一種白接骨的組織培養(yǎng)快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組培快速繁殖技術領域，具體涉及白接骨的組培快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002]白接骨[Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau]為爵床科(Acanthaceae)白接骨屬多年生草本植物，分布于江蘇、浙江、安徽、江西、福建、廣東、廣西、湖南(?￡江、大庸、永順、宜章)、湖北、云南、貴州、重慶、四川等地，生林下或溪邊。全草入藥，名白接骨、玉龍盤、無骨苧麻、玉梗半枝蓮、玉接骨、血見愁、玉錢草、麒麟草、玉連環(huán)、接骨草、猢猻節(jié)根、金不換、橡皮草、華可西達、小阿西達、蛀木蟲等。夏、秋季采收，曬干或鮮用。性涼，味苦、淡，入肺經(jīng)。具化瘀止血、續(xù)筋接骨、利尿消腫、清熱解毒之功效，主治吐血、便血、外傷出血、跌打瘀腫、扭傷骨折、風濕肢腫、腹水、瘡瘍潰爛、癤腫、咽喉腫痛等癥。其花可僅觀賞用。在中國，該屬僅白接骨[Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau] 一個種。白接骨的自然繁殖主要靠種子和根狀莖，其中每個果實僅含4粒種子，靠自然繁殖顯然不能達到大量繁殖的目的。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是:針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種白接骨的組織培養(yǎng)快速繁殖方法。
[0004]為實現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用以下技術方案予以實現(xiàn):一種白接骨的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括以下步驟:
①叢生芽的誘導:3月取材的外植體在添加了6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的的MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)到芽長3 cm時取出，沿著莖切將兩側腋芽分開，然后轉移接種于第一 MS基本培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25± I) 0C，光照時間為14 h光/10 h 暗，光照強度 30.1-40 μ mol/ (m2.s)；
所述的第一 MS基本培養(yǎng)基添加了:
6-BA 0.1-3.0 mg/L+NAA 0.1-1.0 mg/L,
6-BA 0.1-3.0 mg/L+1AA 0.1-3.0 mg/L、
6-BA 0.1-3.0 mg/L +TDZ 0.1-2.0 mg/L、
6-BA 0.1-3.0 mg/L +ZT 0.1-2.0 mg/L、
ZT 0.1-2.0 mg/L+NAA 0.1-1.0 mg/L,
ZT 0.1-2.0 mg/L+IAA 0.1-3.0 mg/L 或TDZ 0.1-2.0 mg/L+NAA 0.1-1.0 mg/L ；
②不定芽的增殖生長:將上步誘導產(chǎn)生的叢生芽切成2-3個一組，轉接于第二MS基本培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室光照培養(yǎng)；
所述的第二 MS基本培養(yǎng)基添加了:
6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1-1.0mg/L、
6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IBA 0.1-1.0 mg/L 或6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IAA0.1-3.0 mg/L ；
③不定芽的生根培養(yǎng):將上步增殖培養(yǎng)獲得的不定芽叢切成單個不定芽，轉接到添加了 NAA 0.1-1.0 mg/L,IAA 0.1-3.0 mg/L 或 IBA 0.1-1.0 mg/L 的 1/4 強度的 MS 基本培養(yǎng)基中；
④再生苗的煉苗和移栽:將上步完成生根培養(yǎng)的不定芽的培養(yǎng)瓶打開一條縫，讓其與外部空氣相通，6 h后半開瓶蓋，加入少量無菌水以保持培養(yǎng)基的濕潤，過Id后完全打開瓶蓋，讓它完全接受培養(yǎng)室的日光燈管的直接光照2d后將培養(yǎng)基搗碎，小心取出帶少量瓊脂的再生苗植株，在緩慢流水中用軟刷仔細清洗根部沾有的瓊脂塊，將清洗干凈的再生苗植株移栽至添加蛭石的消毒土中，在培養(yǎng)容器上罩以聚乙烯塑料薄膜以保持培養(yǎng)容器的濕度，培養(yǎng)容器置于陰涼地，5天即可揭開塑料蒲膜，于陰涼處培養(yǎng)7d后移至大田。
[0005]作為優(yōu)選方案:所述的第一 MS基本培養(yǎng)基添加了 6-BA 0-3.0 mg/L +ZT 0-2.0mg/L ο
[0006]作為優(yōu)選方案:所述的第二 MS基本培養(yǎng)基添加了:6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L,6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IAA 1.5 mg/L或6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5mg/L+IBA 0.3 mg/L。
[0007]與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明的有益效果是:采用本發(fā)明的方法，能夠快速地獲得白接骨再生苗植株，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明方法，白接骨叢生芽的誘導率高達91.5%，不定芽增殖率可達6.1，植株移栽成活率可達98.3%以上。
【具體實施方式】
[0008]外植體取樣時間的選擇:于無雨的上午，選取3-11月的白接骨莖，剪成帶腋芽的莖段，先留約2cm的葉柄，先用軟毛刷于自來水下輕柔刷洗，加入適量的洗潔精溶液浸泡2-4 min，用流水沖洗0.5 h后，在超凈臺里將莖段轉入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次，浸入滴加有5滴吐溫-80的0.1% HgCl2S液內浸泡消毒9-10 min,無菌水沖洗3次后插入到添加6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的MS基本培養(yǎng)基(滅菌前用I mol/LNaOH或HCl調節(jié)pH至5.8-6.0，鹿糖3%，瓊脂0.8%，于121 °C下滅菌20 min)中，置于黑暗中2 d，隨后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25±1) °C，光照時間為14 h光/10 h暗，光照強度30-40 μ mol/(m2.S)。15 d統(tǒng)計污染率和腋芽啟動(即腋芽恢復生長)率。結果表明，污染率介于3-24%，腋芽啟動率介于42-90%之間，其中以3月取材的、腋芽尚未長出明顯葉片的外植體的污染率和腋芽啟動率最高，分別為3%和90% ;11月取材的外植體腋芽啟動率最低(42%)，因為此時地上部開始死亡，故在以下實施例中均選取3月份的白接骨莖段進行叢生芽的誘導。
[0009]實施例1
一種白接骨的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括以下步驟:
①叢生芽的誘導:3月取材的外植體在添加了 6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)到芽長3 cm時取出，沿著莖切將兩側腋芽分開，然后轉移接種于第一 MS基本培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25±1) °C，光照時間為14 h光/10h暗(14小時光照培養(yǎng)，10小時黑暗中培養(yǎng)循環(huán)交替)，光照強度30.1-40 μ mol/(m2.s)；所述的第一 MS基本培養(yǎng)基添加了:6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L ;叢生芽誘導率為91.5%，平均不定芽數(shù)為6.3個。
[0010]②不定芽的增殖生長:將上步誘導產(chǎn)生的叢生芽切成2-3個一組，轉接于第二 MS基本培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室光照培養(yǎng)；
所述的第二MS基本培養(yǎng)基添加了:6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L，在培養(yǎng)30 d后不定芽的長度可超過3 cm，葉色正常，葉片較大，不定芽增殖的倍數(shù)達到6.1。
[0011]③不定芽的生根培養(yǎng):將上步增殖培養(yǎng)獲得的不定芽叢切成單個不定芽，轉接到添加了 IBA 0.1-1.0 mg/L的1/4強度的MS基本培養(yǎng)基中(1/4強度指的是MS基本培養(yǎng)基中各組分均是原配方濃度至1/4濃度);生根最早于轉接后10 d發(fā)生，但大量發(fā)生則為轉接后15-18 d，于轉接30 d后統(tǒng)計生根率，生根率為達到94.3%。
[0012]④再生苗的煉苗和移栽:將上步完成生根培養(yǎng)的不定芽的培養(yǎng)瓶打開一條縫，讓其與外部空氣相通，6 h后半開瓶蓋，加入少量無菌水以保持培養(yǎng)基的濕潤，過Id后完全打開瓶蓋，讓它完全接受培養(yǎng)室的日光燈管的直接光照2d后將培養(yǎng)基搗碎，小心取出帶