本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種平歐雜種榛葉片再生不定芽的擴(kuò)繁方法。

背景技術(shù)：

在生產(chǎn)中，榛子苗木主要以壓條法繁殖，壓條技術(shù)現(xiàn)已基本成熟。但是榛樹每年根部新萌出的枝條有限，使得壓條繁殖的系數(shù)比較低，育苗速度較慢，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)中對(duì)榛苗的大量需求。嫁接繁育時(shí)，苗木產(chǎn)生大量的根蘗，從而給生產(chǎn)和管理帶來許多不便，所以很少采用。近些年，我國(guó)科研工作者雖然在棒子的扦插和組織培養(yǎng)方而取得了一定進(jìn)展，但在生產(chǎn)上應(yīng)用的效果并不穩(wěn)定，故而也較少采用。截止目前，還沒有找到一種比壓條更為簡(jiǎn)單而高效的快速繁殖榛苗的方法。

目前，國(guó)內(nèi)的榛子組培雖然取得了一些進(jìn)展，但離生產(chǎn)還有一定距離，目前我國(guó)還未建立起適用范圍廣的榛子組培基本培養(yǎng)基，選用的外植體仍局限于芽、嫩梢、莖段等幼嫩組織，用成苗的器官、組織誘導(dǎo)脫分化的報(bào)道極少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種平歐雜種榛葉片再生不定芽的擴(kuò)繁方法，解決了用于平歐雜種榛組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基、激素配比，及用于組織培養(yǎng)的消毒不合理，進(jìn)而導(dǎo)致平歐雜種榛組織成活率低，培養(yǎng)不易成功的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種平歐雜種榛葉片再生不定芽的擴(kuò)繁方法，包括以下步驟：

(1)取大田栽培的平歐雜種榛嫩葉作為組織培養(yǎng)的外植體；

(2)將上述外植體用濃度為70～75體積％的酒精消毒10～30s，再用濃度為0.08～0.12體積％的hgcl2消毒5min，沖洗后備用；

(3)將消毒后的外植體剪成長(zhǎng)條狀，接種到含有于含有細(xì)胞生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的1/2dkw培養(yǎng)基或改良ms培養(yǎng)基中，葉片正面朝下放置，黑暗處理14d，得到愈傷組織；

(4)將愈傷組織培養(yǎng)至1/2dkw培養(yǎng)基或改良ms培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，所述1/2dkw培養(yǎng)基或改良ms培養(yǎng)基中含有0.6mg/l6-ba+0.8mg/liaa或2mg/l6-ba+1.4mg/lnaa，誘導(dǎo)時(shí)間為30天，得到平歐雜種榛再生不定芽。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的組合為：tdz3mg/l+iba0.5mg/l，或

tdz3mg/l+iba0.3mg/l，或

tdz2mg/l+iba0.5mg/l，或

tdz2mg/l+iba0.3mg/l，或

tdz2mg/l+naa0.03mg/l，或

6-ba2mg/l+naa3mg/l，或

2-4，d0.5mg/l+iaa0.5mg/l。

優(yōu)選的，所述1/2dkw培養(yǎng)基或改良ms培養(yǎng)基中還含有30g/l葡萄糖。

優(yōu)選的，所述1/2dkw培養(yǎng)基或改良ms培養(yǎng)基ph值為5.8。

優(yōu)選的，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：溫度控制為23℃～25℃，光照時(shí)間12～16h，光照強(qiáng)度2000～3000lx。

現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)葉片愈傷組織，在以光照培養(yǎng)箱內(nèi)水培枝條長(zhǎng)出的葉片，春天大田里剛萌發(fā)的葉片和組培葉片為試材進(jìn)行的試驗(yàn)表明，大田剛萌發(fā)的葉片帶菌少，生命力強(qiáng)，消毒較容易且后期長(zhǎng)勢(shì)較好，最佳的消毒方法是用hgcl2消毒5min，成活率能達(dá)到52.0％。

2)在以1/2dkw、dkw、改良ms和nrm為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)葉片愈傷時(shí)，1/2dkw和改良ms效果較好，誘導(dǎo)率能達(dá)到100％。葉片反面朝上放置要比正面朝上放置效果佳，黑暗處理有利于愈傷組織的形成，其中以黑暗處理14天，誘導(dǎo)的愈傷形態(tài)最佳。

3)本發(fā)明試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)愈傷組織較適宜的激素組合有tdz3mg/l+iba0.5mg/l，tdz3mg/l+iba0.3mg/l，tdz2mg/l+iba0.5mg/l，tdz2mg/l+iba0.3mg/l，tdz2mg/l+naa0.03mg/l，6-ba2mg/l+naa3mg/l，2-4，d0.5mg/l+iaa0.5mg/l，誘導(dǎo)率都能達(dá)到100％，榛子誘導(dǎo)出愈傷組織比較容易。

4)從愈傷組織中誘導(dǎo)不定芽比較困難，目前發(fā)現(xiàn)6-ba0.6mg/l+iaa0.8mg/l和6-ba2mg/l+naa1.4mg/l，各誘導(dǎo)出了4個(gè)不定芽，即榛子可以通過再生途徑長(zhǎng)出新植株。

附圖說明

圖1不同來源葉片的成活情況。

圖2不同處理所形成的愈傷組織；a：暗培養(yǎng)21天所形成的愈傷組織，b：tdz和iba激素組合所形成的愈傷組織，c：tdz2mg/l+naa0.03mg/l所長(zhǎng)愈傷組織，d：tdz3mg/l+iba0.5mg/l所誘導(dǎo)的不定芽。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

1材料與方法

如無特別說明，本試驗(yàn)每升培養(yǎng)基中瓊脂7g，據(jù)試驗(yàn)需求添加其他激素，調(diào)節(jié)ph5.8，分裝后121℃高壓滅菌20min。接種后放到培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度控制在23℃左右，光照時(shí)間12～16h，光照強(qiáng)度2000～3000lx。

1.1試驗(yàn)材料

選取平歐雜交榛達(dá)維、玉墜、遼榛3號(hào)室內(nèi)水培枝條長(zhǎng)出的嫩葉、室外枝條萌發(fā)的嫩葉和其組培苗葉片進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，選取的葉片要求其形狀色澤基本一致，從而使外植體在生理狀態(tài)上保持基本一致。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葉片的消毒

非組培苗的葉片從枝條摘下后用流水沖洗0.5個(gè)小時(shí)，洗衣粉水浸泡10min，清水洗凈，轉(zhuǎn)移到無菌操作臺(tái)上進(jìn)行“75％酒精浸泡20s→無菌水沖洗4～5次→naclo(6min、8min、10min)或hgcl2(3min、5min、7min)消毒→無菌水沖洗5～6次”。接種于培養(yǎng)基中，3天后開始觀察記錄、持續(xù)一個(gè)月，統(tǒng)計(jì)各處理的污染率(污染的葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù))、褐化率(褐化葉片/接種總?cè)~片數(shù))和成活率(成活葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù))篩選最佳消毒方式。

1.2.2不同來源葉片的篩選

將消毒后葉片和組培苗葉片剪去邊緣，再把葉片剪成寬0.3cm，長(zhǎng)1cm左右的長(zhǎng)條，接種到含有3.0mg/ltdz+0.5mg/liba的1/2dkw培養(yǎng)基中，3天后開始觀察記錄、持續(xù)一個(gè)月，統(tǒng)計(jì)各處理的污染率，褐化及失水率(褐化或失水死亡葉片/接種總?cè)~片)和成活率。

1.2.3基本培養(yǎng)基的篩選

將處理好的葉片分別接種于含有3.0mg/ltdz+0.5mg/liba的1/2dkw、dkw、nrm和改良ms培養(yǎng)基(nh4no3和kno3的用量變?yōu)閙s培養(yǎng)基的1/4)中，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)其出愈天數(shù)和出愈率。如無特別說明，每升培養(yǎng)基中附加30g葡萄糖，ph值為5.8，培養(yǎng)溫度25℃左右。前期暗培養(yǎng)時(shí)間為14天。

表1：nrm、dkw、wpm和ms培養(yǎng)基的各成分含量比較

1.2.4葉片放置方式的篩選

以84-69組培苗葉片為材料，剪成小塊后接種到含有3.0mg/ltdz+0.5mg/liba的1/2dkw的培養(yǎng)基中，按葉片正反面放置，觀察記錄出愈天數(shù)并統(tǒng)計(jì)其出愈率(出愈葉片數(shù)/成活葉片數(shù))。

1.2.5黑暗處理篩選

將接種于含有3.0mg/ltdz+0.5mg/liba的1/2dkw培養(yǎng)基中的葉片，分別進(jìn)行0d、7d、14d、21d的黑暗處理，觀察記錄出愈天數(shù)、愈傷長(zhǎng)勢(shì)并統(tǒng)計(jì)出愈率。

1.2.6誘導(dǎo)愈傷激素組合的篩選

將葉片培養(yǎng)在含有以下激素組合的上步篩選出的最佳培養(yǎng)基中，一個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)其出愈率和愈傷生長(zhǎng)和出芽情況。

1.2.7誘導(dǎo)不定芽激素組合篩選

將愈傷組織培養(yǎng)在含有以下激素組合的培養(yǎng)基中，一個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)愈傷長(zhǎng)芽情況。

2結(jié)果與分析

2.1最佳消毒方法的確定

表2不同消毒方式對(duì)榛子葉片污染率、褐化率、成活率的影響

由表中可以得出，不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)葉片的消毒效果顯著不同。兩種消毒劑的處理都隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)污染率有所下降，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化越來越嚴(yán)重。與莖段表現(xiàn)出相似的消毒情況，可能是由于隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)葉片的傷害加劇造成的。naclo的處理褐化率都比較高，成活率為0，這可能是由naclo的強(qiáng)氧化性造成的。hgcl2消毒處理5min時(shí)，成活率達(dá)到52.0％，顯著高于其他處理，污染率也達(dá)到了較低的46.4％。綜合考慮榛子嫩葉的最佳消毒處理方式是0.1％hgcl2處理5min。

2.2最佳來源葉片

從圖1中可以看出，污染率最高的是水培長(zhǎng)出的葉，枝條培養(yǎng)于光照培養(yǎng)中，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度較高，濕度較大，適合微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致葉片上有大量雜菌造成的。組培苗的失水死亡比較嚴(yán)重，能達(dá)到56.3％。大田里的嫩葉，消毒后，成活率比較高的，并且其葉片長(zhǎng)勢(shì)也比較好。

2.3基本培養(yǎng)基的篩選

表3不同基本培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)愈傷的影響

不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷的誘導(dǎo)效果不同，生長(zhǎng)于1/2dkw和改良ms培養(yǎng)基中的葉片，其出愈率都能達(dá)到100％。并且出愈天數(shù)也較短。

2.4葉片最佳放置方式表

表4葉片放置方式對(duì)葉片愈傷組織形成的影響

由表4中可以看出，葉片正面朝下放置時(shí)，不僅出愈的天數(shù)較短，并且出愈率也較高。原因可能是正面朝下放置打破了葉片原有的極性，易于形成愈傷。愈傷組織形成的最初部位是主脈處，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，側(cè)脈處和切口的其他各處也逐漸形成愈傷組織。

2.5最佳黑暗處理時(shí)間

表5黑暗處理時(shí)間對(duì)愈傷組織形成的影響

黑暗處理時(shí)間的不同對(duì)葉片愈傷組織的形成時(shí)間、出愈率和愈傷形態(tài)有很大的影響。從表5中可看出未經(jīng)黑暗處理的葉片誘導(dǎo)出愈傷的時(shí)間顯著比經(jīng)過黑暗處理的長(zhǎng)并且誘導(dǎo)率也較低。接種初期對(duì)葉片進(jìn)行黑暗處理14d后再轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)，葉片組織誘導(dǎo)愈傷的天數(shù)為7.7d，出愈率達(dá)到100，暗培養(yǎng)時(shí)間21d時(shí)，愈傷長(zhǎng)的發(fā)白且疏散，生命力不強(qiáng)，后期容易褐化死亡(見圖2a)。黑暗處理中長(zhǎng)出的愈傷為黃色，轉(zhuǎn)到光照下一到兩天，愈傷組織轉(zhuǎn)為淡綠色。對(duì)于離體再生來說，前期的暗培養(yǎng)是必要的，最佳的暗培養(yǎng)天數(shù)是14d。

2.6誘導(dǎo)愈傷激素組合的篩選

從表6中可以看出編號(hào)為1、2、4、5、12、18、20的激素組合，其愈傷的誘導(dǎo)率都能達(dá)到100，但是，不同激素組合的處理，形成的愈傷質(zhì)地及形態(tài)不同，總體而講，tdz和iba激素組合的處理，形成的愈傷組織以綠色為主，大部分比較干澀(見圖2b)隨著細(xì)胞生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比值的降低，其誘導(dǎo)率是逐漸降低的。naa與tdz激素組合的處理，形成的愈傷組織較濕潤(rùn)并且以黃白為主，tdz2mg/l+naa0.03mg/l黃白色愈傷組織后期轉(zhuǎn)為紫紅色的愈傷組織(見圖2c)，naa在與6-ba組合時(shí)，其愈傷組織主要為淺綠色的顆粒，在這兩類激素組合中，愈傷組織的顏色及質(zhì)地的區(qū)別主要由細(xì)胞分裂色的種類及濃度影響的。在2-4，d和iaa激素組合里，愈傷組織比較濕潤(rùn)，顏色以黃為主。tdz有比較高的生物活性，在naa相同濃度時(shí)，tdz的誘導(dǎo)率要顯著高于6-ba的。其中在tdz3mg/l+iba0.5mg/l的處理中，后期愈傷組織長(zhǎng)出了一個(gè)不定芽(見圖2d)，tdz2mg/l+naa0.03mg/l的處理中，后期愈傷組織長(zhǎng)出了三個(gè)不定芽。

表6不同激素組合對(duì)榛子葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

2.7誘導(dǎo)不定芽激素組合篩選

表7誘導(dǎo)出不定芽的激素組合

不同激素組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有顯著的差異，當(dāng)6-ba0.6mg/l+iaa0.8mg/l和6-ba2mg/l+naa1.4mg/l時(shí)，各能誘導(dǎo)出4個(gè)不定芽。

3討論

3.1消毒及葉片篩選

本發(fā)明試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用naclo處理的葉片褐化率極顯著高于hgcl2，一般都認(rèn)為褐化是由多酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化為醌類物質(zhì)導(dǎo)致的，醌類物質(zhì)會(huì)抑制很多代謝酶的活性，嚴(yán)重的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致死亡。所以本現(xiàn)象可能是由于該品種(系)榛子葉片內(nèi)含有較多的酚類物質(zhì)被naclo的氧化了。在不同來源的葉片比較中，室內(nèi)培養(yǎng)的葉片的污染率比室外的還高，這可能是由培養(yǎng)環(huán)境造成的，水培枝條所用的光照培養(yǎng)箱箱內(nèi)溫濕度都比較適合雜菌的生長(zhǎng)，加之光照培養(yǎng)箱環(huán)境較封閉，使其里面滋生了較多的雜菌。組培苗由于一直生長(zhǎng)于瓶?jī)?nèi)，其葉片比較幼嫩，于超凈工作臺(tái)上處理時(shí)極易失水，導(dǎo)致其成活率并不高。大田里采回來的葉片，由于剛萌發(fā)出來，雜菌污染比較少，加之其生長(zhǎng)于母株上，營(yíng)養(yǎng)比較豐富，所以即使消毒處理后也表現(xiàn)的比較健壯。另外，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沒有充分展開的小葉，培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中，葉片只會(huì)變大，葉脈變粗，不能誘導(dǎo)出愈傷組織，用于誘導(dǎo)愈傷的葉片必需達(dá)到一定的生理狀態(tài)才會(huì)有再生的能力。這一點(diǎn)與其他樹種類似，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2基本培養(yǎng)基和葉片放置方式及暗培養(yǎng)的篩選

培養(yǎng)基是誘導(dǎo)葉片出愈及不定芽再生的一個(gè)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，具有了最佳營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，其葉片才能有良好的生長(zhǎng)與發(fā)育條件，從而得到最佳的植株再生率。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示不同的基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷率差異并不是特別大，誘導(dǎo)率最低的也達(dá)到了較高的95.1％，但在誘導(dǎo)天數(shù)方面，改良ms培養(yǎng)基最短，僅需要7.3天，綜合考慮本試驗(yàn)選用改良ms培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。推測(cè)培養(yǎng)基中低no^3-可能會(huì)有利于榛子的再生，故把ms培養(yǎng)基中的nh4no3和kno3都減少到原來的1/4量。

榛子葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，與其擺放于培養(yǎng)基中的方式有較大的影響，葉片反面朝上，愈傷組織的誘導(dǎo)率要顯著高于葉片背面朝上時(shí)愈傷的誘導(dǎo)率。這可能是由于榛子葉片靠近上表皮的柵欄組織結(jié)構(gòu)太緊密且氣孔少，不易與氧氣接觸，而靠近榛子葉片下表皮的海綿組織松散、氣孔多，易與氧氣接觸，從而有利于誘導(dǎo)愈傷形成。對(duì)榛子葉片愈傷組織誘導(dǎo)的黑暗處理研究尚未見報(bào)道。本發(fā)明試驗(yàn)黑暗處理有利于愈傷組織的形成，處理14d時(shí)，誘導(dǎo)率能達(dá)到100％，并且愈傷組織較緊密，呈黃綠色。生命力強(qiáng)。

3.3誘導(dǎo)愈傷組織的激素組合篩選

自從1957年skoog和miller提出“激素平衡”假說以來，研究者進(jìn)行了大量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)與形態(tài)發(fā)生關(guān)系的研究，并取得了一定的進(jìn)展。研究顯示，細(xì)胞在脫分化形成愈傷組織的過程中，需要較高水平的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的激發(fā)和誘導(dǎo)。外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的施用可以影響內(nèi)源激素的水平，進(jìn)而影響有關(guān)基因的活化與抑制，導(dǎo)致組織的脫分化與再分化。tdz是一種雜環(huán)芳香脲，20世紀(jì)80年代初期研究者發(fā)現(xiàn)其具有較高的細(xì)胞分裂素活性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中。它能夠促使組織培養(yǎng)困難的植物，特別是木本植物的組織培養(yǎng)獲得成功。植株再生的研究顯示愈傷組織可以分為非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織，非胚性愈傷組織可以通過器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株，胚性愈傷組織通過胚狀體途徑再生植株。本發(fā)明試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，榛子可以形成以上兩種類型的愈傷組織，雖然編號(hào)為1、2、4、5、12、18、20的激素組合愈傷的誘導(dǎo)率都達(dá)到100％，但不同激素組合的處理，形成的愈傷質(zhì)地及形態(tài)是不同的?？傮w上看tdz和iba激素組合形成的是非胚性愈傷組織，愈傷增殖較快，后期會(huì)出現(xiàn)饅頭狀的鮮綠色愈傷。當(dāng)相同濃度的tdz時(shí)，iba濃度要普遍比naa濃度高，才能使誘導(dǎo)率差距不大，說明與tdz配合使用時(shí)，iba的活力要高于naa，另外，在naa濃度相同時(shí)，即使高出2.5倍的6-ba誘導(dǎo)效果也比tdz差，說明tdz的分裂活性遠(yuǎn)高于6-ba。2-4d與iaa組合產(chǎn)生的愈傷組織米黃色部分還帶紫紅色顆粒，是細(xì)胞迅速分裂的體現(xiàn)。各中激素組合誘導(dǎo)出愈傷組織各有其特點(diǎn)，都有產(chǎn)生再生植株的潛力。本發(fā)明試驗(yàn)后期采用了所有誘導(dǎo)率達(dá)到100％的組合。

3.4誘導(dǎo)不定芽的篩選

組織培養(yǎng)中植株的分化含有植株水平、器官水平、組織水平和細(xì)胞水平。本試驗(yàn)已經(jīng)成功對(duì)平歐雜交榛葉片進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)了。大部分愈傷組織已進(jìn)入到分化期，少量進(jìn)入到了再分化階段。目前國(guó)內(nèi)外還沒有對(duì)平歐雜交榛愈傷誘導(dǎo)再生植株的成功報(bào)道，本試驗(yàn)中不定芽的成功誘導(dǎo)證明了平歐雜交榛的愈傷組織具有再分化的能力。6-ba0.6mg/l+iaa0.8mg/l和6-ba2mg/l+naa1.4mg/l的激素組合可以誘導(dǎo)出不定芽，但是誘導(dǎo)率比較低，可能是由于激素的類型和濃度組合不是最佳組合造成的。另外，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，部分激素組合的培養(yǎng)基會(huì)誘導(dǎo)出根的分化，部分愈傷組織團(tuán)塊上會(huì)出現(xiàn)黃綠色類似芽頭的分化。這些情況都有待進(jìn)一步的研究探索。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。