一種通過(guò)陰干子實(shí)體保存和分離羊肚菌菌種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)陰干子實(shí)體保存和分離羊肚菌菌 種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊肚菌是一種名貴珍稀食用菌，目前雖然能進(jìn)行人工大田栽培，但產(chǎn)量極不穩(wěn)定， 導(dǎo)致其價(jià)格一直居高不下。菌種的獲取是羊肚菌大田生產(chǎn)第一步，也是關(guān)鍵性的一步。目 前羊肚菌菌種分離主要是用新鮮子實(shí)體作為分離材料，具體技術(shù)路線有2種：在羊肚菌子 實(shí)體產(chǎn)出季節(jié)（每年3-4月份），取新鮮子實(shí)體，倒懸于培養(yǎng)基上方，其子囊孢子自然彈落 到培養(yǎng)基上（孢子分離法，常用）；或是取新鮮子實(shí)體組織，加無(wú)菌水研磨，制備菌懸液后涂 布培養(yǎng)基（組織分離法，不常用）。以上方法生長(zhǎng)出菌落后，通過(guò)數(shù)次反復(fù)純化，得到純凈無(wú) 污染的菌種，4°C保存，到生產(chǎn)時(shí)使用。由于新鮮子實(shí)體容易腐爛，無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)期保存，因此 羊肚菌的菌種獲取具有很強(qiáng)的季節(jié)性，錯(cuò)過(guò)了生產(chǎn)季節(jié)，就無(wú)法得到菌種。且采用該方法保 存菌種需使用試管置于4°C冰柜或冰箱保存，成本高；試管保存菌種，隔一定時(shí)間需繼代一 次，以防止培養(yǎng)基養(yǎng)分耗盡，菌種活力退化，操作復(fù)雜；新鮮子實(shí)體上帶線蟲(chóng)等害蟲(chóng)，以及大 量雜菌，分離菌種時(shí)污染嚴(yán)重。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有的羊肚菌菌種保存方法受季節(jié)限制，且操作復(fù) 雜、成本較高、分離時(shí)易污染。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是一種通過(guò)陰干子實(shí)體保存和分離羊肚菌菌種的方法，包括如 下步驟：
[0005] a、菌種保存：在3-4月，選取成熟、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、菌蓋飽滿、菌蓋上棱和凹坑完 全展開(kāi)、菌柄為乳白色、形態(tài)正常、體積適中的羊肚菌，在通風(fēng)良好、溫度10~15°c、黑暗、 干燥處，攤開(kāi)擺放，不時(shí)翻動(dòng)，直到晾至子實(shí)體完全干燥；用紙袋包裝，在室內(nèi)干燥黑暗陰涼 處保存；
[0006] b、菌種分離：在需要使用菌種時(shí)，于無(wú)菌條件下，取0. 5 -Icm2大小的陰干子實(shí)體 菌蓋組織，用無(wú)菌水浸泡，完全軟化后，放入滅過(guò)菌的研缽，加入無(wú)菌水1毫升，研磨制備組 織懸液，取組織懸液接種于麥粒培養(yǎng)基中央；在15~25°C避光培養(yǎng)10-20天至羊肚菌氣生 菌絲或菌核長(zhǎng)出，然后用接種針挑取氣生菌絲或菌核，接種于PDA培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)，此后 均在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)純化培養(yǎng)，直到得到無(wú)污染的菌種為止。
[0007] 優(yōu)選的，步驟a中，保存前檢查已陰干子實(shí)體剩余的子囊孢子數(shù)量，方法如下：取 0. 5 - Icm2大小的菌蓋組織塊，清水浸泡，完全軟化后，放入研缽，加少量清水，研磨制備組 織懸液，在顯微鏡下鏡檢，沒(méi)有子囊孢子或子囊孢子太少的子實(shí)體棄去不用，選子囊孢子多 的子實(shí)體保存。
[0008] 優(yōu)選的，步驟b中培養(yǎng)溫度為20 °C。
[0009] 優(yōu)選的，步驟b中培養(yǎng)時(shí)間為15d。
[0010] 優(yōu)選的，步驟b中，第二次純化所用接種物為初次分離時(shí)得到的菌核。
[0011] 在步驟a菌種保存的過(guò)程中，如果通風(fēng)不良、溫度較高或潮濕的環(huán)境，子實(shí)體容易 發(fā)生腐爛，而光照會(huì)導(dǎo)致子實(shí)體大量彈射子囊孢子，因此需要低溫、通風(fēng)、干燥、黑暗環(huán)境。 由于在子實(shí)體采收前和干燥過(guò)程中可能彈射了部分子囊孢子，因此在保存前可先進(jìn)行剩余 子囊孢子數(shù)量檢查。保存過(guò)程中應(yīng)作好防止蟲(chóng)害鼠害措施。
[0012] 在步驟b菌種分離過(guò)程中，陰干子實(shí)體量太少，可萌發(fā)的孢子數(shù)量太少，不容易長(zhǎng) 出氣生菌絲，量太多，雖然萌發(fā)的孢子多，雜菌也更多，0.5-lcm 2較合適；無(wú)菌水量太少，不 容易研磨成菌懸液，無(wú)菌水量太多，在麥粒底部形成水層，加速細(xì)菌擴(kuò)散，Iml比較合適。因 為陰干子實(shí)體菌蓋組織非常薄，非常輕，所以在本領(lǐng)域常用面積表示陰干子實(shí)體組織的大 小。
[0013] 步驟b中麥粒培養(yǎng)基的制作：選取無(wú)病蟲(chóng)害、飽滿、較新鮮、去殼帶皮的小麥麥粒， 清水浸泡24小時(shí)，入鍋加清水煮至麥粒無(wú)白心，無(wú)破皮，撈出瀝水，盛入平皿，于121°C滅菌 30分鐘，冷卻后備用。
[0014] 在步驟b中PDA培養(yǎng)基的制作：200克土豆切小塊，煮汁過(guò)濾，濾液中加入葡萄糖 20克，瓊脂粉7克，清水定容至1000毫升，121 °C滅菌30分鐘，倒滅過(guò)菌的平皿，冷卻凝固后 備用。
[0015] 本發(fā)明中，根據(jù)以往的認(rèn)知，子實(shí)體干燥后，其中的子囊孢子也會(huì)變干，失去菌絲 萌發(fā)能力。而本發(fā)明挑選了很多陰干、含大量子囊孢子的子實(shí)體進(jìn)行孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)， 雖然很多孢子已失去萌發(fā)能力，但仍然有約40-70%的孢子吸水膨脹，萌發(fā)菌絲，形成菌落， 這一個(gè)結(jié)果就是本發(fā)明的技術(shù)基礎(chǔ)。而高溫烘干的子實(shí)體由于其中的孢子受高溫?fù)p害失去 活性，因此不容易再次萌發(fā)菌絲。
[0016] 本發(fā)明中，以往的研宄常用瓊脂+營(yíng)養(yǎng)物+水的培養(yǎng)基進(jìn)行羊肚菌菌種分離，主要 是常規(guī)PDA培養(yǎng)基。由于羊肚菌取自大田，因此攜帶大量雜菌，包括細(xì)菌和真菌。在PDA上生 長(zhǎng)時(shí)，雜菌，尤其是細(xì)菌常常長(zhǎng)成厚厚一層菌苔，蓋過(guò)羊肚菌菌絲，導(dǎo)致羊肚菌菌絲難以長(zhǎng) 出，即使羊肚菌長(zhǎng)出氣生菌絲，在挑取氣生菌絲到新PDA上培養(yǎng)時(shí)，氣生菌絲攜帶的細(xì)菌長(zhǎng) 勢(shì)常常又會(huì)蓋過(guò)羊肚菌菌絲，如此反復(fù)，導(dǎo)致分離失敗。這一問(wèn)題在新鮮羊肚菌使用孢子分 離法分離菌種時(shí)無(wú)法解決，使用組織分離法時(shí)，雖然用逐級(jí)稀釋菌懸液后分別進(jìn)行平板培 養(yǎng)基涂布的方法可以緩解污染情況，但這種方法適用于新鮮子實(shí)體，而不適用于干子實(shí)體。 因?yàn)樾迈r子實(shí)體其孢子萌發(fā)率幾乎達(dá)100 %，在經(jīng)試驗(yàn)得到一個(gè)合適的稀釋水平后，可以將 該稀釋水平應(yīng)用于不同子實(shí)體個(gè)體的分離；而干子實(shí)體不同個(gè)體之間孢子萌發(fā)率相差比較 大，針對(duì)每一個(gè)子實(shí)體都需要進(jìn)行一系列的稀釋實(shí)驗(yàn)，才可能得到適合該個(gè)體的稀釋水平， 工作量非常大。而本發(fā)明的研宄發(fā)現(xiàn)，干組織制作的組織懸液接種到麥粒培養(yǎng)基上時(shí)，羊肚 菌能長(zhǎng)出大量氣生菌絲，且健壯濃密，甚至發(fā)育出菌核組織，長(zhǎng)勢(shì)大大優(yōu)于PDA培養(yǎng)基。這 是由于細(xì)菌體積遠(yuǎn)比羊肚菌絲小，它們?cè)谂囵B(yǎng)基上擴(kuò)展需要連續(xù)介質(zhì)，如瓊脂培養(yǎng)基，而麥 粒培養(yǎng)基麥粒之間空隙很大，大大阻礙了細(xì)菌擴(kuò)展的速度，且不能形成菌苔，而羊肚菌絲細(xì) 長(zhǎng)，空隙對(duì)其幾乎沒(méi)有阻礙作用，而且透氣性好利于其生長(zhǎng)，因此生長(zhǎng)擴(kuò)散速度比細(xì)菌快， 雖然也有霉菌污染，但對(duì)羊肚菌的抑制能力沒(méi)有細(xì)菌強(qiáng)，因此在小麥培養(yǎng)基上，羊肚菌菌絲 比在PDA上生長(zhǎng)得更好，更健壯，而取這些氣生菌絲到PDA上進(jìn)行純化培養(yǎng)時(shí)，雖然也有雜 菌污染，但羊肚菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于雜菌，加快了菌種純化進(jìn)程。此外，由于麥粒培養(yǎng)基雜菌污 染率比PDA低，因此子實(shí)體組織的量和無(wú)菌水的量只要控制在一個(gè)大致的比例范圍即可， 都可以長(zhǎng)出健壯的氣生菌絲，不需要做太復(fù)雜的稀釋水平實(shí)驗(yàn)，非常適合于孢子萌發(fā)率不 一致的干子實(shí)體。以上就是本發(fā)明的技術(shù)基礎(chǔ)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] 1、采用本發(fā)明方法，在任何時(shí)候均可以從干子實(shí)體分離得到菌種。干子實(shí)體中的 干子囊孢子可以