一種見血青再生及快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于瀕危野生植物中重要植物材料的快速繁殖方法，特別是涉及一種見血青再生及快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]見血青(Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.)，又名脈羊耳蒜，另丨」名毛慈葫、脈羊耳蘭，蘭科(Orchidaceae)羊耳蒜屬(Liparis) I?2年生草本植物，見血青味苦，性涼，用于肺熱咳血，吐血、腸風(fēng)下血，血崩，肺熱咳嗽，驚風(fēng)等以及外用于刨傷出血，跌打損傷，皮炎，瘡癤腫毒，蛇毒咬傷。見血青多糖和總生物堿具有較好的抗氧化性和抑菌效果，不僅對(duì)細(xì)菌有抑制作用，對(duì)真菌也有較強(qiáng)抑制作用。全草含見血青堿(nervosine)，在《民間常用草藥匯編》、《浙江民間常用草藥》、南川《常用中草藥手冊(cè)》、《四川常用中草藥》、《貴州藥植目錄》等書中均有記載，是一種民間常用中草藥，為國家二級(jí)保護(hù)植物。見血青種子沒有營(yíng)養(yǎng)體，在自然環(huán)境下發(fā)芽率極低、生根難(見血青在第一年秋季就已經(jīng)開始萌芽，但直到年5月上句開始才觀察到有新根生出，并持續(xù)到7月下旬)、生長(zhǎng)緩慢(第一年9月上旬開始在當(dāng)年生植株第一圈脫落苞片的落痕處出現(xiàn)心形的芽苞，此后雖然不斷增長(zhǎng)，但生長(zhǎng)量一直不大，到翌年4月中旬方才進(jìn)入.快速生長(zhǎng)時(shí)期)加上人為過度采收，野生資源遭破壞日益嚴(yán)重已經(jīng)面臨枯竭。采用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，有助于解決資源匱乏、緩解野生資源遭受嚴(yán)重破壞的壓力，以有效地保護(hù)有限的野生資源，為規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。有關(guān)見血青植株再生及快速繁殖技術(shù)未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中種子自身沒有營(yíng)養(yǎng)體在自然環(huán)境下發(fā)芽率低、生根難、生長(zhǎng)緩慢的問題，本發(fā)明提供了一種見血青再生及快速繁殖方法，為規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。
[0004]本發(fā)明的方法是以如下方式實(shí)現(xiàn)的:
1.一種見血青再生及快速繁殖方法，其具體步驟如下
O材料選取與消毒:從見血青基部剪取3~10cm的新芽，用流水將新芽上泥土沖洗干凈，然后剪去新芽上葉片后進(jìn)行消毒，消毒完成后進(jìn)行接種。
[0005]2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)消毒處理后的材料，切成帶I?2個(gè)節(jié)點(diǎn)、長(zhǎng)I?2cm的莖段平放接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1000?15001x ；
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)，所得到的生長(zhǎng)良好的叢生芽切成長(zhǎng)2.0?2.5 cm，接種在增殖培養(yǎng)基中，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1500?18001x ；
4)誘導(dǎo)生根:將增殖培養(yǎng)出來的帶有葉2?3片，株高4?5cm的無根幼苗單株切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中；光照時(shí)間llh/d，光照強(qiáng)度1500?20001x ；
5)移栽:當(dāng)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)試管苗生長(zhǎng)至高5?6cm，根3?5條，葉3?5片，葉長(zhǎng)2?3cm時(shí)，將試管苗放在自然光下煉苗4?6天，再打開瓶蓋煉苗1-2天，然后從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)苗，洗去附著在根系上的培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，保濕遮陰(溫度控制在15?35°C，濕度應(yīng)保持在75%?85%，避免陽光直射)，獲得生長(zhǎng)健壯的完整再生植株。
[0006]2.上述方法涉及的培養(yǎng)基:
1)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT+0.3mg/LNAA+ 0.5mg/LZE I g.171花寶 I 號(hào) +25 g /L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L_1Ac+20 g.I71 香蕉 +30 g.I71 土豆，pH 值為5.6 ；
2)增殖培養(yǎng)基MS+3.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+ 0.5mg/LNAA + 1.0mg/LZE+ 2 g 參廠1花寶 I 號(hào) +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L-1Ac+ 20 g.I71 香蕉 +30 g.I71 土豆，pH 值為 5.6 ;
3)生根培養(yǎng)基1/2MS+1.0 mg/LIBA+0.1 mg/LNAA+1 g.Γ1 花寶 2 號(hào)+20g/LSu+6.5g/L Ag+1.5 g.L 1Ac, pH 值為 5.6 ；
以上涉及:1、Ag為(Agar培養(yǎng)基凝固劑和支持物瓊脂粉的縮寫)；
2、Su為(Sugar提供植物碳源和維持滲透壓蔗糖的縮寫)；
3、Ac為活性炭。
[0007]本發(fā)明選取飽滿、無病蟲害見血清植株莖段作為誘導(dǎo)材料，在無菌條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)15?20d可萌發(fā)出生長(zhǎng)健壯新芽；經(jīng)20?30d增殖培養(yǎng)可產(chǎn)生大量增殖芽體，擴(kuò)繁系數(shù)高，增殖時(shí)間短，大大縮短了生長(zhǎng)過程，經(jīng)20?25d誘導(dǎo)生根后可成苗、移栽成活率高達(dá)96%以上；節(jié)約了大量成本，成苗移植后成活率高，蘭苗健壯挺拔，長(zhǎng)勢(shì)良好，整齊一致。
[0008]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn):
一:通過本發(fā)明方法可以最大限度地應(yīng)用現(xiàn)有資源，通過生物技術(shù)手段在短時(shí)間內(nèi)解決稀缺資源的應(yīng)用需求；
二:有助于解決資源匱乏、緩解野生資源遭受嚴(yán)重破壞的壓力，有效地保護(hù)有限的野生，為規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。
[0009]三:原生種生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)量不大，有關(guān)藥用植物見血青植株再生及快速繁殖技術(shù)未見報(bào)道。
[0010]四:見血青植株再生及快速繁殖配方，增殖系數(shù)高、生根率高，植物生長(zhǎng)需求時(shí)間短，栽培后適應(yīng)性強(qiáng)，苗木健壯挺拔，長(zhǎng)勢(shì)良好，整齊一致，大大縮短了苗木培養(yǎng)過程，節(jié)約了大量成本。為見血青的保護(hù)，以及規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。
[0011]五:總結(jié)出一套可供生產(chǎn)單位應(yīng)用的見血青高效微體繁殖技術(shù)，通過應(yīng)用該技術(shù)建立見血青生產(chǎn)基地。因此，見血青繁育的廣泛應(yīng)用可直接提高珍稀品種人工林地產(chǎn)量、質(zhì)量和園林綠化水平，實(shí)現(xiàn)資源高效培育，具有十分廣闊的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景。本發(fā)明創(chuàng)新性強(qiáng)，技術(shù)含量高，公益性強(qiáng)，對(duì)于促進(jìn)珍稀蘭花品種的研宄、利用，有著良好前景和及其重要意義，為開發(fā)利用該種資源提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
一種見血青再生及快速繁殖方法，具體步驟如下 I)材料選取與消毒:1、從見血青基部剪取3~10cm的新芽，用濕紗布包好，帶回實(shí)驗(yàn)室后用置流水將植株上泥土沖洗干凈；2、植株消毒處理:用醫(yī)用剪刀剪去植株上葉片后置飽和漂白粉上清液中浸泡lOmin，并用軟毛刷輕微刷洗沖洗干凈后在自來水下滴沖20 min，經(jīng)雙蒸水沖蕩2次后置超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精消毒30s，倒去酒精，加入0.1%升汞(HgCl2)處理lOmin，將汞液倒入廢汞瓶，無菌水沖3遍，用消毒濾紙吸干表面水分后即可進(jìn)行接種。
[0013]2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)消毒處理后的材料，切成帶I個(gè)節(jié)點(diǎn)長(zhǎng)Icm的莖段分別平放接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23°C，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度12001x，培養(yǎng)時(shí)間15d ；
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)，所得到的生長(zhǎng)良好芽植株切成長(zhǎng)2.0cm，分別接種在增殖培養(yǎng)基中，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度16001x，，增殖培養(yǎng)時(shí)間20d ；
4)誘導(dǎo)生根:將繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)出來的帶有葉2片，株高4cm無根幼苗單株切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中；光照時(shí)間llh/d，光照強(qiáng)度18001x，誘導(dǎo)生根時(shí)間20d ；
5)試管苗培養(yǎng)完成:當(dāng)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)試管苗生長(zhǎng)至高5cm，根3條，葉3片，葉長(zhǎng)約2cm時(shí)完成誘導(dǎo)見血清植株再生并可以進(jìn)行周期性大量繁殖培養(yǎng)；
6)將完成生根培養(yǎng)試管苗放在自然光下煉苗5天，打開瓶蓋煉苗I天，以增強(qiáng)試管苗對(duì)室外環(huán)境的適應(yīng)能力；然后用攝子從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)苗，洗去附著在根系上的培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土(1:2)混合的基質(zhì)中，保濕遮陰(溫度控制在25°C，濕度保持在80%，避免陽光直射，成活率可達(dá)97%以上。I周后植株適應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)，獲得生長(zhǎng)健壯的完整再生植株。
[0014]7)植株經(jīng)過在大棚適應(yīng)能力的適應(yīng)性栽培30天后，即可進(jìn)行迀地林下種植。
[0015]2.培養(yǎng)基:
培養(yǎng)基配制:基本培養(yǎng)基為MS，生長(zhǎng)激素為BA、KT、NAA、ZE、花寶I號(hào)，成熟度為80%香蕉 20 g.L—1，土豆 30 8*171鹿糖311為258*廠1，瓊脂粉48為6.58*171，？!1值為5.6，活性炭Ac為1.5 g.L—1;培養(yǎng)基厚度為1.5cm左右；
1)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT+0.3mg/LNAA+ 0.5mg/LZE Ig.L-1 花寶 I 號(hào) +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L_1Ac+20 g.L-1 香蕉 +30 g.L-1 土豆；
2)增殖培養(yǎng)基MS+3.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+ 0.5mg/LNAA + 1.0mg/LZE+ 2 g 參廠1花寶 I 號(hào) +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L-1Ac+ 20 g.L-1 香蕉 +30 g.L-1 土豆；
3)生根培養(yǎng)基1/2MS+1.0 mg/LIBA+0.1 mg/LNAA+1 g.Γ1 花寶 2 號(hào) +20g/LSu+6.5g/L Ag+1.5 g.L-1Ac。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種見血青再生及快速繁殖方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: O材料選取與消毒:從見血青基部剪取3~10cm的新芽，用流水將新芽上泥土沖洗干凈，然后剪去新芽上葉片后進(jìn)行消毒，消毒完成后進(jìn)行接種； 2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)消毒處理后的材料，切成帶I?2個(gè)節(jié)點(diǎn)、長(zhǎng)I?2cm的莖段平放接種于經(jīng)高溫、高壓滅菌的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件:培養(yǎng)室溫度為23±2°C，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度 1000 ?15001x ； 3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)，所得到的生長(zhǎng)良好的叢生芽切成長(zhǎng)2.0?2.5 cm，接種在增殖培養(yǎng)基中，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1500?18001x ； 4)誘導(dǎo)生根:將增殖培養(yǎng)出來的帶有葉2?3片，株高4?5cm的無根幼苗單株切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中；光照時(shí)間llh/d，光照強(qiáng)度1500?20001x ； 5)移栽:當(dāng)誘導(dǎo)生根培養(yǎng)試管苗生長(zhǎng)至高5?6cm，根3?5條，葉3?5片，葉長(zhǎng)2?3cm時(shí)，將試管苗放在自然光下煉苗4?6天，再打開瓶蓋煉苗1-2天，然后從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)苗，洗去附著在根系上的培養(yǎng)基，移入蛭石和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，保濕遮陰，獲得生長(zhǎng)健壯的完整再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的見血青再生及快速繁殖方法，其特征在于:步驟2)所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+2.0 mg/L-1 6-BA +0.5 mg.L-1 KT+0.3mg.L-1 NAA+ 0.5mg.L-1 ZE I g.L-1花寶 I 號(hào) +25g.L 1 Su+6.5g.L 1 Ag+1.5 g.L ^0+20 g.L 1 香蕉 +30 g.L 1 土顯，pH 值為 5.6ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的見血青再生及快速繁殖方法，其特征在于:步驟3)所述增殖培養(yǎng)基:MS+3.0mg.L-1 6-BA +0.5 mg.L-1 KT+ 0.5mg.L-1 NAA + 1.0mg.L-1 ZE+ 2g.L-1 花寶 I 號(hào) +25g.L-1 Su+6.5g.L Ag+1.5 g.L-1Ac+ 20 g.L-1 香蕉 +30 g.L-1 土豆，pH值為5.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的見血青再生及快速繁殖方法，其特征在于:步驟4)所述生根培養(yǎng)基:1/2MS+1.0 mg.L-1 ΙΒΑ+0.1 mg.L-1 NAA+1 g.L-1 花寶 2 號(hào) +20g.L Su+6.5g.L 1Ag+!.5 g.L 1Ac, pH 值為 5.6。
【專利摘要】本發(fā)明屬于瀕危野生植物中重要植物材料的快速繁殖方法，特別是涉及一種見血青再生及快速繁殖方法。該方法包括材料選取與消毒、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根和移栽。本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中種子自身沒有營(yíng)養(yǎng)體在自然環(huán)境下發(fā)芽率低、生根難、生長(zhǎng)緩慢的問題，為規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。本發(fā)明擴(kuò)繁系數(shù)高，增殖時(shí)間短，大大縮短了生長(zhǎng)過程，經(jīng)20～25d誘導(dǎo)生根后可成苗、移栽成活率高達(dá)96%以上；節(jié)約了大量成本，成苗移植后成活率高，蘭苗健壯挺拔，長(zhǎng)勢(shì)良好，整齊一致。為見血青的保護(hù)，以及規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104813937
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510234467
【發(fā)明人】何官榕, 何碧珠, 林蔚, 肖春梅
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年5月11日