本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)方法，更具體的涉及一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

大花胡麻草(centrantheragrandiflorabench.)，玄參科胡麻草屬植物，別名化血丹、紅根野蠶豆、野蠶豆根、小紅藥、靈芝草等，主要分布于我國(guó)云南、貴州、廣西等地及印度、緬甸等地。大花胡麻草生物學(xué)特征為全株被剛毛，須根為銹紅色，莖部剛硬，具分枝；葉片對(duì)生，無(wú)葉柄，長(zhǎng)圓形或條形，全緣；花腋生，花萼為佛焰苞狀，苞片為葉狀，花冠為管狀，棕黃色。為云南民間名貴的地方中藥，藥用根，經(jīng)化學(xué)分析鑒定其根部含環(huán)烯醚萜苷如桃葉珊瑚苷、玉葉金花苷、8-表番土鱉酸、8-表番土鱉堿、玉葉金花酸、梓醇等化學(xué)成分及杜鵑紅素、甘露醇等化合物，具有消腫散瘀、止血止痛等作用，可用于治療女性痛經(jīng)、閉經(jīng)及風(fēng)濕骨痛、跌打損傷，還對(duì)心腦血管疾病具有顯著療效，具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

由于大花胡麻草根經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，其市場(chǎng)需求逐年增加，而目前野生資源已被大量開(kāi)采。大花胡麻草對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，其種子發(fā)芽率低，生長(zhǎng)慢，遠(yuǎn)不能滿足需求。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖并成功生根移栽，對(duì)于解決資源緊缺和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)具有重要的意義。前人在大花胡麻草的組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)已進(jìn)行了相關(guān)研究，但其組織培養(yǎng)過(guò)程中諸如外植體污染嚴(yán)重、繁殖系數(shù)低等問(wèn)題還沒(méi)得到有效解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，且可以提高繁殖系數(shù)、移栽成活率高的大花胡麻草組織培養(yǎng)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的提供一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，該方法包括：(1)外植體選擇和預(yù)處理；(2)種子萌發(fā)培養(yǎng)；(3)實(shí)生苗分化增殖培養(yǎng)；(4)分割苗誘導(dǎo)生根培養(yǎng)；(5)煉苗與移栽；

所述外植體選擇和預(yù)處理步驟中，選擇野外收集的大花胡麻草種子作為外植體，然后對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理；

所述種子萌發(fā)培養(yǎng)步驟中，將經(jīng)過(guò)處理的大花胡麻草種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3周后獲得無(wú)菌實(shí)生苗；

所述實(shí)生苗分化增殖培養(yǎng)步驟中，選擇1-2cm高的無(wú)菌實(shí)生苗在超凈工作臺(tái)上接種于增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4周后獲得組培叢芽；

所述分割苗誘導(dǎo)生根培養(yǎng)步驟中，將獲得的4-6cm長(zhǎng)苗的組培叢芽進(jìn)行分割處理，將分割苗接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)，獲得組培苗；

所述煉苗與移栽步驟中，當(dāng)根長(zhǎng)達(dá)到2-5cm時(shí)，進(jìn)行煉苗3-5天，后取出組培苗，進(jìn)行移栽。

優(yōu)選的，所述外植體選擇和預(yù)處理步驟中：在收集的大花胡麻草種子中，挑選種莢未開(kāi)裂的種子作為外植體，然后進(jìn)行預(yù)處理；

所述預(yù)處理包括前處理與消毒滅菌處理步驟；

其中，所述前處理步驟為：先用75wt％酒精擦拭種莢表面，將種子破殼取出后置于滅菌的1.5ml的離心管中，加入1ml無(wú)菌水浸泡1-2h，待種子吸足水分后，在1000rpm的條件下離心3-5min，倒掉上清液，準(zhǔn)備下一步消毒；

所述消毒滅菌處理步驟為：將前處理后的種子置于超凈工作臺(tái)中，用75％的酒精消毒30-60秒，再用體積濃度為0.1％的升汞浸泡8-10min，后使用無(wú)菌水沖洗6-8次。

優(yōu)選的，所述種子萌發(fā)培養(yǎng)步驟中，所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為在ms培養(yǎng)基中添加蔗糖20-30g/l、瓊脂粉6-7g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.5-6.0所得的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基置于透明玻璃培養(yǎng)瓶中并給予光照10-12h/天，其中，光照強(qiáng)度為1500-2000lx，溫度為25℃±2℃，在此條件下培養(yǎng)2-3周誘導(dǎo)種子萌發(fā)出苗。

進(jìn)一步的，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至5.8。

優(yōu)選的，所述實(shí)生苗分化增殖培養(yǎng)步驟中，所述增殖培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)0.4-0.6mg/l、萘乙酸(naa)0.04-0.06mg/l、蔗糖20-30g/l以及瓊脂粉6-7g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.5-6.0所得的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基置于透明玻璃培養(yǎng)瓶中并給予光照12-14h/天，其中，光照強(qiáng)度為1500-2000lx，溫度為25℃±2℃。

優(yōu)選的，所述分割苗誘導(dǎo)生根培養(yǎng)步驟中，所述生根培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加萘乙酸(naa)0.1-0.3mg/l，蔗糖20-30g/l以及瓊脂粉6-7g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.5-6.0所得的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基置于透明玻璃培養(yǎng)瓶中并給予光照12-14h/天，光照強(qiáng)度為1500-2000lx，溫度為25℃±2℃。

進(jìn)一步的，所述的wpm培養(yǎng)基以一升為量計(jì)算由如下成分組成：nh4no3400mg·l^-1，ca(no3)2·4h2o556mg·l^-1，k2so4990mg·l^-1，cacl2·2h2o96mg·l^-1，kh2po4170mg·l^-1，na2moo4·2h2o0.25mg·l^-1，mgso4·7h2o370mg·l^-1，mnso4·h2o22.4mg·l^-1，znso4·7h2o8.6mg·l^-1，cuso4·5h2o0.25mg·l^-1，feso4·7h2o27.8mg·l^-1，na2-edta37.3mg·l^-1；肌醇100mg·l^-1，維生素b11.0mg·l^-1，煙酸0.5mg·l^-1，維生素b60.5mg·l^-1，甘氨酸2.0mg·l^-1，蔗糖20g·l^-1，瓊脂6g·l^-1；ph調(diào)節(jié)至5.8。

進(jìn)一步的，所述的增殖培養(yǎng)基中含有6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/l、萘乙酸0.05mg/l；所述生根培養(yǎng)基中含有萘乙酸0.2mg/l。

進(jìn)一步的，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中分別含有活性炭0.5-0.8g/l。

優(yōu)選的，在步驟(4)生根培養(yǎng)結(jié)束后，取出的組培苗，先洗凈根上的培養(yǎng)基，然后將苗移植到基質(zhì)中，并用透氣蓋遮蓋，保持空氣濕度在85％-90％，至新根長(zhǎng)出(約20天)，正常養(yǎng)護(hù)，移栽成活率可達(dá)80％。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明改進(jìn)了外植體消毒程序、分化增殖培養(yǎng)基本培養(yǎng)基及添加激素，提高繁殖效率，具體通過(guò)對(duì)大花胡麻草組織培養(yǎng)過(guò)程中種子消毒方法、增殖培養(yǎng)方法、誘導(dǎo)生根方法進(jìn)行改進(jìn)，解決了種子易污染、繁殖系數(shù)低、易褐化問(wèn)題，通過(guò)本方法培養(yǎng)出的大花胡麻組培苗繁殖系數(shù)高、生長(zhǎng)速度快、移栽成活率高；此外，本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)便易行、可操作性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。

2、本發(fā)明采用一套系統(tǒng)科學(xué)的組織培養(yǎng)方法，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的種子消毒步驟，種子處理更簡(jiǎn)便，種子成活率更高。

3、本發(fā)明根據(jù)大花胡麻草的生長(zhǎng)習(xí)性采取wpm培養(yǎng)基再生苗長(zhǎng)勢(shì)好，繁殖系數(shù)高、生長(zhǎng)速度快、再生無(wú)玻璃化現(xiàn)象。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，其首先采用離體組織培養(yǎng)獲得組培苗，然后煉苗、移栽即得大花胡麻草種苗，其中離體組織培養(yǎng)包括如下步驟：

(1)、外植體選擇和預(yù)處理步驟：挑選種莢未開(kāi)裂的大花胡麻草種子為起始材料，用75％酒精擦拭表面，將種子破殼取出后用作組織培養(yǎng)繁殖的外植體。將該外植體置于滅菌的1.5ml離心管中，加入1ml無(wú)菌水浸泡1-2h，待種子吸足水分后，1000rpm離心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中進(jìn)行30-60s消毒處理，然后在重量體積比濃度為0.1％的升汞溶液中進(jìn)行8-10min的殺菌處理，再用無(wú)菌水沖洗6-8次，完成對(duì)所述大花胡麻草種子的消毒滅菌處理。

(2)、種子萌發(fā)培養(yǎng)步驟：在超凈工作臺(tái)上將種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)在每天光照10-12h，光照強(qiáng)度為1500-2000lx以及溫度為25℃±2℃的條件下進(jìn)行，培養(yǎng)2-3周，獲得無(wú)菌實(shí)生苗，其中種子培養(yǎng)基為在ms基本培養(yǎng)基中添加有蔗糖25g/l、活性炭0.6g/l、瓊脂粉6.5g/l，并調(diào)節(jié)ph為5.8所得的培養(yǎng)基。

(3)實(shí)生苗分化增殖培養(yǎng)步驟：將萌發(fā)后1-2cm高的大花胡麻草無(wú)菌實(shí)生苗接種于增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-4周，獲得組培叢芽，其中，增殖培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加有6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)0.5mg/l、萘乙酸(naa)0.05mg/l、活性炭0.6g/l、蔗糖25g/l以及瓊脂粉6.5g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.8所得的培養(yǎng)基。

(4)、分割苗誘導(dǎo)生根培養(yǎng)步驟：將獲得的組培叢芽中4-6cm長(zhǎng)苗分割后接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，其中所述生根培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加萘乙酸(naa)0.2mg/l，蔗糖25g/l以及活性炭0.6g/l、瓊脂粉6.5g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.8所得的培養(yǎng)基。

實(shí)施例2

一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，其首先采用離體組織培養(yǎng)獲得組培苗，然后煉苗、移栽即得大花胡麻草種苗，其中離體組織培養(yǎng)包括如下步驟：

(1)、外植體選擇和預(yù)處理步驟：挑選種莢未開(kāi)裂的大花胡麻草種子為起始材料，用75％酒精擦拭表面，將種子破殼取出后用作組織培養(yǎng)繁殖的外植體。將該外植體置于滅菌的1.5ml離心管中，加入1ml無(wú)菌水浸泡1-2h，待種子吸足水分后，1000rpm離心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中進(jìn)行30-60s消毒處理，然后在重量體積比濃度為0.1％的升汞溶液中進(jìn)行8-10min的殺菌處理，再用無(wú)菌水沖洗6-8次，完成對(duì)所述大花胡麻草種子的消毒滅菌處理。

(2)、種子萌發(fā)培養(yǎng)步驟：在超凈工作臺(tái)上將種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)在每天光照10-12h，光照強(qiáng)度為1500-2000lx以及溫度為25℃±2℃的條件下進(jìn)行，培養(yǎng)2-3周，獲得無(wú)菌實(shí)生苗，其中種子培養(yǎng)基為在ms基本培養(yǎng)基中添加有蔗糖30g/l、活性炭0.8g/l、瓊脂粉7g/l，并調(diào)節(jié)ph為6所得的培養(yǎng)基。

(3)實(shí)生苗分化增殖培養(yǎng)步驟：將萌發(fā)后1-2cm高的大花胡麻草無(wú)菌實(shí)生苗接種于增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-4周，獲得組培叢芽，其中，增殖培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加有6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)0.6mg/l、萘乙酸(naa)0.06mg/l、活性炭0.8g/l、蔗糖30g/l以及瓊脂粉7g/l，并調(diào)節(jié)ph至6所得的培養(yǎng)基。

(4)、分割苗誘導(dǎo)生根培養(yǎng)步驟：將獲得的組培叢芽中4-6cm長(zhǎng)苗分割后接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，其中所述生根培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加萘乙酸(naa)0.3mg/l，蔗糖30g/l以及活性炭0.8g/l、瓊脂粉7g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.8所得的培養(yǎng)基。

實(shí)施例3

一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，其首先采用離體組織培養(yǎng)獲得組培苗，然后煉苗、移栽即得大花胡麻草種苗，其中離體組織培養(yǎng)包括如下步驟：

(1)、外植體選擇和預(yù)處理步驟：挑選種莢未開(kāi)裂的大花胡麻草種子為起始材料，用75％酒精擦拭表面，將種子破殼取出后用作組織培養(yǎng)繁殖的外植體。將該外植體置于滅菌的1.5ml離心管中，加入1ml無(wú)菌水浸泡1-2h，待種子吸足水分后，1000rpm離心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中進(jìn)行30-60s消毒處理，然后在重量體積比濃度為0.1％的升汞溶液中進(jìn)行8-10min的殺菌處理，再用無(wú)菌水沖洗6-8次，完成對(duì)所述大花胡麻草種子的消毒滅菌處理。

(2)、種子萌發(fā)培養(yǎng)步驟：在超凈工作臺(tái)上將種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)在每天光照10-12h，光照強(qiáng)度為1500-2000lx以及溫度為25℃±2℃的條件下進(jìn)行，培養(yǎng)2-3周，獲得無(wú)菌實(shí)生苗，其中種子培養(yǎng)基為在ms基本培養(yǎng)基中添加有蔗糖20g/l、活性炭0.5g/l、瓊脂粉6g/l，并調(diào)節(jié)ph為5.5所得的培養(yǎng)基。

(3)實(shí)生苗分化增殖培養(yǎng)步驟：將萌發(fā)后1-2cm高的大花胡麻草無(wú)菌實(shí)生苗接種于增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-4周，獲得組培叢芽，其中，增殖培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加有6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)0.4mg/l、萘乙酸(naa)0.04mg/l、活性炭0.5g/l、蔗糖20g/l以及瓊脂粉6g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.5所得的培養(yǎng)基。

(4)、分割苗誘導(dǎo)生根培養(yǎng)步驟：將獲得的組培叢芽中4-6cm長(zhǎng)苗分割后接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，其中所述生根培養(yǎng)基為在wpm培養(yǎng)基中添加萘乙酸(naa)0.1mg/l，蔗糖20g/l以及活性炭0.5g/l、瓊脂粉6g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.5所得的培養(yǎng)基。

實(shí)施例4

本實(shí)施例的一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，其離體組織培養(yǎng)基本步驟同實(shí)施例1，不同的是，步驟(3)中，采用的分化增殖培養(yǎng)基的成分為wpm培養(yǎng)基中添加有6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)0.8mg/l、萘乙酸(naa)0.08mg/l、活性炭0.8g/l、蔗糖30g/l以及瓊脂粉6.5g/l，并調(diào)節(jié)ph至5.8所得的培養(yǎng)基。

對(duì)比例1

本實(shí)施例的一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，其離體組織培養(yǎng)基本步驟同實(shí)施例1，不同的是，所有培養(yǎng)基中均沒(méi)有添加活性炭。

對(duì)比上述實(shí)施例1～4及對(duì)比例1的培養(yǎng)結(jié)果如下：

實(shí)施例1至3中，種子消毒后組織培養(yǎng)，無(wú)菌率均控制在95％～100％；增殖培養(yǎng)系數(shù)為1：4；外植體長(zhǎng)勢(shì)最好，沒(méi)有玻璃化現(xiàn)象。

實(shí)施例4中，種子消毒后組織培養(yǎng)，無(wú)菌率控制在95％～100％；增殖培養(yǎng)系數(shù)為1：6，在實(shí)施例4中發(fā)現(xiàn)有的外植體有玻璃化現(xiàn)象。

對(duì)比例1中，種子消毒后組織培養(yǎng)，無(wú)菌率控制在95％～100％；褐化死亡率明顯高于實(shí)施例1-4，說(shuō)明培養(yǎng)基中添加的活性炭對(duì)外植體有較好的抗褐化效果，且對(duì)離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育幾乎無(wú)影響。

此外，實(shí)施例1～4的移栽成活率可達(dá)86％，對(duì)比例1的移栽成活率可達(dá)80％。

對(duì)比例2

本實(shí)施例的一種大花胡麻草組織培養(yǎng)方法，其離體組織培養(yǎng)基本步驟同實(shí)施例1，不同的是，增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基。

對(duì)比上述實(shí)施例1～4及對(duì)比例2的培養(yǎng)結(jié)果如下：

種子消毒后組織培養(yǎng)，無(wú)菌率均控制在95％～100％。

實(shí)施例1～4中，增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)基本培養(yǎng)基為wpm培養(yǎng)基，所獲得再生苗植株健壯，葉片為健康的綠色，增殖系數(shù)大于1：4，移栽成活率均大于80％。

對(duì)比例2中，在ms基本培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)效果差，增殖系數(shù)小于1：4，葉片發(fā)黃，移栽成活率低。

綜上可見(jiàn)，本發(fā)明通過(guò)對(duì)大花胡麻草組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體滅菌方法、分化增殖培養(yǎng)方法、生根培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的選擇進(jìn)行改進(jìn)，有效解決了大花胡麻草外植體消毒易污染、易褐化等難題，為其快速繁殖提供了有效的技術(shù)支持，解決了目前大花胡麻草野生資源少、難繁殖的問(wèn)題，為滿足當(dāng)前市場(chǎng)需求提供新的途徑。

上述僅為本發(fā)明的部分優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明并不僅限于實(shí)施例的內(nèi)容。對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明技術(shù)方案的構(gòu)思范圍內(nèi)可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。