(zhì)中有著重要作用。細(xì)胞在正常狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1)結(jié)合形成復(fù)合物，處于非活性狀態(tài)，并由Keapl介導(dǎo)Nrf2泛素 化降解；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)或受到親電子物質(zhì)刺激時(shí)，Nrf2被激活并從Keapl-Nrf2 復(fù)合物中解離出來，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與Maf形成異質(zhì)二聚體，再與靶基因啟動(dòng)子上抗氧 化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控Nrf2下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。其中，Nrf2的革E1基因包括 過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、醌氧化還原酶、Y _谷氨酸合成酶以及 血紅素加氧酶。特別是一相解毒酶P450和二相解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)在昆蟲 抗藥性中發(fā)揮重要的作用，因而Nrf2在調(diào)控昆蟲抗性基因中起著重要作用。但目前昆蟲 中的該方面研究較少。苯巴比妥米那（phenobarbital, P450抑制劑）通過Nrf2調(diào)控了 一些果繩解毒酶的表達(dá)（Misra JR, Horner MA, Lam G, Thummel CS. Genes Dev. 2011; 25 (17) : 1796-806.);但是，并不清楚Nrf2是否參與農(nóng)業(yè)害蟲抗多種殺蟲劑，并在其中起著 重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明對(duì)中國農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾開展了研究，發(fā)現(xiàn) Nrf2參與昆蟲抗有機(jī)磷和菊酯類化學(xué)殺蟲劑、及多種植物類次生物質(zhì)，其機(jī)理可能是啟動(dòng) 了相應(yīng)的解毒酶，而敲除Nrf2會(huì)增加農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱的敏感性， 蟲體死亡率大大提高。
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供昆蟲Nrf2的抑制劑在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 昆蟲類轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)抑制劑和/或活性抑制劑在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步的，上述轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)抑制劑為能夠使昆蟲基因沉默的物質(zhì)。
[0010] 進(jìn)一步的，上述轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)抑制劑為能夠?qū)ハx基因TVr/2進(jìn)行RNA干涉 的序列。
[0011] 進(jìn)一步的，上述能夠?qū)ハx基因邀行RNA干涉的序列為SEQ ID N0 :2。
[0012] 進(jìn)一步的，上述昆蟲為鱗翅目昆蟲。
[0013] 進(jìn)一步的，上述鱗翅目昆蟲為斜紋夜蛾。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 1) Nrf2是生物體中抗氧脅迫途徑的其中一個(gè)重要的調(diào)控因子，它通過調(diào)控過氧化氫 酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、醌氧化還原酶、Y _谷氨酸合成酶和血紅素加氧 酶等抗氧脅迫酶的表達(dá)，而在生物體抗活性氧中發(fā)揮作用。它在哺乳動(dòng)物中的研究較為詳 細(xì)，有毒物質(zhì)通過受體AHR激發(fā)Nrf2表達(dá)上調(diào)，但是昆蟲至今沒有發(fā)現(xiàn)類似的受體蛋白，而 且昆蟲類的Nrf2序列與哺乳類有差別，因此表達(dá)可能有所不同。目前，昆蟲只有極少的文 章報(bào)道，主要發(fā)現(xiàn)在抗有機(jī)氯殺蟲劑DDT昆蟲中的Nrf2酶活性較高，并沒有進(jìn)行它的功能 研究，同時(shí)由于DDT的劇毒性和不易降解性，農(nóng)業(yè)上已停止使用。所以，Nrf2在昆蟲應(yīng)對(duì)殺 蟲劑中的真正作用并不清楚。本發(fā)明中，采用RNAi技術(shù)敲除斜紋夜蛾體內(nèi)Nrf2,發(fā)現(xiàn)斜紋 夜蛾對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱的敏感性增加，死亡率增加。因此，在應(yīng)用上，可以根據(jù)Nrf2的 結(jié)構(gòu)篩選其抑制劑或轉(zhuǎn)基因植物獲得其dsRNA，作為殺蟲劑的增效劑而提高殺蟲劑的殺蟲 效率，降低對(duì)環(huán)境不友好的化學(xué)殺蟲劑的使用劑量。
[0015] 2)本發(fā)明表明，斜紋夜蛾Nrf2除了響應(yīng)毒死蜱外，還響應(yīng)菊酯類殺蟲劑，和不同 類型植物次生物質(zhì)，包括吲哚-3-甲醇，呋喃類花椒毒素和蒽酮類魚藤酮等，并且Nrf2調(diào)控 參與解毒這些物質(zhì)的解毒酶，比如Slgstel，基因被證明是斜紋夜蛾取食植物的重 要解毒酶，敲除該基因，斜紋夜蛾不能爬行取食，生長(zhǎng)減緩；同時(shí)可響應(yīng)多種殺蟲劑而表達(dá) 增加，并對(duì)多種殺蟲劑具有解毒作用。因此，Nrf2同樣影響斜紋夜蛾應(yīng)對(duì)其他殺蟲劑和植 物(含植物次生物質(zhì)），由于植物次生物質(zhì)對(duì)昆蟲的毒性偏低，雖然具有安全性，但由于殺蟲 效率低而不能大規(guī)模應(yīng)用。因此可根據(jù)Nrf2開發(fā)殺蟲劑增效劑，提高植物源殺蟲劑殺蟲 率。
[0016] 3)由于人類、哺乳類和昆蟲類的Nrf2序列的相似性不高，本發(fā)明所用的dsRNA在 人類基因組中沒有相應(yīng)的序列，因此利用該序列進(jìn)行RNAi，將對(duì)人等動(dòng)物無害。
【附圖說明】
[0017] 圖1為毒死蜱處理24 h后各組處理的斜紋夜蛾生長(zhǎng)情況； 圖2為不同殺蟲劑對(duì)Nrf2表達(dá)的誘導(dǎo)作用，xanthotoxin為花椒毒素、DMS0作為對(duì) 照處理；indole-3-carbinol為植物次生物質(zhì)吲噪-3甲醇、rotenone為植物源殺蟲劑魚 藤酮、chlorpyrifos為有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱、deltamethrin為菊酯類殺蟲劑溴氰菊酯、 acetone丙酮作為對(duì)照(溶劑）處理；內(nèi)參為GAPDH; 圖3為不同殺蟲劑對(duì)解毒酶P450基因份表達(dá)的誘導(dǎo)作用，xanthotoxin為花 椒毒素、DMS0作為對(duì)照處理；indole-3-carbinol為植物次生物質(zhì)吲噪-3甲醇、rotenone 為植物源殺蟲劑魚藤酮、chlorpyrifos為有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱、deltamethrin為菊酯類殺 蟲劑溴氰菊酯、acetone丙酮作為對(duì)照處理；內(nèi)參為GAPDH ; 圖4為不同殺蟲劑對(duì)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，xanthotoxin為 花椒毒素、DMS0作為對(duì)照處理；indole-3-carbinol為吲噪-3甲醇、rotenone為植物源殺 蟲劑魚藤酮、chlorpyrifos為有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱、deltamethrin為菊酯類殺蟲劑溴氰菊 酯、acetone丙酮作為對(duì)照處理；內(nèi)參為GAPDH ; 圖5為Nrf2蛋白與gstel啟動(dòng)子上的相應(yīng)調(diào)控元件ARE的凝膠迀移實(shí)驗(yàn)EMSA結(jié)果， 圖中探針為gstel啟動(dòng)子上的調(diào)控元件ARE序列，采用生物素標(biāo)記以及非標(biāo)記探針進(jìn)行競(jìng) 爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)來證明結(jié)合的專一性； 圖6為100 yM的不同類型殺蟲劑對(duì)S1GSTE1酶活性的抑制作用；其中control為 1-氯-2, 4-二硝基苯，chlorpyrifos為有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱、Malathion為馬拉硫磷、 Phoxim為辛硫磷、Deltamethrin為菊酯類的溴氰菊酯、DDT為有機(jī)氯類的DDT。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0019] 實(shí)施例1抑制Nrf2表達(dá)的斜紋夜蛾幼蟲對(duì)殺蟲劑更敏感 1)斜紋夜蛾Nrf2dsRNA的合成 根據(jù)試劑盒T7 RiboMAX?ExpressRNAiSystem(購自Promega公司）的說明書分別 合成斜紋夜蛾Nrf2和GFP的dsRNA，用于后續(xù)的RNAi實(shí)驗(yàn)。
[0020] 斜紋夜蛾 Nrf2 cDNA 序列為（SEQ ID N0 :1):

[0021] 2)Nrf2 RNAi后斜紋夜蛾的表型以及對(duì)毒死蜱（CPF)處理的反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)分為 4 組，即 GFP RNAi(對(duì)照組)、Nrf2 RNAi、GFP RNAi+CPF