本申請屬于白芨的組培
技術領域：
，具體地說，涉及白芨種子快發(fā)壯生的培育方法。
背景技術：
：白芨(bletillastriata(thunb.exa.murray)rchb.f.)隸屬蘭科白及屬，又名紫蘭(根)、雙腎草、白及等，是溫帶地生多年生草本蘭科植物類群之一。白芨主要分布在中國的秦嶺、淮河以南大部分地區(qū)、日本以及緬甸北部，適宜在常綠闊葉林、針葉林、草叢中和巖石石縫等溫暖、陰涼濕潤的環(huán)境中生長。白芨是蘭科植物中非常重要的藥用植物之一，其假鱗莖中含有大量多糖，具有消腫生肌、止血收斂之功效。近年來，研究發(fā)現(xiàn)白芨塊莖主要成分為葡聚糖苷、聯(lián)芐、菲、三萜及其苷類、甾體及其皂苷。其中葡聚糖苷是白芨膠的主要的藥用成分，具有許多藥理活性，包括促進傷口愈合、血小板聚集止血、保護胃黏膜、抗腫瘤和抗補體活性。臨床上廣泛用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、腫瘤栓塞及前列腺手術等。隨著市場對白芨資源需求不斷的擴大，我國大部分地區(qū)的野生白芨遭到過度采挖，導致其野生自然資源急劇減少，瀕臨滅絕，被國家列為重點保護的野生藥用植物之一。白芨種子細小且無胚乳，在自然狀況下實生苗育苗很難萌發(fā)和生長，傳統(tǒng)栽培主要靠地下塊莖分株繁殖。分株繁殖種苗貴，投入成本高，培育周期長，繁殖系數(shù)低，難于滿足人類日益升高的需求和生產快速發(fā)展的需要，因此組織培養(yǎng)成為了工廠化規(guī)模培育白芨種苗的主要技術途徑?，F(xiàn)有的組培技術環(huán)節(jié)較多，一般都需經過種子萌發(fā)-原球莖誘導-原球莖增殖-叢芽誘導-叢芽增殖-生根等6個環(huán)節(jié)才能在4個月內完成育苗(cn103314855a)。為簡化程序，有的將種子的萌發(fā)和壯苗都使用同一種培養(yǎng)基(cn106376328a)，雖然縮短了培育周期，但培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不能滿足白芨組培苗各階段的特殊營養(yǎng)需求，幼苗質量較低。有的在培養(yǎng)基中添加紫蘇梗、威靈仙、漏蘆、羌活等材料來促進種子萌發(fā)和幼苗的生長(cnio460468oa)，但卻增加了培育過程的復雜程度和培育成本。目前，白芨組培中使用的培養(yǎng)基一般都是ms基本培養(yǎng)基，用于種子萌發(fā)，反而萌發(fā)較慢，出苗不整齊，成本較高。改良后的組培過程轉接次數(shù)多，程序繁瑣，污染幾率增加，成苗質量差、移栽成活低，不利于工廠化育苗。申請人單獨使用蘭科植物種子萌發(fā)通用的kc培養(yǎng)基培養(yǎng)白芨種子發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)率高，生長也快，但營養(yǎng)成分少，組培苗纖細瘦弱，容易倒伏。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服目前白芨組培技術成本高、環(huán)節(jié)多、萌發(fā)晚、生長弱等諸多的不足，公開了一種基于kc和ms改良培養(yǎng)基的白芨種子早發(fā)壯生培育的方法，對白芨資源的保護以及白芨產業(yè)的發(fā)展壯大具有重要意義。一種白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，包括以下步驟：1)接種：將果中種子取出，均勻播散在萌發(fā)培養(yǎng)基中，置于適宜培養(yǎng)條件培育；2)轉接：種子在所述萌發(fā)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)60天，種子萌發(fā)并長到2.0±0.5cm高的小苗時，轉接到壯苗培養(yǎng)基中在適宜條件下進行繼代培養(yǎng)；所述萌發(fā)培養(yǎng)基配方為：kc基本培養(yǎng)基+0.2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1.0mg/l萘乙酸+100g/l馬鈴薯+20g/l蔗糖+7g/l瓊脂+300mg/l活性炭；所述壯苗培養(yǎng)基的配方為：ms基本培養(yǎng)基+2.5mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1.0mg/l萘乙酸+80g/l香蕉+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂+500mg/l活性炭。進一步地，如上所述的白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，所述的kc培養(yǎng)基由以下組分配制：(nh4)2so4500mg/l，kh2po4250mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，ca(no3)21000mg/l，mnso4·4h2o7.5mg/l，feso4·7h2o25mg/l，溶劑為蒸餾水。進一步地，如上所述的白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，所需的適宜的培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照1800-2500lux，光/暗周期＝12h/12h，培養(yǎng)60天。進一步地，如上所述的白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，所述ms培養(yǎng)基由以下組分組成：nh4no31650mg/l，kno31900mg/l，cacl2·2h2o440mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，kh2po4170mg/l；ki0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l；feso4·7h2o27.8mg/l，na2-edta·2h2o37.3mg/l；肌醇100mg/l，煙酸0.5mg/l，鹽酸吡哆醇0.5mg/l，鹽酸硫胺素0.1mg/l，甘氨酸2.0mg/l，溶劑為蒸餾水。進一步地，如上所述的白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照強度1800-2500lux，光/暗周期＝14h/10h，培養(yǎng)60天。進一步地，如上所述的白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，配制完成后的萌發(fā)培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基，需要將ph調至6.0-6.5，調試用試劑為1mol/lhci或1mol/lnaoh，試劑使用前在121℃、0.15mpa高溫高壓滅菌20min。進一步地，如上所述的白芨種子快發(fā)壯生的培育方法，在步驟1)之前，還包括以下步驟：a)外植體的選擇：挑選成熟飽滿未開裂的白芨蒴果；b)外植體的清洗：用細軟刷子將白芨蒴果上的泥垢在自來水中洗凈，晾干，移入超凈工作臺；c)消毒：超凈工作臺及其內部使用用具，經紫外燈消毒15min后，用75％乙醇對白芨蒴果表面消毒30s，無菌水漂洗3次，再用0.1％氯化汞消毒10min后，無菌水漂洗5-6次。與現(xiàn)有技術相比，本申請可以獲得包括以下技術效果：成熟無菌種子在快速萌發(fā)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)，4-5天種子開始萌動，7天內萌發(fā)率達到97.65％，分別比對照中kc培養(yǎng)基和ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)的種子的萌發(fā)率提高2.09％和11.3％；當白芨種子在快速培養(yǎng)基中快速萌發(fā)60天后，選擇高2.0cm左右白芨苗轉入壯苗培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，60天后，白芨幼苗的原球莖、莖直徑、葉寬/葉長比值都顯著高于在kc或ms培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的幼苗。因此快速萌發(fā)培養(yǎng)基與壯苗培養(yǎng)基配合使用，不但提高了種子萌發(fā)時間和萌發(fā)率，而且縮短了白芨壯苗的培育周期，節(jié)約了成本，促進了白芨原球莖膨大、莖干增粗以及根系的生長。與現(xiàn)在技術相比，快速萌發(fā)培養(yǎng)基是kc基本培養(yǎng)基，能夠滿足對白芨種子萌發(fā)要求，比ms培養(yǎng)基縮短萌發(fā)時間2-3天，提高萌發(fā)率11.3％，原球莖直徑平均可達2.27mm，體積增加1倍左右。該培育方法只需要繼代一次，減少了轉接頻率，降低繼代過程的污染，縮短了培育時間和降低了育苗成本。壯苗培育后的白芨苗莖干粗壯、原球莖直徑可達5.78mm，是ms培養(yǎng)基苗的1.47倍，可直接煉苗移栽，操作簡單，利于大規(guī)模工廠化。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：圖1是本申請實施例的白芨種子在ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天時不整齊萌發(fā)的圖片；圖2是本申請實施例的白芨種子在快速萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天時整齊萌發(fā)的圖片；圖3是本申請實施例對照(kc)培養(yǎng)基培養(yǎng)60天時細長瘦弱的白芨苗圖片；圖4是本申請實施例壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)60天時健壯的白芨苗圖片。具體實施方式以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。實施例一種白芨種子快發(fā)壯生的方法包括以下步驟：1)外植體的選擇：挑選成熟飽滿未開裂的白芨蒴果；2)外植體的清洗：用細軟刷子將白芨蒴果上的泥垢在自來水中洗凈，晾干，移入超凈工作臺；3)消毒：超凈工作臺及其內部的用具用紫外燈消毒15min，用75％乙醇對白芨蒴果表面消毒30s，無菌水漂洗3次，再用0.1％氯化汞消毒10min后，無菌水清洗5-6次；4)將果實置于墊上2層無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿上，風干果實表面水分，用無菌刀將蒴果橫向切開，再用無菌鑷子取出種子均勻播散在萌發(fā)培養(yǎng)基中，置于適宜培養(yǎng)條件培育。5)轉接：種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)60天，種子萌發(fā)并長到2.0cm左右高的小苗時，轉接到壯苗培養(yǎng)基中在適宜條件下進行繼代培養(yǎng)。根據(jù)步驟4)萌發(fā)培養(yǎng)基配方是：kc基本培養(yǎng)基+0.2mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1.0mg/l萘乙酸+100g/l馬鈴薯+20g/l蔗糖+7g/l瓊脂+300mg/l活性炭構成。所述的kc培養(yǎng)基由以下組分：(nh4)2so4500mg/l，kh2po4250mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，ca(no3)21000mg/l，mnso4·4h2o7.5mg/l，feso4·7h2o25mg/l，溶劑為蒸餾水.所述kc培養(yǎng)基配置1l需要土豆100g，將其切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小塊，放入蒸餾水中攪拌，加熱20分鐘，紗布過濾殘渣取得土豆汁。所述的kc培養(yǎng)基與土豆汁、瓊脂、蔗糖、芐氨基腺嘌呤、萘乙酸混合均勻，定容至1l。根據(jù)步驟4)萌發(fā)培養(yǎng)條件：溫度25±2℃，光照1800-2500lux，光照周期＝12h/12h。所述壯苗培養(yǎng)基的配方由ms+2.5mg/l6-芐氨基腺嘌呤+1.0mg/l萘乙酸+80g/l香蕉+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂+500mg/l活性炭。所述ms培養(yǎng)基由以下組分組成：nh4no31650mg/l，kno31900mg/l，cacl2·2h2o440mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，kh2po4170mg/l；微量元素：ki0.83hmg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l；鐵鹽：feso4·7h2o27.8mg/l，na2-edta·2h2o37.3mg/l；有機物質：肌醇100mg/l，煙酸0.5mg/l，鹽酸吡哆醇(維生素b6)0.5mg/l，鹽酸硫胺素(維生素b1)0.1mg/l，甘氨酸2.0mg/l，溶劑為蒸餾水。所述ms的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質按照配方分別濃縮10倍、100倍、100倍、100倍，定容至1l制作成母液備用。所述ms培養(yǎng)基配制1l需要80g香蕉，切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小塊，放入蒸餾水中攪拌，加熱20分鐘，紗布過濾殘渣取得香蕉汁。將稱量好的瓊脂單獨置于80℃熱水中，攪拌溶解。所述的ms的母液中分別取100ml大量元素、10ml微量元素、10ml鐵鹽、10ml有機物質與香蕉汁、蔗糖、瓊脂、活性炭、芐氨基腺嘌呤、萘乙酸混合均勻制成壯苗培養(yǎng)基。配置完成后的萌發(fā)培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基，需要將ph調至6.0-6.5，調試用試劑為1mol/lhci或1mol/lnaoh，試劑使用前在121℃、0.15mpa高溫高壓滅菌20min。壯苗培養(yǎng)條件：溫度25±2℃，光照1800-2500lux，光照周期＝14h/10h，培養(yǎng)60天。表1.不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)培養(yǎng)基的影響(萌發(fā)培養(yǎng)60天)表2不同培養(yǎng)基對白芨幼苗繼代培養(yǎng)的影響(繼代培養(yǎng)60天)kc培養(yǎng)基ms培養(yǎng)基快速萌發(fā)培養(yǎng)基原球莖直徑/mm3.59±0.13a3.93±0.12b5.78±0.18c原球莖直徑提高/倍-0.9101.47莖干直徑/mm0.97±0.12a1.06±0.16a1.76±0.28b莖干直徑提高/倍-0.9201.66葉寬/葉長比0.11±0.012a0.12±0.01a0.18±0.04b葉寬/葉長比提高/倍-0.9101.5成熟無菌種子在快速萌發(fā)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)，4-5天種子開始萌動，萌發(fā)效率提高1.5倍左右，7天內萌發(fā)率達到97.65％，比ms的萌發(fā)率提高13.09％(表1)；當白芨種子在快速培養(yǎng)基中快速萌發(fā)60天后，原球莖可達2.27mm，比ms培養(yǎng)基提高1.06倍左右。選擇高2.0cm白芨苗立即轉入壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)培育，60天后，原球莖直徑可達5.78mm，原球莖直徑、莖直徑、葉寬/葉長比值都顯著高于繼續(xù)在kc或ms培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的幼苗(表2)，分別比ms中提高1.47、1.66和1.5倍。同時請參閱圖1-圖4，快速萌發(fā)培養(yǎng)基與壯苗培養(yǎng)基配合使用不但提高了種子萌發(fā)率，而且縮短了白芨壯苗的培育周期，減少了轉接頻率，降低繼代過程的污染，節(jié)約了成本，促進了原球莖膨大、莖干粗壯等。操作簡單，利于大規(guī)模工廠化。上述說明示出并描述了本申請的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解本申請并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本申請構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本申請的精神和范圍，則都應在本申請所附權利要求的保護范圍內。當前第1頁12