石斛蘭快速繁殖成苗的培養(yǎng)基系列及組培方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及藥用植物種苗的繁殖方法，具體來說涉及一種石斛蘭快速繁殖培養(yǎng)基系列以及組培方法。
【背景技術】
[0002]石斛蘭種子細如粉塵，一個蒴果內所含種子達100萬粒之多。由于缺乏胚乳，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，自然條件下萌發(fā)率非常低(不足5% )。石斛蘭自然繁殖力極低，常規(guī)繁殖又較困難，且多年來對石斛蘭的采集量遠大于其生長量，野生石斛蘭自然繁殖已瀕臨絕跡。為發(fā)展人工栽培滿足市場需求，藥用石斛中的一些珍貴品種已成為目前組織快繁研究的重點。
[0003]目前關于石斛蘭的組織培養(yǎng)研究已經(jīng)有相關報道，但是組織培養(yǎng)所需的成本過高和試管成苗周期長的問題是制約石斛蘭產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)的瓶頸。因此亟需一種能快速繁殖石斛蘭的組織培養(yǎng)體系，為推廣人工培植技術和大規(guī)模工廠化育苗奠定理論與實踐基礎。

【發(fā)明內容】

[0004]為解決上述現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明從石斛蘭種子培養(yǎng)入手，對石斛蘭組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分，通過多年的實驗摸索發(fā)現(xiàn)，能快速繁殖石斛蘭且能夠周年生產(chǎn)的組織培養(yǎng)體系，為工廠化育苗提供技術支撐。該石斛蘭快速繁殖培養(yǎng)基系列能夠明顯提高石斛蘭種子的萌發(fā)時間，從傳統(tǒng)的75天左右的時間直接縮短為14-23天，并且野生種子萌發(fā)率高達96.3-97.86 %，石斛蘭組培苗移栽成活率高達98 %。
[0005]本發(fā)明提出一種石斛蘭快速繁殖培養(yǎng)基系列，其技術方案是這樣實現(xiàn)的:
[0006]—種石斛蘭快速繁殖成苗的培養(yǎng)基系列，該培養(yǎng)基系列包括播種培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基各組成成分含量分別為:
[0007]播種培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20毫升L液體、8毫升Ml液體、380-420g蔗糖、74-78g瓊脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0008]增殖培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、8暈升Ml液體、5暈升M2液體、380_420g鹿糖、74_78g瓊脂、34_38g碳粉、1900-2100g 土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0009]壯苗培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、15暈升Ml液體、10暈升M2液體、380_420g鹿糖、74_78g瓊脂、38_42g碳粉、1900-2100g 土豆、蘋果或者香蕉與10升水；
[0010]生根培養(yǎng)基:1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、20暈升Ml液體、10暈升M2液體、480_520g鹿糖、74_78g瓊脂、38_42g碳粉、2400-2600g 土豆或者香蕉與10升水；
[0011 ] 其中，所述A液體、B液體、C液體、D液體、L液體、Ml液體與M2液體中元素組成分別為:
[0012]A液體:18.5g/L硝酸錢、19.0g/L硝酸鉀、4.7g/L硫酸鎂與1.9g/L磷酸二氫鉀；
[0013]B液體:4.4g/L氯化鈣；
[0014]C液體:0.5g/L甘氨酸、0.05g/L維生素BU0.5g/L煙酸、0.lg/L鹽酸比哆辛VB6與40g/L肌醇；
[0015]D液體:5.79g/L硫酸亞鐵與7.68g/L乙二胺四乙酸二鈉；
[0016]L液體:18.9g/L硫酸錳、8.6g/L硫酸鋅、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化鉀、0.25g/L硫酸銅、0.25g/L氯化鈷與0.25g/L鉬酸鈉；
[0017]Ml液體:0.5g/La—奈乙酸與0.4g/L氫氧化鈉；
[0018]M2液體:0.5g/L 6_芐基腺嘌呤與0.45g/L氫氧化鈉。
[0019]進一步，所述播種培養(yǎng)基的pH值為5.4-5.8，用酸堿調節(jié)劑調節(jié)所述播種培養(yǎng)基的pH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調節(jié)；所述增殖培養(yǎng)基的pH值為5.4-5.8，用酸堿調節(jié)劑調節(jié)所述增殖培養(yǎng)基的pH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調節(jié)；所述壯苗培養(yǎng)基的PH值為5.4-5.8，用酸堿調節(jié)劑調節(jié)所述壯苗培養(yǎng)基的PH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調節(jié)；所述生根苗培養(yǎng)基的PH值為5.4-5.8，用酸堿調節(jié)劑調節(jié)所述生根苗培養(yǎng)基的pH值，即培養(yǎng)基發(fā)黃則添加氫氧化鈉調節(jié)，發(fā)黑則添加鹽酸調節(jié)。
[0020]進一步，所述培養(yǎng)基及所述A液體、B液體、C液體、D液體、L液體、Ml液體與M2液體中所用的水均為礦泉水。
[0021]本發(fā)明還公開了使用上述培養(yǎng)基系列由石斛蘭快速繁殖成苗的組培方法，其步驟如下:
[0022]⑴石斛蘭種子的無菌萌發(fā)
[0023]采集石斛蘭蒴果種子，依次用酒精與次氯酸鈉溶液進行消毒滅菌，將滅菌后的種子的一端將其切開，將粉末狀胚均勻的播撒到播種培養(yǎng)基上，在有光照的組培室培養(yǎng)14-23天，萌發(fā)的種子形成原球莖，保持組培室溫度在22-25°C ;
[0024]⑵石斛蘭原球莖的增殖
[0025]將種子萌發(fā)形成的原球莖均勻轉入到增殖培養(yǎng)基中，置于組培室進行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，原球莖長出淡黃色愈傷組織，22-27天，愈傷組織不斷分離增殖成類原球莖；
[0026]⑶石斛蘭類原球莖的壯苗
[0027]將類原球莖挑出并均勻轉入壯苗培養(yǎng)基中，置于組培室進行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，32-45天，成長為長勢良好的石斛蘭大苗；
[0028]⑷石斛蘭大苗的生根
[0029]將大苗放置在預先消毒過的大培養(yǎng)皿上，并把大苗插入到生根培養(yǎng)基中，置于組培室進行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，32-60天，大苗成長為完整的石斛蘭組培苗。
[0030]本發(fā)明的有益效果:
[0031]本發(fā)明通過對播種培養(yǎng)基組分調節(jié)，使得通過該培養(yǎng)基播種的石斛蘭種子無需經(jīng)過黑暗培養(yǎng)時間，直接進行光照處理，14-23天萌發(fā)的種子形成原球莖，萌發(fā)率達到96.3-97.86% ;進一步，對增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基的組分調整，使得生長出來的石斛蘭組培苗健壯，移栽成活率高達98%。生根培養(yǎng)基優(yōu)選采用香蕉，使用香蕉的生根培養(yǎng)基成苗時間為32-45天，而使用土豆的生根培養(yǎng)基成苗時間為46-60天。
【附圖說明】
[0032]圖1為石斛蘭原球莖照片；
[0033]圖2為石斛蘭類原球莖照片；
[0034]圖3為石斛蘭組培苗照片。
【具體實施方式】
[0035]實施例1
[0036]配制A液體:稱取硝酸錢18.5g、硝酸鉀19.0g、硫酸鎂4.7g、磷酸二氫鉀1.9g，然后加入IL水中混勻溶解，即可。
[0037]配制B液體:稱取氯化鈣4.4g，然后放入IL水中混勻溶解，即可。
[0038]配制C液體:稱取甘氨酸0.4g、0.05g維生素B1、煙酸0.5g與0.1g鹽酸比哆辛VB6加入600ml水中混勻溶解得到混合液I，再稱取40g肌醇用400ml水混勻溶解得到混合液II，將混合液I與混合液II混合即可。
[0039]配制D液體:稱取5.79g硫酸亞鐵與7.68g乙二胺四乙酸二鈉，用水分別溶解后，再混勻配制成IL溶液。
[0040]配制L液體:稱取18.9g/L硫酸錳、8.6g/L硫酸鋅、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化鉀、0.25g/L硫酸銅與0.25g/L氯化鈷用水溶解，再稱取0.25g鉬酸鈉用水溶解，再將兩種溶液混合均勻加水配制成IL溶液。
[0041]配制Ml液體:稱取0.5g/La—奈乙酸與0.4g/L氫氧化鈉，用IL水配制成溶液，放入冰箱保存；
[0042]配制M2液體:稱取0.5g/L 6_芐基腺嘌呤與0.45g/L氫氧化鈉，用IL水配制成溶液，避光保存。
[0043]配制播種培養(yǎng)基:稱取1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20毫升L液體與8毫升Ml液體混勻，然后加入400g蔗糖、76g瓊脂、36g碳粉與2000g經(jīng)粉碎的土豆，再加10升水高溫加熱，隨后在80°C下混合，裝瓶，進行高壓滅菌鍋滅菌，冷卻即可。
[0044]配制增殖培養(yǎng)基:稱取1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20暈升L液體、8暈升Ml液體與5暈升M2液體混勾，然后加入400g鹿糖、76g瓊脂、36g碳粉與2000g經(jīng)粉碎的土豆，再加10升水高溫加熱，隨后在80°C下混合，裝瓶，進行高壓滅菌鍋滅菌，冷卻即可。
[0045]配制壯苗培養(yǎng)基:稱取1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20毫升L液體、15毫升Ml液體與10毫升M2液體混勻、然后加入400g蔗糖、76g瓊脂、40g碳粉與2000g經(jīng)粉碎的土豆，再加10升水高溫加熱，隨后在80°C下混合，裝瓶，進行高壓滅菌鍋滅菌，冷卻即可。
[0046]配制生根培養(yǎng)基:稱取1000暈升A液體、1000暈升B液體、100暈升C液體、100暈升D液體、20毫升L液體、20毫升Ml液體與10毫升M2液體混勻，然后加入500g蔗糖、76g瓊脂、40g碳粉與2500g經(jīng)粉碎的香蕉，再加10升水高溫加熱，隨后在80°C下混合，裝瓶，進行高壓滅菌鍋滅菌，冷卻即可。
[0047]石斛蘭快速繁殖成苗的組培方法，其步驟如下:
[0048]⑴石斛蘭種子的無菌萌發(fā)
[0049]采集石斛蘭蒴果種子，依次用酒精與次氯酸鈉溶液進行消毒滅菌，將滅菌后的種子的一端將其切開，將粉末狀胚均勻的播撒到播種培養(yǎng)基上，在有光照的組培室培養(yǎng)14天，萌發(fā)的種子就形成原球莖(參見圖1)，保持組培室溫度在22-25°C;根據(jù)瓶數(shù)計算，萌發(fā)率達到97.86%。
[0050]⑵石斛蘭原球莖的增殖
[0051]將種子萌發(fā)形成的原球莖均勻轉入到增殖培養(yǎng)基中，置于組培室進行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，原球莖長出淡黃色愈傷組織，22天，愈傷組織不斷分離增殖成類原球莖(參見圖2);
[0052]⑶石斛蘭類原球莖的壯苗
[0053]將類原球莖挑出并均勻轉入到壯苗培養(yǎng)基中，置于組培室進行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25°C，32天，類原球莖成長為長勢良好的石斛蘭大苗；
[0054]⑷石斛蘭大苗的生根
[0055]將大苗放置在預先消毒過的大培養(yǎng)皿上，并把大苗插入到生根培養(yǎng)基中，置于組培室進行光照培養(yǎng)，保持組培室溫度在22-25 °C，32天，大苗成長為完整的石斛蘭組培苗(參見圖3) ο
[0056]將石斛蘭組培苗在自然光下煉苗一周后取出瓶苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土和苔蘚體積比為1:1的混合基質中，成活率在98