本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種用甘薯葉柄進行愈傷組織誘導(dǎo)和分化的方法。

背景技術(shù)：

甘薯(ipomoeabatatas(l.)lam.)屬于旋花科(convolvulaceae)，一年生或多年生草質(zhì)蔓性藤本植物。組織培養(yǎng)不受地點季節(jié)制約可連續(xù)快速繁殖，且操作簡單用時短、成熟種苗根系發(fā)達(dá)質(zhì)量高，能有效的降低生產(chǎn)成本和提高人員的生產(chǎn)效率。使其不再受到季節(jié)和產(chǎn)地的局限。

張玲等，使用葉片和莖尖做成外植體，葉片和莖尖對誘導(dǎo)結(jié)果的作用相差很大。用葉片可以達(dá)到95.69％。而莖尖的則為30.56％。兩者相差很大。且葉片明顯比莖尖有優(yōu)勢。周志林等，使用了莖段、葉片、葉柄作為實驗部位進行實驗。綜合來說，莖段的分化能力最高，其次是葉片，之后是葉柄。朱愛科等，就愈傷誘導(dǎo)這一方面，研究出葉片和葉柄的出愈率是相同的，都為100％。這可能與甘薯的品種有關(guān)，研究品種較容易生成愈傷。且馬苗鵬等用莖段、葉片、葉柄、莖尖為刺激部位進行比較。檢測得到，最后能力強弱的排名是葉柄＞葉片＞莖尖＞莖段。

激素對于體外研究過程來說是一個不可或缺的條件。而且激素量的高低也有不同的效果。只有在激素濃度適宜時才會誘導(dǎo)出愈傷。徐茜等，用6-ba、naa、2，4-d、kt、iaa適當(dāng)?shù)倪M行組合成7種組合的處理組，進行離體培養(yǎng)。在試驗的幾個誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，都能產(chǎn)生出愈傷，而且能夠保證可以達(dá)到100％的程度。劉春月等，以6-ba、naa兩種激素不同濃度的配比，通過大量試驗研究，這樣激素的使用更有利于愈傷的誘導(dǎo)，且生長情況良好，不易老化。

一般植物培養(yǎng)中較普通的就是先分化出芽，再在新芽幼莖的基部長出須根，從而慢慢長成完整的植株。而甘薯的分化跟其他植物有所不同，其先分化出根，再由根上慢慢發(fā)芽，生長壯大。因為先生根，對芽的分化會有抑制作用，所以，甘薯芽分化所需的時間會較長。張先云等，用枝條為外植體，選擇3種激素進行組合的培養(yǎng)基，進行控制整個過程的實驗。判斷出了最佳搭配。最終，成為作用部位愈傷形成、分化和增殖的最適培養(yǎng)基。

無論在食品營養(yǎng)保健方面還是在紡織、飼料、能源方面，甘薯都具有不可忽視的重要作用。隨著其需求量的不斷增加，甘薯組織培養(yǎng)技術(shù)顯得更加實用。組織培養(yǎng)以其適應(yīng)性廣、繁殖力強、栽培簡便、成本低等優(yōu)點，可以實現(xiàn)培養(yǎng)優(yōu)良甘薯品種、生產(chǎn)無菌苗、建立快速繁殖體系。為優(yōu)良甘薯的高效供應(yīng)提供一大助力。如果這項技術(shù)可以應(yīng)用到生活中，將會給我們的經(jīng)濟和生活帶來巨大的沖擊。它不僅可以獲得更高的經(jīng)濟效益，還為環(huán)境的改善和城市的改造提供了幫助，為新品種的開發(fā)打下基礎(chǔ)。現(xiàn)有技術(shù)條件下，甘薯愈傷組織的誘導(dǎo)及分化率較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了用甘薯葉柄進行愈傷組織誘導(dǎo)和分化的方法，顯著提高了甘薯愈傷組織的誘導(dǎo)及分化率。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

用甘薯葉柄進行愈傷組織誘導(dǎo)和分化的方法，包括如下步驟：

s1、將甘薯幼苗的葉柄用75％的酒精溶液處理30秒，10％的naclo溶液浸泡處理5分鐘后，用0.1％hgcl2溶液浸泡3分鐘，無菌水沖洗；

s2、在超凈工作臺中，用經(jīng)過滅菌的解剖刀將葉柄剪成長度為1-2cm的切段，接種到無菌培養(yǎng)基上，25℃下進行暗培養(yǎng)，該無菌培養(yǎng)基的配方為：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.5mg/l；

s3、在無菌條件下，將培養(yǎng)20天得到的愈傷轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，光照強度1600lx，每天光照16小時，暗照8小時，該分化培養(yǎng)基的配方為：ms+2，4-d0.01mg/l+kt1.0mg/l，得甘薯組培苗。

本發(fā)明具有以下有益效果：

以葉柄為外植體，可以快速獲得甘薯組培苗。實現(xiàn)了利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對甘薯進行快速繁殖和高產(chǎn)栽培，也為甘薯遺傳轉(zhuǎn)化提供了必要基礎(chǔ)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例提供了一種用甘薯葉柄進行愈傷組織誘導(dǎo)和分化的方法，包括如下步驟：

s1、將甘薯幼苗的葉柄用75％的酒精溶液處理30秒，10％的naclo溶液浸泡處理5分鐘后，用0.1％hgcl2溶液浸泡3分鐘，無菌水沖洗；

s2、在超凈工作臺中，用經(jīng)過滅菌的解剖刀將葉柄剪成長度為1-2cm的切段，接種到無菌培養(yǎng)基上，25℃下進行暗培養(yǎng)，該無菌培養(yǎng)基的配方為：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.5mg/l；

s3、在無菌條件下，將培養(yǎng)20天得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，光照強度1600lx，每天光照16小時，暗照8小時，該分化培養(yǎng)基的配方為：ms+2，4-d0.01mg/l+kt1.0mg/l，得甘薯組培苗；

s4、通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，保證使其與植物體的內(nèi)部生長機制相協(xié)調(diào)，獲得所需的試管苗；

s5、在適宜的溫度、充足的光照、一定的濕度的前提下，將組織培養(yǎng)得到的試管苗煉苗三天后，移栽到花盆中進行培養(yǎng)，合理管理，即可成活。

實驗例

培養(yǎng)基的配制：基本培養(yǎng)基為ms，培養(yǎng)基中激素加入量具體見表1。

表1甘薯愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合

甘薯外植體消毒處理

甘薯幼苗葉柄用75％的酒精溶液處理30秒，10％的naclo溶液浸泡處理5分鐘后，用0.1％hgcl2溶液浸泡3分鐘，無菌水沖洗；

甘薯外植體接種及愈傷組織誘導(dǎo)

在超凈工作臺中，用經(jīng)過滅菌的解剖刀將葉柄剪成長度為1-2cm的切段，接種到不同激素濃度的無菌培養(yǎng)基上。每瓶接種3個外植體，每組設(shè)置3個重復(fù)實驗，25℃下進行暗培養(yǎng)；20天后統(tǒng)計，愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果表2。

表2激素對甘薯葉柄愈傷組織誘導(dǎo)影響

由上可知，相同外植體條件下，得到最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+6-ba0.5mg/l+naa0.5mg/l。

甘薯愈傷組織分化及芽的再生

在無菌條件下，將培養(yǎng)20天得到的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基生成的愈傷轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基激素配比見表3)。光照強度1600lx，每天光照16小時，暗照8小時。每種處理分別有5組重復(fù)。觀察其分化情況，培養(yǎng)60天后統(tǒng)計根和芽的分化率，愈傷組織分化結(jié)果見表4。

表3分化培養(yǎng)基激素濃度組合

甘薯芽的分化比根要困難的多，在有根分化后30天，開始有芽的生成。其先分化出根，再由根上慢慢發(fā)芽，然后生長壯大。在分化培養(yǎng)基中，就激素組合來說(見表4)，b1、b2、b3、b7、b8、b9處理組都有芽的分化。以2，4-d、kt為組合的兩組分化培養(yǎng)基上，芽分化率分別為26.7％、13.3％。芽由愈傷先發(fā)出的根上生成，再繼續(xù)生長之后得到。且得到幼苗生長健康，不斷成長壯大。結(jié)果顯示，最佳的分化培養(yǎng)基為ms+2，4-d0.01mg/l+kt1.0mg/l。

表4分化培養(yǎng)基上激素對愈傷芽分化的影響

實施例

采用本申請的技術(shù)，以葉柄為外植體，獲得甘薯組培苗已經(jīng)在邯鄲市禾下土種業(yè)有限公司種植基地大面積栽培，經(jīng)濟效益良好

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。