本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)賀蘭山丁香種子高效萌發(fā)的方法。

背景技術(shù)：

賀蘭山丁香(syringapinnatifoliavar.alanshanicamaets.q.zhou)，是木犀科(oleaceae)丁香屬(syringa)羽葉丁香(syringapinnatifolia)在賀蘭山地區(qū)特有的一個(gè)變種，被列為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)珍稀瀕危植物。賀蘭山丁香是寶貴的蒙藥材資源，蒙藥名為阿拉善-阿嘎如，含有揮發(fā)油、萜類、香豆素、酚類、蛋白質(zhì)和糖類等成分，具有鎮(zhèn)赫依、清熱、止痛、平喘等功效，臨床上多與其他蒙藥配伍治療胸悶氣短、心肌缺血等心肺疾病。

目前，賀蘭山丁香野生資源瀕危，而作為珍稀蒙藥材，特別是在大健康時(shí)代背景下，賀蘭山丁香的市場(chǎng)需求量日益增大。于是有限的資源和無(wú)限的市場(chǎng)需求的矛盾成為賀蘭山丁香保護(hù)、開發(fā)和利用的桎梏。探索賀蘭山丁香大規(guī)模繁殖策略是解決這一難題的有效途徑。賀蘭山丁香種子由于種皮致密堅(jiān)硬，胚乳厚，種胚發(fā)育不全而且存在休眠現(xiàn)象等原因，發(fā)芽率僅有14％，且發(fā)芽不整齊，難以實(shí)現(xiàn)大面積人工種植。目前尚未見賀蘭山丁香種子高效萌發(fā)方法的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決賀蘭山丁香種子休眠期長(zhǎng)、發(fā)芽率低的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種賀蘭山丁香種子萌發(fā)的方法，包括如下步驟：

1)將賀蘭山丁香種子在濃硫酸溶液中浸泡處理，得到濃硫酸處理后種子；

2)將所述濃硫酸處理后種子進(jìn)行熱激處理，得到熱激處理后種子；

3)將所述熱激處理后種子在添加ga3的ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)種子萌發(fā)。

上述方法中，首先用濃硫酸浸泡賀蘭山丁香種子，以改善種皮透性，便于種子吸漲。接下來(lái)利用熱激處理和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)ga3的協(xié)同作用，打破賀蘭山丁香種子休眠，從而達(dá)到提高賀蘭山丁香種子萌發(fā)率的目的。

上述方法中，步驟1)中，所述濃硫酸溶液(溶劑水)的質(zhì)量百分含量為98％；

步驟2)中，所述熱激處理為將所述濃硫酸處理后種子進(jìn)行水浴加熱處理；

步驟3)中，所述添加ga3的ms培養(yǎng)基中的ga3的濃度為0.1-2mg·l^-1；

或所述添加ga3的ms培養(yǎng)基中的ga3的濃度為0.5、0.1、1或2mg·l^-1。

添加ga3的ms培養(yǎng)基為固體ms培養(yǎng)基中添加如下：

赤霉素(ga3)0.1～2mg·l^-1

蔗糖30g·l^-1

瓊脂6～7g·l^-1

上述方法中，

步驟1)中，所述浸泡處理的時(shí)間為1-2.5min；或所述浸泡處理的時(shí)間為1、1.5、2或2.5min；

步驟2)中，所述加熱處理的溫度為30-50℃、時(shí)間為40-60min；或所述加熱處理的溫度為30、40或50℃、時(shí)間為40、50或60min；

步驟3)中，所述培養(yǎng)溫度為20-25℃，所述培養(yǎng)的光周期為24h黑暗培養(yǎng)或8h光照且16h黑暗；

或所述培養(yǎng)溫度為25±1℃，所述培養(yǎng)的光周期為24h黑暗培養(yǎng)；

或所述培養(yǎng)溫度為22±1℃，所述培養(yǎng)的光周期為8h光照、16h黑暗；

或所述培養(yǎng)溫度為25±1℃，所述培養(yǎng)的光周期為24h黑暗；

或所述培養(yǎng)溫度為20±1℃，所述培養(yǎng)的光周期為8h光照、16h黑暗；

或所述培養(yǎng)溫度為22±1℃，所述培養(yǎng)的光周期為24h黑暗。

上述方法中，

所述步驟1)和2)之間，還包括如下步驟：將所述濃硫酸處理后種子的ph值調(diào)至6.5-7。

上述方法中，

所述步驟1)和2)之間，還包括如下步驟：將所述熱激處理后種子消毒。

上述方法中，

所述消毒的步驟如下：先將所述熱激處理后種子用體積百分含量為75％的乙醇水溶液消毒，再用質(zhì)量百分含量為0.1％的升貢水溶液消毒。

上述方法中，

所述賀蘭山丁香種子為千粒重大于等于4.25g的種子。

本發(fā)明有益效果在于：本發(fā)明的方法通過(guò)濃硫酸浸泡、熱激處理和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)ga3的協(xié)同作用進(jìn)行繁育，不受自然條件和地區(qū)差異的限制，可使賀蘭山丁香種子的萌發(fā)率高達(dá)60％，同時(shí)也有利于提高賀蘭山丁香幼苗的成活率。本方法具有操作方便、快速、成本低的特點(diǎn)，可以解決賀蘭山丁香生產(chǎn)中種子萌發(fā)、特別是工廠化育苗中遇到的種子萌發(fā)不齊整的問(wèn)題，便捷高效，具有重要的經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用推廣價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、賀蘭山丁香種子萌發(fā)的方法

1、選種

分別于2015年10月(阿拉善蒙醫(yī)院種質(zhì)圃)和2016年10月(賀蘭山地區(qū))采集賀蘭山丁香種子，晾干，精選千粒重4.25g以上的種子，在超低溫冰箱(-70℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

2、濃硫酸浸泡

將上述1得到的賀蘭山丁香種子在濃度為98％(質(zhì)量百分含量)的濃硫酸(h2so4)溶液中浸泡1min，得到濃硫酸處理后種子。

3、熱激處理

將上述2得到的濃硫酸處理后種子用自來(lái)水沖至ph值6.5-7之間，在50℃水浴鍋中熱激處理50min，得到熱激處理后種子。

4、接種培養(yǎng)

將上述3得到的熱激處理后種子先置于體積百分含量75％的乙醇水溶液中消毒約1min，無(wú)菌水沖洗6次，再0.1％(質(zhì)量百分含量)的升汞水溶液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗6次，得到消毒處理后種子；

再將消毒處理后種子接種到添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，光周期為24h黑暗。

添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基配方如下：向固體ms培養(yǎng)基(上海宇涵生物科技有限公司，a0025-500g)中添加如下：

赤霉素(ga3)1mg·l^-1

蔗糖30g·l^-1

瓊脂7g·l^-1

30天后，統(tǒng)計(jì)賀蘭山丁香種子萌發(fā)率，萌發(fā)率＝(萌發(fā)種子數(shù)/每瓶接種種子數(shù))*％

結(jié)果賀蘭山丁香種子萌發(fā)率為60％。

實(shí)施例2、賀蘭山丁香種子萌發(fā)的方法

1、選種

與實(shí)施例1相同；

2、濃硫酸浸泡

將上述1得到的賀蘭山丁香種子在濃度為98％的濃硫酸(h2so4)溶液中浸泡1.5min，得到濃硫酸處理后種子。

3、熱激處理

將上述2得到的濃硫酸處理后種子用自來(lái)水沖至ph值6.5-7之間，在30℃水浴鍋中熱激處理40min，得到熱激處理后種子。

4、接種培養(yǎng)

將上述3得到的熱激處理后種子先置于75％的酒精中消毒約1min，無(wú)菌水沖洗6次，再0.1％的升貢水溶液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗6次，得到消毒處理后種子；

再將消毒處理后種子接種到添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±1℃，光周期為8h光照、16h黑暗。

添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基配方如下：向固體ms培養(yǎng)基中添加如下：

赤霉素(ga3)1mg·l^-1

蔗糖30g·l^-1

瓊脂7g·l^-1

30天后，統(tǒng)計(jì)賀蘭山丁香種子萌發(fā)率，萌發(fā)率＝(萌發(fā)種子數(shù)/每瓶接種種子數(shù))*％

結(jié)果賀蘭山丁香種子萌發(fā)率為54％。

實(shí)施例3、賀蘭山丁香種子萌發(fā)的方法

1、選種

與實(shí)施例1相同；

2、濃硫酸浸泡

將上述1得到的賀蘭山丁香種子在濃度為98％的濃硫酸(h2so4)溶液中浸泡2min，得到濃硫酸處理后種子。

3、熱激處理

將上述2得到的濃硫酸處理后種子用自來(lái)水沖至ph值6.5-7之間，在30℃水浴鍋中熱激處理50min，得到熱激處理后種子。

4、接種培養(yǎng)

將上述3得到的熱激處理后種子先置于75％的酒精水溶液中消毒約1min，無(wú)菌水沖洗6次，再0.1％的升貢水溶液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗6次，得到消毒處理后種子；

再將消毒處理后種子接種到添加2mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，光周期為24h黑暗。

添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基配方如下：向固體ms培養(yǎng)基中添加如下：

赤霉素(ga3)2mg·l^-1

蔗糖30g·l^-1

瓊脂7g·l^-1

30天后，統(tǒng)計(jì)賀蘭山丁香種子萌發(fā)率，萌發(fā)率＝(萌發(fā)種子數(shù)/每瓶接種種子數(shù))*％

結(jié)果賀蘭山丁香種子萌發(fā)率為48％。

實(shí)施例4、賀蘭山丁香種子萌發(fā)的方法

1、選種

與實(shí)施例1相同；

2、濃硫酸浸泡

將上述1得到的賀蘭山丁香種子在濃度為98％的濃硫酸(h2so4)溶液中浸泡2.5min，得到濃硫酸處理后種子。

3、熱激處理

將上述2得到的濃硫酸處理后種子用自來(lái)水沖至ph值6.5-7之間，在30℃水浴鍋中熱激處理60min，得到熱激處理后種子。

4、接種培養(yǎng)

將上述3得到的熱激處理后種子先置于75％的酒精水溶液中消毒約1min，無(wú)菌水沖洗6次，再0.1％的升貢水溶液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗6次，得到消毒處理后種子；

再將消毒處理后種子接種到添加0.5mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20±1℃，光周期為8h光照、16h黑暗。

添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基配方如下：向固體ms培養(yǎng)基中添加如下：

赤霉素(ga3)0.5mg·l^-1

蔗糖30g·l^-1

瓊脂7g·l^-1

30天后，統(tǒng)計(jì)賀蘭山丁香種子萌發(fā)率，萌發(fā)率＝(萌發(fā)種子數(shù)/每瓶接種種子數(shù))*％

結(jié)果賀蘭山丁香種子萌發(fā)率為42％。

實(shí)施例5、賀蘭山丁香種子萌發(fā)的方法

1、選種

與實(shí)施例1相同；

2、濃硫酸浸泡

將上述1得到的賀蘭山丁香種子在濃度為98％的濃硫酸(h2so4)溶液中浸泡2.5min，得到濃硫酸處理后種子。

3、熱激處理

將上述2得到的濃硫酸處理后種子用自來(lái)水沖至ph值6.5-7之間，在40℃水浴鍋中熱激處理50min，得到熱激處理后種子。

4、接種培養(yǎng)

將上述3得到的熱激處理后種子先置于75％的酒精水溶液中消毒約1min，無(wú)菌水沖洗6次，再0.1％的升貢水溶液中消毒7min，無(wú)菌水沖洗6次，得到消毒處理后種子；

再將消毒處理后種子接種到添加0.1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±1℃，光周期為24h黑暗。

添加1mg·l^-1ga3的ms固體培養(yǎng)基配方如下：向固體ms培養(yǎng)基中添加如下：

赤霉素(ga3)0.1mg·l^-1

蔗糖30g·l^-1

瓊脂7g·l^-1

30天后，統(tǒng)計(jì)賀蘭山丁香種子萌發(fā)率，萌發(fā)率＝(萌發(fā)種子數(shù)/每瓶接種種子數(shù))*％

結(jié)果賀蘭山丁香種子萌發(fā)率為36％。

對(duì)比例1、

隨機(jī)抽取200粒賀蘭山丁香種自,每50粒為一組擺放于四個(gè)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪脫脂棉,表面一層濾紙,共4個(gè)重復(fù),在光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng),光照12h,保持培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤(rùn)。每天記載發(fā)芽粒數(shù),連續(xù)天無(wú)新發(fā)芽種子,停止計(jì)數(shù)。

最終統(tǒng)計(jì)賀蘭山丁香種子的發(fā)芽率為14％，可以看出本發(fā)明的方法的發(fā)芽率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該常規(guī)實(shí)驗(yàn)。