一種鐵皮石斛組培快繁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及鐵皮石斛組培快繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛，為蘭科多年生附生草本植物。生于海拔達(dá)1600米的山地半陰濕的巖石 上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，不耐寒。一般均能耐一 5°C的低溫。石斛可分為黃 草、金釵、馬鞭等數(shù)十種，鐵皮石斛為石斛之極品，它因表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有 獨特的藥用價值，以其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥。野生鐵皮石斛的自然繁殖能力低、生 長緩慢，對生長的環(huán)境條件要求苛刻。在引種栽培時較難成活，給種質(zhì)保存與利用帶來較大 的困難。因此找出一種種質(zhì)資源保護(hù)的有效新途徑，對鐵皮石斛資源的修復(fù)和再生，防止流 失、退化和滅絕，保障資源的可持續(xù)利用具有重要意義。
[0003] 組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)是培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件，同一屬不同種的植物其培養(yǎng)條件也 不盡相同，不同的外植體其培養(yǎng)條件也不相同，因此對其外植體的選擇及培養(yǎng)條件的選擇 具有十分重要的意義。
[0004] 盡管鐵皮石斛的組織培養(yǎng)獲得了較大的成功，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行鐵皮石斛種 苗的快速繁育已沒有很大的技術(shù)問題，但市場需要往往與生產(chǎn)情況不一致，如何使生產(chǎn) 適合市場，是組培技術(shù)成功運用于生產(chǎn)、并取得較高經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。
[0005] 目前對于鐵皮石斛的組培快繁的研宄比較多，但大部分采用的外植體是種子、花 瓣、莖尖或帶腋芽的幼莖，也有采用成熟的種胚的研宄，對于利用花藥作為外植體進(jìn)行培養(yǎng) 的研宄還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種鐵皮石斛組培快繁方法，采用花藥作為外植體，可以有 效的克服后代易變異的問題，可以長期保持其優(yōu)良的性狀，并且出愈率高。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案： 一種鐵皮石斛組培快繁的方法，包括如下步驟： (1) 外植體的選擇與消毒：用70%濃度的酒精將手擦洗兩遍，然后取單核靠邊期的花藥 進(jìn)行消毒處理，將花藥用無菌紗布包裹浸入70%濃度的酒精中消毒10~20s，再浸入10%漂 白粉中浸泡l〇min，最后用無菌水沖洗]-3次； (2) 接種培養(yǎng)：將經(jīng)過處理的花粉接種到接種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得愈傷組織或直接分化 出叢生芽；所述的接種培養(yǎng)基為：MS + 6-BA 0. 1~0. 4mg/L + NAA l~3mg/L+水解酪蛋白0. 4~0. 8g/L，添加4%蔗糖和1%瓊脂；培養(yǎng)基的PH為6.0,培養(yǎng)溫度為25±l°C，12h/d的 光周期，光照強度1600Lx ; (3) 繼代分化培養(yǎng)：將未污染的愈傷組織或叢生芽轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中使芽增殖，繼 代3次，轉(zhuǎn)入第二繼代分化培養(yǎng)基或不添加任何激素的空白培養(yǎng)基中繼代一次，然后再轉(zhuǎn) 入第一繼代分化培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，根據(jù)需苗量重復(fù)上述步驟；所述的繼代分化培養(yǎng)基為： MS+6-BA0. 5~L Omg/L+ ZIU 1~(λ 5mg/L，添加5%蔗糖和1%瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為6,培養(yǎng) 溫度為24~28°C，光照強度1400~20001χ，光照時間為12~14小時/天； (4)生根培養(yǎng)：經(jīng)25~35天，叢生芽長至2~3cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)1個月后，長成具 根和4~6片葉的試管苗；所述的生根培養(yǎng)基為：MS+NAA0. 1~0. 4mg/L+IAA0. 1~0. 3mg/L，添加 4%蔗糖和0. 5%瓊脂；所述培養(yǎng)基的pH值為6,溫度為22~25° C，光照強度2600~28001x， 光照時間為12~14小時/天。
[0008] 上述培養(yǎng)過程是在錐形瓶中進(jìn)行，為了解決錐形瓶消毒不徹底的問題，本發(fā)明 首先將其加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，再將其放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行消毒處理 10~20分鐘，這樣對于一些難以去除的真菌微生物等，殺菌更加徹底，并且無殘留和毒副作 用，此方法也適用于其他植物的組培快繁所用器皿的消毒。
[0009] 所述中藥消毒液由以下重量比的物質(zhì)組成：苦參7~10份、野菊花3~5份、魚 腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份、黃柏6~8份；將上述藥材粉碎，混合后投入 沸蒸餾水中進(jìn)行浸泡20~30min，然后加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續(xù)煮30~50 分鐘，后過濾，沉淀1~2小時后取澄清液即可。
[0010] 為了證明本發(fā)明的有效性，本發(fā)明進(jìn)行了一系列的實驗，具體如下： (一） 外植體的選擇 將采收的花藥、成熟的種胚、莖尖、花瓣分別作為外植體進(jìn)行對比，分別在合適的季節(jié) 進(jìn)行采收，采收后馬上進(jìn)行操作，其余條件相同，并且按照本發(fā)明的步驟進(jìn)行，見表1，從對 比可以看出，莖尖和成熟的種胚都可以作為鐵皮石斛組織培養(yǎng)的材料，但是其愈傷組織的 誘導(dǎo)率和生根率相對較低，并且變異率相對較高，采用花藥作為外植體，不僅愈傷組織的誘 導(dǎo)率和生根率最高，分別可以達(dá)到82%、92%，而且經(jīng)過5代繼代培養(yǎng)沒有產(chǎn)生變異，可以解 決鐵皮石斛繁殖過程中容易出現(xiàn)變異的難題。
[0011] 表1不同外植體對比
【主權(quán)項】
1. 一種鐵皮石斛組培快繁的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 外植體的選擇與消毒：用70%濃度的酒精將手擦洗兩遍，然后取單核靠邊期的花藥 進(jìn)行消毒處理，將花藥用無菌紗布包裹浸入70%濃度的酒精中消毒10~20s，再浸入10%漂 白粉中浸泡l〇min，最后用無菌水沖洗]-3次； (2) 接種培養(yǎng)：將經(jīng)過處理的花粉接種到接種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得愈傷組織或直接分化 出叢生芽；所述的接種培養(yǎng)基為：MS+ 6-BA0. 1~0. 4mg/L+NAAl~3mg/L+水解酪蛋白0. 4~0. 8g/L，添加4%蔗糖和1%瓊脂；培養(yǎng)基的PH為6.0,培養(yǎng)溫度為25±l°C，12h/d的 光周期，光照強度1600Lx; (3) 繼代分化培養(yǎng)：將未污染的愈傷組織或叢生芽轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中使芽增殖，繼 代3次，轉(zhuǎn)入第二繼代分化培養(yǎng)基或不添加任何激素的空白培養(yǎng)基中繼代一次，然后再轉(zhuǎn) 入第一繼代分化培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，根據(jù)需苗量重復(fù)上述步驟；所述的繼代分化培養(yǎng)基為： MS+6-BA0. 5~1. Omg/L+ ZTO. 1~0. 5mg/L，添加5%蔗糖和1%瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為6,培養(yǎng) 溫度為24~28°C，光照強度1400~20001X，光照時間為12~14小時/天； (4) 生根培養(yǎng)：經(jīng)25~35天，叢生芽長至2~3cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月后，長成 具根和4~6片葉的試管苗；所述的生根培養(yǎng)基為：MS+NAA0. 1~0. 4mg/L+IAA0. 1~0. 3mg/L，添 加4%蔗糖和0. 5%瓊脂；所述培養(yǎng)基的pH值為6,溫度為22~25°C，光照強度2600~28001x， 光照時間為12~14小時/天。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鐵皮石斛組培快繁的方法，其特征在于，上述培養(yǎng)過程 是在錐形瓶中進(jìn)行，所述的錐形瓶在使用前要對其進(jìn)行消毒處理，首先將其加入中藥消毒 液消毒10~30分鐘，再將其放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行消毒處理10~20分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鐵皮石斛組培快繁的方法，其特征在于，所述中藥消 毒液由以下重量比的物質(zhì)組成：苦參7~10份、野菊花3~5份、魚腥草3~5份、大黃 5~10份、甘草5~10份、黃柏6~8份；將上述藥材粉碎，混合后投入沸蒸餾水中進(jìn)行浸泡 20~30min，然后加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續(xù)煮30~50分鐘，后過濾，沉淀1~ 2小時后取澄清液即可。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛組培快繁的方法，選擇單核靠邊期的花藥作為外植體，對接種培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，篩選出適合花藥作為外植體進(jìn)行鐵皮石斛組培快繁的培養(yǎng)條件，繼代培養(yǎng)后變異性小，可以長期保持其優(yōu)良的性狀，并且出愈率高。并且本發(fā)明對其消毒方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用中藥消毒加高溫消毒相結(jié)合的方法，可以徹底殺除微生物，有效解決了污染的問題。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104813931
【申請?zhí)枴緾N201510105980
【發(fā)明人】蔣瑛倩
【申請人】常州展華機器人有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年3月11日