本申請(qǐng)涉及培養(yǎng)基，尤其涉及一種楸樹(shù)的優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)基，以及該培養(yǎng)基的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

楸樹(shù)(catalpabungeic.a.meyer)為紫葳科梓樹(shù)屬高大落葉喬木，原產(chǎn)我國(guó)，是我國(guó)古老的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹(shù)種，既是名貴的園林觀賞樹(shù)種，也是優(yōu)良的用材樹(shù)種，被譽(yù)為“木王”，專(zhuān)門(mén)用來(lái)加工高檔商品和特種產(chǎn)品，如槍托、模型、船舶、樂(lè)器等。且楸樹(shù)葉片大，葉被絨毛，能吸收二氧化硫、氯氣等有害氣體，是優(yōu)良的抗霧霾樹(shù)種。

隨著對(duì)楸樹(shù)采伐利用增多，常規(guī)的繁殖不能滿(mǎn)足生產(chǎn)對(duì)良種苗木的需要，致使出現(xiàn)成材比例嚴(yán)重失調(diào)和楸木供不應(yīng)求的局面，與當(dāng)前快速發(fā)展林業(yè)的形勢(shì)不相適應(yīng)。探索快繁繁殖楸樹(shù)的方法來(lái)促進(jìn)和改善楸樹(shù)繁育和苗木培育狀況成為亟待解決的問(wèn)題。

植物組織培養(yǎng)是迅速繁殖林木的方法之一，朱鹿鳴等(朱鹿鳴,金韻琴,欒永華.楸樹(shù)組織培養(yǎng)初報(bào)[j].江蘇林業(yè)科技,1980(3))進(jìn)行了楸樹(shù)組織培養(yǎng)的研究，其增殖培養(yǎng)及生根培養(yǎng)均需轉(zhuǎn)培2次，從工廠化角度考慮成本較高。

培養(yǎng)基提供了植物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，培養(yǎng)基選取的適宜與否，是決定增殖培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。于永明等(于永明，王軍輝，馬建偉，張宋智，李平英，韓云花，魏秀琴.楸樹(shù)無(wú)性系離體培養(yǎng)特性差異研究.西北植物學(xué)報(bào)，2012，32(1)：0199-0204.)利用dkw+1.0mg/l6-ba+0.2mg/liba+25g/l蔗糖+4.5g/l瓊脂(ph5.8)的培養(yǎng)基獲得繼代培養(yǎng)中楸樹(shù)增殖系數(shù)為4.0-10.7。費(fèi)鵬飛等(傅玉蘭,費(fèi)鵬飛,劉小云.楸樹(shù)試管叢生芽繼代增殖影響因素的研究[j].林業(yè)科技開(kāi)發(fā),2009,23(1):95-98.)研究表明楸樹(shù)增殖培養(yǎng)的適宜配方為ms+ba4.0mg/l+iba0.5mg/l+pvpp100mg/l+食糖30g/l+瓊脂0g/l，其最高增殖系數(shù)為4.8。cn104054580公開(kāi)了一種楸樹(shù)增殖最優(yōu)培養(yǎng)基配方為ms+ba1.5mg/l+zt0.1mg/l+iaa0.2mg/l，在該培養(yǎng)基上增殖20d后，增殖系數(shù)最高為4.3。

綜上所述，現(xiàn)有楸樹(shù)增殖培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基多為ms、dkw等常用培養(yǎng)基，進(jìn)一步的，現(xiàn)有培養(yǎng)基增殖系數(shù)和增殖的穩(wěn)定性都有待進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述缺點(diǎn)，發(fā)明人完成了本申請(qǐng)。

本申請(qǐng)一方面涉及一種楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)基，包括改良dkw培養(yǎng)基，所述改良dkw培養(yǎng)基是指采用硫酸銨和硝酸鉀代替?zhèn)鹘y(tǒng)dkw培養(yǎng)基中的硝酸銨和硫酸鉀，并且對(duì)磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂的含量進(jìn)行調(diào)整；所述改良dkw培養(yǎng)基中包括所述硫酸銨1051～1284mg/l、所述硝酸鉀1630～1998mg/l、所述磷酸二氫鉀244～286mg/l、所述七水硫酸鎂681～799mg/l；其余成分與傳統(tǒng)的dkw相同。

所述改良dkw培養(yǎng)基具體包括如下組分：硫酸銨1051～1284mg/l；硝酸鉀1630～1998mg/l；磷酸二氫鉀244～286mg/l；七水硫酸鎂681～799mg/l；硼酸4.8mg/l；無(wú)水氯化鈣112.5mg/l；硝酸鈣1367.0mg/l；五水硫酸銅0.25mg/l；na2-edta45.4mg/l；七水硫酸鐵33.8mg/l；一水硫酸錳33.5mg/l；鉬酸鈉0.39mg/l；六水硫酸鎳0.005mg/l；六水硝酸鋅17.0mg/l；鹽酸硫胺素5.22mg/l。

所述硫酸銨的含量可以是所述1051～1284mg/l范圍中任意值或所述范圍內(nèi)任意值組合形成的范圍，例如1100mg/l、1150mg/l、1200mg/l、1250mg/l、1280mg/l等等。

所述硝酸鉀的含量可以是所述1630～1998mg/l范圍中任意值或所述范圍內(nèi)任意值組合形成的范圍，例如1650mg/l、1700mg/l、1750mg/l、1800mg/l、1850mg/l、1900mg/l、1950mg/l、1990mg/l等等。

所述磷酸二氫鉀的含量可以是所述244～286mg/l范圍中任意值或所述范圍內(nèi)任意值組合形成的范圍，例如250mg/l、260mg/l、270mg/l、280mg/l等等。

所述七水硫酸鎂的含量可以是所述681～799mg/l范圍中任意值或所述范圍內(nèi)任意值組合形成的范圍，例如690mg/l、710mg/l、730mg/l、750mg/l、770mg/l、790mg/l等等。

申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，不同種類(lèi)的細(xì)胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、2-異戊烯腺嘌呤(2-ip)、苯基噻二唑基脲(tdz)、激動(dòng)素(kt)在上述改良dkw培養(yǎng)基中，對(duì)增殖培養(yǎng)的植株有不同的影響，僅6-ba對(duì)植株的增殖培養(yǎng)有進(jìn)一步的優(yōu)化促進(jìn)作用，而2-ip、tdz、kt等則對(duì)植株有不同程度的不利影響。

因此，優(yōu)選的，所述楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)基還包括6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)。

在改良dkw基本培養(yǎng)基中添加0.1～1.0mg/l的6-ba，植株分化正常。隨著6-ba濃度的降低植株萌芽越晚，不定芽萌發(fā)率越低，增殖系數(shù)越低。當(dāng)6-ba濃度大于1.0mg/l時(shí)，植株畸形，玻璃化嚴(yán)重。由此，進(jìn)一步優(yōu)選，所述6-芐氨基腺嘌呤含量為0.1～1mg/l。

申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在改良dkw+0.1～1mg/l6-ba培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加吲哚丁酸(iba)能進(jìn)一步促進(jìn)植株的增殖，所述吲哚丁酸的含量為0.01～0.1mg/l。當(dāng)添加iba濃度低于0.01mg/l時(shí)，增殖系數(shù)低于3；當(dāng)添加iba濃度高于0.1mg/l時(shí)，植株玻璃化，增殖系數(shù)低。

而在改良dkw+0.1～1mg/l6-ba培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加其他生長(zhǎng)素，例如0.05～0.5mg/l的kt，平均增殖系數(shù)雖然達(dá)到5.5，但是植株生長(zhǎng)不均勻，高矮不一致，不利于后期的生根培養(yǎng)。

申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在改良dkw+0.1～1mg/l6-ba+0.01～0.1mg/liba培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加卡拉膠，有利于植株的增殖，表現(xiàn)為：愈傷組織為健康的綠色，植株健壯，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，增殖系數(shù)最高為6.5。因此，進(jìn)一步優(yōu)選，所述楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)基進(jìn)一步包括卡拉膠，所述卡拉膠含量為5～7g/l；

而在改良dkw+0.1～1mg/l6-ba+0.01～0.1mg/liba培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加其他植物凝固劑，例如瓊脂，則對(duì)植株產(chǎn)生不利影響，表現(xiàn)為：培養(yǎng)3周左右，愈傷組織呈褐色，生長(zhǎng)勢(shì)下降，增殖系數(shù)最高為5.8。

優(yōu)選的，所述楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)基，進(jìn)一步包括蔗糖，所述蔗糖含量為30g/l。

本申請(qǐng)另一方面涉及所述培養(yǎng)基在增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用，特別是在楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用。

所述培養(yǎng)基在楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用，包括：將植株接種至配制好的滅菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26±2℃，光長(zhǎng)強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時(shí)間為12～14h/天。

所述培養(yǎng)基在楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)中的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

1)選取植株高度為3cm以上，培養(yǎng)周期為21天，生長(zhǎng)健壯、葉色為綠色的楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系無(wú)菌苗，作為增殖的材料；

2)將所選取的植株切除多余葉片及葉柄，保留所有頂芽、莖段及芽團(tuán)，接種至已滅菌的培養(yǎng)基上；

3)將已接種至培養(yǎng)基的植株在溫度為26±2℃，光長(zhǎng)強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時(shí)間為12～14h/天的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明有益效果：

(1)對(duì)傳統(tǒng)dkw進(jìn)行改良后的培養(yǎng)基，使楸樹(shù)植株生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠，增殖系數(shù)高，生長(zhǎng)速度快，三周左右可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

(2)在改良dkw培養(yǎng)基中，進(jìn)一步加入6-芐氨基腺嘌呤、吲哚丁酸、瓊脂以及蔗糖等輔助劑后，特別是在培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)元素的共同協(xié)調(diào)作用下，增殖系數(shù)達(dá)到6.5，且同批次培養(yǎng)的植株增殖系數(shù)穩(wěn)定，植株高度較高且其高度均勻一致，能全部用作生根培養(yǎng)的母本苗，極大地降低楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系工廠化生產(chǎn)的成本，有利于楸樹(shù)品種的推廣和種植，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例6楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系擴(kuò)繁苗。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式：

實(shí)施例中增殖系數(shù)＝每個(gè)處理繼代接種后返回的瓶苗數(shù)/每個(gè)處理樣本數(shù)(即20瓶)*100％。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系增殖培養(yǎng)基組分為：硫酸銨1051～1284mg/l；硝酸鉀1630～1998mg/l；磷酸二氫鉀244～286mg/l；七水硫酸鎂681～799mg/l；硼酸4.8mg/l；無(wú)水氯化鈣112.5mg/l；硝酸鈣1367.0mg/l；五水硫酸銅0.25mg/l；na2-edta45.4mg/l；七水硫酸鐵33.8mg/l；一水硫酸錳33.5mg/l；鉬酸鈉0.39mg/l；六水硫酸鎳0.005mg/l；六水硝酸鋅17.0mg/l；鹽酸硫胺素5.22mg/l。

培養(yǎng)過(guò)程如下：

(1)選取植株高度為3cm以上，培養(yǎng)周期為21天，生長(zhǎng)健壯、葉色為綠色的楸樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系無(wú)菌苗，作為增殖的材料；

(2)將上述實(shí)驗(yàn)材料切除多余葉片及葉柄，保留所有頂芽、莖段及芽團(tuán)。頂芽高1cm左右、莖段高0.5～1.5cm含至少一個(gè)腋芽，芽團(tuán)含2～4個(gè)小芽接種至已在121℃下滅菌15min的培養(yǎng)基上，ph為5.8～6.0，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種5株；

3)將已接種至培養(yǎng)基的植株在溫度為26±2℃，光長(zhǎng)強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時(shí)間為12～14h/天的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)25天統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)及生長(zhǎng)情況，結(jié)果如下：

植株生長(zhǎng)表現(xiàn)為：生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠，生長(zhǎng)速度快，三周左右可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

對(duì)比實(shí)施例1

本對(duì)比實(shí)施例采用不同的培養(yǎng)基，分別為ms、n6、wpm、dkw。

試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1，結(jié)果如下表1所示：

表1

實(shí)施例2

本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基組分為：改良dkw培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加細(xì)胞分裂素6-ba。

試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1，結(jié)果如下表2所示：

表2

對(duì)比實(shí)施例2

本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基組分為：改良dkw培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加不同種類(lèi)的細(xì)胞分裂素2-ip(2—異戊烯腺嘌呤)、tdz(苯基噻二唑基脲)、kt(激動(dòng)素)中的一種，添加量均為0.01-1.5mg/l。

試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1，結(jié)果如下表3所示：

表3

實(shí)施例3

本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基組分為：改良dkw+0.1～1mg/l6-ba的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加kt和iba中的一種，試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1，結(jié)果如下表4所示：

表4

實(shí)施例4

本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基組分為：改良dkw+0.1～1mg/l6-ba+0.01～0.1mg/liba的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加植物凝固劑瓊脂和卡拉膠中的一種，試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1，結(jié)果如下表5所示：

表5

實(shí)施例5

本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基組分為：改良dkw+0.1～1mg/l6-ba+0.01～0.1mg/liba+5～7g/l卡拉膠的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加蔗糖30g/l，試驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1，植株平均增殖系數(shù)為6.5，且植株高度均勻一致，高度較高，能全部用作生根培養(yǎng)的母本苗。