本發(fā)明涉及一種丹參組織培養(yǎng)中無(wú)根苗生根培養(yǎng)工藝。

背景技術(shù)：

丹參(salviamiltiorrhizabunge)是是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，又名紅根、紫丹參、大紅袍等。是我國(guó)傳統(tǒng)常用藥和多種中成藥的主要原料。以干燥的根或根莖入藥，具有活血調(diào)經(jīng)，消炎止痛，養(yǎng)血安神等功效。其主要有效成分為二貼醌類和芬酸類。作為傳統(tǒng)中藥，丹參在我國(guó)栽培歷史悠久，近年來(lái)丹參的需求量劇增，而傳統(tǒng)的繁殖方式即種子繁殖和分根繁殖都具有一定的缺陷，導(dǎo)致現(xiàn)如今丹參產(chǎn)量減少，品種退化，且容易受氣候環(huán)境的影響。而近年來(lái)興起的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅可以保持母本植株的優(yōu)良性狀，且不受氣候環(huán)境的影響就可達(dá)到高繁殖倍數(shù)。

植物組織培養(yǎng)是根據(jù)細(xì)胞的全能性理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉等)、組織(如形成層、表皮、胚乳等)或細(xì)胞(如大孢子、小孢子、體細(xì)胞等)以及原生質(zhì)層，在無(wú)菌和適宜的人工條件下，誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整植株。

近年來(lái)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已成為丹參繁殖的重要手段。在整個(gè)丹參植物組織培養(yǎng)過(guò)程中中，丹參苗生根的狀況直接決定著組培苗出瓶的存活率。因此對(duì)丹參無(wú)根苗生根工藝的優(yōu)化具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明旨在提供丹參組織培養(yǎng)中無(wú)根苗生根培養(yǎng)工藝，該工藝主要對(duì)丹參無(wú)根苗培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，只添加一種激素iba(濃度為0.2mg/l)，就可以達(dá)到最佳的生根效果，通過(guò)優(yōu)化后的工藝，不僅減少的實(shí)驗(yàn)步驟，又節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

丹參組織培養(yǎng)中無(wú)根苗生根培養(yǎng)工藝，包括以下步驟：

1)培養(yǎng)基的配制

a、激素母液的配制：稱取iba0.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用純水定容至100ml，即為濃度為1.0mg/ml的iba母液；

b、激素抽濾滅菌：將濾膜放進(jìn)抽濾頭，高壓滅菌，帶進(jìn)超凈臺(tái)，將iba母液抽濾滅菌，備用；

c、配制培養(yǎng)基基本成分：1/2ms+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；高壓滅菌；帶入超凈臺(tái)備用；

d、添加激素：在超凈臺(tái)上用無(wú)菌的移液搶吸取iba加入到基本培養(yǎng)基里，使其濃度為0.2mg/l，混勻；

e、分裝：將添加好激素的培養(yǎng)基分裝到無(wú)菌的組培瓶中，每瓶30～40ml，培養(yǎng)基成分為：1/2ms+0.2mg/liba+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；

2)丹參苗的選擇；

3)丹參苗的處理：先無(wú)菌處理再進(jìn)行修剪，修剪前剪切裝置進(jìn)行無(wú)菌處理；

4)丹參莖段的接種；

5)丹參苗的生根培養(yǎng)：接種后的莖段放置于組培室的組培架上進(jìn)行生根的誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度27±0.5℃，光照時(shí)間12h，光強(qiáng)3000lx，t5植物培養(yǎng)燈管。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)“丹參苗的選擇”是選擇粗壯無(wú)污染的丹參組培無(wú)根苗為材料，帶入超凈臺(tái)備用，并用75％酒精棉球擦拭瓶口處。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)“丹參苗的處理”是用無(wú)菌的鑷子將生長(zhǎng)良好的丹參苗鑷起，置于無(wú)菌的接種盤上，用無(wú)菌的剪切裝置減去多余葉片，將莖段剪成具有一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)的小段。

作為優(yōu)選，所述步驟(4)“丹參莖段的接種”是用無(wú)菌的鑷子將剪好的莖段鑷起，置于步驟(1)“分裝”的固體培養(yǎng)基上。

本發(fā)明的有益效果是：在現(xiàn)代丹參植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，誘導(dǎo)丹參無(wú)根苗生根通常以ms為基本培養(yǎng)基，添加6-ba、naa、iba、iaa幾種激素混合使用。一般來(lái)說(shuō)適量濃度的naa、iba、iba都會(huì)誘導(dǎo)植物生根，而6-ba作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞分化，還會(huì)抑制或促進(jìn)根系的生長(zhǎng)，一般都以naa、iba、iaa其中一種激素搭配使用6-ba誘導(dǎo)植物生根。而本發(fā)明以1/2ms為基本培養(yǎng)基，只單獨(dú)使用iba一種激素就可以誘導(dǎo)丹參無(wú)根苗生根，且生根啟動(dòng)周期短，根系發(fā)達(dá)，數(shù)量多，整株丹參苗生長(zhǎng)旺盛。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例：丹參組織培養(yǎng)中無(wú)根苗生根培養(yǎng)工藝，包括以下步驟：

1)培養(yǎng)基的配制

a、激素母液的配制：稱取iba0.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用純水定容至100ml，即為濃度為1.0mg/ml的iba母液；

b、激素抽濾滅菌：將濾膜放進(jìn)抽濾頭，高壓滅菌，帶進(jìn)超凈臺(tái)，將iba母液抽濾滅菌，備用；

c、配制培養(yǎng)基基本成分：1/2ms+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；高壓滅菌；帶入超凈臺(tái)備用；

d、添加激素：在超凈臺(tái)上用無(wú)菌的移液搶吸取iba加入到基本培養(yǎng)基里，使其濃度為0.2mg/l，混勻；

e、分裝：將添加好激素的培養(yǎng)基分裝到無(wú)菌的組培瓶中，每瓶30～40ml，培養(yǎng)基成分為：1/2ms+0.2mg/liba+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8；

2)丹參苗的選擇：選擇粗壯無(wú)污染的丹參組培無(wú)根苗為材料，帶入超凈臺(tái)備用，并用75％酒精棉球擦拭瓶口處；

3)丹參苗的處理：先無(wú)菌處理再進(jìn)行修剪，修剪前剪切裝置進(jìn)行無(wú)菌處理，具體是用無(wú)菌的鑷子將生長(zhǎng)良好的丹參苗鑷起，置于無(wú)菌的接種盤上，用無(wú)菌的剪切裝置減去多余葉片，將莖段剪成具有一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)的小段；所述剪切裝置包括無(wú)菌操作臺(tái)、底座以及無(wú)菌剪刀組，無(wú)菌剪刀組由若干個(gè)無(wú)菌剪刀組成，每個(gè)無(wú)菌剪刀與背板為可拆卸式連接，無(wú)菌剪刀組后端通過(guò)背板一體連接，所述背板通過(guò)鉸接軸與底座鉸接連接，無(wú)菌操作臺(tái)上沿長(zhǎng)度方向設(shè)有剪切槽，剪切槽在剪切前也采用無(wú)菌處理，剪切槽上設(shè)置若干個(gè)剪切孔，一個(gè)剪切孔對(duì)應(yīng)一個(gè)無(wú)菌剪刀，具體的無(wú)菌剪刀設(shè)有2個(gè)，剪切孔設(shè)有2個(gè)，當(dāng)進(jìn)行莖段剪切時(shí)，向下移動(dòng)無(wú)菌剪刀組，通過(guò)無(wú)菌剪刀與剪切孔的相互配合能夠剪切截面整體，剪切好的莖段，保證培養(yǎng)過(guò)程中每個(gè)莖段比較整齊的長(zhǎng)勢(shì)；

4)丹參莖段的接種：用無(wú)菌的鑷子將剪好的莖段鑷起，置于1/2ms固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基成分為1/2ms+0.2mg/liba+30g/l蔗糖+5.26g/l瓊脂，ph5.8，高壓滅菌；

5)丹參苗的生根培養(yǎng)：接種后的莖段放置于組培室的組培架上進(jìn)行生根的誘導(dǎo)，記錄丹參生根的啟動(dòng)時(shí)間，并在30天后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)丹參苗生根的數(shù)量，生長(zhǎng)情況；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度27±0.5℃，光照時(shí)間12h，光強(qiáng)3000lx，t5植物培養(yǎng)燈管。

目前誘導(dǎo)丹參生根以ms為基本培養(yǎng)基，混合使用兩種或兩種以上的激素，本發(fā)明以1/2ms為基本培養(yǎng)基，只添加一種激素iba(濃度為0.2mg/l)，就可以達(dá)到最佳的生根效果。通過(guò)優(yōu)化后的工藝，不僅減少的實(shí)驗(yàn)步驟，又節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。

iba作為一種廣譜型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其主要用途是促進(jìn)多種植物插枝生根及某些移栽作物的早生根、多生根。在整個(gè)丹參無(wú)根苗生根的工藝過(guò)程中，本發(fā)明的材料是丹參的無(wú)根苗，由于植物體本身就可以合成一些激素，因此在后期誘導(dǎo)生根的過(guò)程，只需給它營(yíng)養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)其早生根、多生根的激素—iba，就可以在短時(shí)間內(nèi)獲得根系發(fā)達(dá)的丹參組培苗。且在具體實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明，naa、iaa的生根效果都不如iba，naa雖然也有促進(jìn)植物生根的效果，但是在較高濃度下有抑制莖、枝生長(zhǎng)的副作用，iaa在使用時(shí)進(jìn)入植物體內(nèi)易被過(guò)氧化酶、吲哚乙酸氧化酶分解，會(huì)從而降低其作用效果，且兩種誘導(dǎo)生根的啟動(dòng)時(shí)間都比iba長(zhǎng)。而有無(wú)6-ba對(duì)生根影響不大，因?yàn)橹参矬w自身合成的6-ba已經(jīng)夠丹參生根這一階段所用，若再人工加入6-ba則會(huì)起到反作用。

在具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，本發(fā)明以航天丹參未生根的無(wú)菌苗作為材料，ms為基本培養(yǎng)基首先加以單一的naa，比較不同濃度的生根效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)naa濃度低于1.5mg/l時(shí)，無(wú)根丹參都會(huì)不同程度的長(zhǎng)出根，當(dāng)濃度高度1.5mg/l生根效果開(kāi)始變差，當(dāng)濃度達(dá)到2.0mg/l，無(wú)根苗基本不生根，只是在基部膨大，并出現(xiàn)少量愈傷，濃度在1.0mg/l時(shí)生根效果最好。

表1：不同濃度naa對(duì)丹參丹參無(wú)根苗生根的影響

在對(duì)比iba的生根效果時(shí)同樣以ms為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的iba，低濃度的生根效果好于高濃度，且生根啟動(dòng)時(shí)間短，根長(zhǎng)勢(shì)好。

表2：不同濃度iba對(duì)丹參丹參無(wú)根苗生根的影響

在單獨(dú)使用iaa時(shí)，同樣低濃度的生根效果好于高濃度，但是生根啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，且單棵丹參苗的根數(shù)目不多。

表3：不同濃度iaa對(duì)丹參丹參無(wú)根苗生根的影響

通過(guò)對(duì)比，對(duì)于丹參來(lái)說(shuō)，iba的生根效果要明顯優(yōu)于naa和iba。在最優(yōu)的生根激素以及相應(yīng)的濃度(iba0.2mg/l)基礎(chǔ)上附加6-ba，觀察丹參無(wú)根苗的生根及生長(zhǎng)情況。上述結(jié)果表明低濃度的6-ba在一定程度可促進(jìn)根的生長(zhǎng)，而高濃度的6-ba抑制根的生長(zhǎng)，但是通過(guò)比較表2與表4發(fā)現(xiàn)：iba濃度為0.2mg/l時(shí)，添加6-ba與未添加6-ba并沒(méi)有太大差別。

表4：不同濃度激素組合對(duì)丹參無(wú)根苗生根的影響

通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明，以ms為基本培養(yǎng)基，只要添加單一激素iba，且濃度在0.2mg/l時(shí)，就可以達(dá)到約99％的生根率。此外對(duì)比了ms為基本培養(yǎng)基與1/2ms為基本培養(yǎng)基丹參無(wú)根苗生根的差異，結(jié)果表明，在以1/2ms為基本培養(yǎng)基，丹參無(wú)根苗的生根率達(dá)到100％。從節(jié)約成本方面考慮，選擇以1/2ms為基本培養(yǎng)基，添加0.2mg/liba為單身無(wú)根苗生根的最佳培養(yǎng)基。

表5：ms培養(yǎng)基與1/2ms培養(yǎng)基對(duì)丹參無(wú)根苗生根的影響

表6：丹參無(wú)根苗生根工藝優(yōu)化后培養(yǎng)結(jié)果

表6：丹參無(wú)根苗生根工藝優(yōu)化后培養(yǎng)結(jié)果

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。