本發(fā)明屬于單倍體培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及一種韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

韭菜(alliumtuberosumrottl.exspr.)原產(chǎn)于中國(guó)，屬于百合科蔥屬多年生宿根植物。我國(guó)是韭菜的生產(chǎn)大國(guó)，對(duì)韭菜的需求量大，因此，需要不斷培育新品種以達(dá)到市場(chǎng)的需求。目前，韭菜新品種培育多采用有性雜交結(jié)合系統(tǒng)選育的方法進(jìn)行，雜交分離后代自交純合速度慢，每年只能繁殖一個(gè)世代，新品種培育速度緩慢，育成一個(gè)品種往往需要7—8年時(shí)間，限制了韭菜品種更新?lián)Q代的速度。

近年來，隨著單倍體育種技術(shù)的發(fā)展，為韭菜快速育種提供了一種新方法。單倍體育種，在較短時(shí)間內(nèi)能選育出整齊一致的純系，大大縮短育種年限，還能豐富種質(zhì)資源，對(duì)于選育出親本自交系、加快育種進(jìn)程、培育優(yōu)勢(shì)雜交組合具有重要的意義。但是，由于韭菜常常雄性不育，花藥(小孢子)單倍體培養(yǎng)目前還沒有獲得的成功的例子。自1976年sanneoum首先按從未受精子房或胚珠得來的單倍體植株的離體誘導(dǎo)在大麥中獲得成功以來，這種方法已應(yīng)用于多種作物，并認(rèn)為在花藥培養(yǎng)尚未成功的情況下對(duì)花藥培養(yǎng)是一種選擇。傳統(tǒng)韭菜一般為同源四倍體(2n＝4x＝36)，未受精子房中卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反足細(xì)胞和珠被細(xì)胞均具有胚胎發(fā)生功能。田惠橋和楊弘(1989)以加入0.5ppmzt和0.1ppmmcpa的ms培養(yǎng)基誘導(dǎo)韭菜子房胚狀體分化，分化率最高為48.7％，從培養(yǎng)到獲得再生植株共經(jīng)歷65天，分化率較低，歷時(shí)較長(zhǎng)。因此迫切需要研究一種快速、高效獲得韭菜單倍體育種技術(shù)，使韭菜雜交分離后代快速純合，育成新的韭菜品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種快速、高效通過未受精子房獲得韭菜單倍體和純合體的方法，為韭菜育種提供新的方法。

本發(fā)明目的通過以下方案實(shí)現(xiàn)

本發(fā)明提供一種韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，該方法以韭菜未受精子房作為對(duì)象，經(jīng)過子房預(yù)處理、接種、轉(zhuǎn)接、生根步驟，最終獲得韭菜單倍植株，具體步驟如下：

(1)子房預(yù)處理：選擇韭菜花蕾，進(jìn)行消毒處理，剝?nèi)セㄝ?、花瓣，取出子房?/p>

(2)接種：將子房切片，以切口接觸愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行接種，誘導(dǎo)子房形成愈傷組織；其中，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良bds培養(yǎng)基：bds+2,4-d1.5mg/l+kt1.5mg/l，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

(3)轉(zhuǎn)接：將誘導(dǎo)獲得愈傷組織的子房轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基中，使愈傷組織分化出芽；其中，分化培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基1：ms+5％鮮椰汁+6-ba2mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0；

(4)生根：將分化出芽的植株轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，獲得韭菜單倍體植株。其中，生根培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基5：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8。

子房切片厚度一般為1-2mm。在轉(zhuǎn)接分化培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)盡可能輕柔而迅速，保證子房受到最小損傷，這對(duì)后面的分化效率是很重要的。鮮椰汁為市售任一品種椰子汁，以去離子無菌水進(jìn)行稀釋調(diào)配。

2.上述1提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，步驟(2)進(jìn)行接種后，進(jìn)行溫度光照誘導(dǎo)處理：4℃預(yù)處理24h-48h，然后33℃熱激24h，進(jìn)入25℃暗培養(yǎng)。

3.上述1提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，步驟(3)轉(zhuǎn)接需要在3-5天內(nèi)完成；轉(zhuǎn)接后，培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照2500lux，7h白天/5h黑夜。

4.上述1提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，步驟(4)進(jìn)行生根培養(yǎng)前，直接將分化出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，其中，擴(kuò)增培養(yǎng)基為改良ms培養(yǎng)基2：ms+5％鮮椰汁+6-ba2.5mg/l+naa0.3mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0。

5.上述1提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，步驟(1)中選擇的花蕾為花苞張開前2天的花蕾，對(duì)應(yīng)的是小孢子發(fā)育為單核中期。

花苞開前2天的花蕾，表現(xiàn)為花蕾飽滿，花苞苞膜完好。

6.上述1提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，步驟(1)中對(duì)子房進(jìn)行預(yù)處理，其方式為：流水沖洗5次以上，然后75％酒精浸泡25s，然后0.2％升汞浸泡8min，最后無菌水沖洗5次以上。

7.上述1提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，步驟(4)進(jìn)行生根后，將苗子接種在0.01％秋水仙素的ms培養(yǎng)基上，蔗糖含量3％，ph5.8，處理3天，然后轉(zhuǎn)接在不含秋水仙素的ms培養(yǎng)基上，獲得染色體加倍的韭菜，即2n＝32。

8.上述7提供的韭菜未受精子房離體培養(yǎng)方法，其中，加倍后的韭菜幼苗擴(kuò)大生產(chǎn)進(jìn)行煉苗，選擇幼苗特征為長(zhǎng)4—5條根，根長(zhǎng)4cm以上；進(jìn)行煉苗時(shí)，設(shè)置溫室溫度24-28℃，濕度75％，光照第1周5000-10000lux，第二周1.5萬—2萬lux。

有益效果：

1.本發(fā)明通過優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)處理方式，大大提高了成胚數(shù)和成胚率，經(jīng)過對(duì)比試驗(yàn)，無論是何種品種，成胚數(shù)最少為78個(gè)·蕾^-1，成胚率至少為83.8％，相對(duì)于傳統(tǒng)地的方法，均有明顯提高。

2.從子房培養(yǎng)到單倍體植株整個(gè)獲得時(shí)間為55-60天左右，相對(duì)于傳統(tǒng)地65-100天的時(shí)間，時(shí)間有所縮短，提高了生產(chǎn)效率。

本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化方法，填補(bǔ)了目前韭菜單倍體植株培養(yǎng)的空白和局限，為更大規(guī)模和深入地進(jìn)行韭菜育種改造提供基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后分化出芽的愈傷組織

圖2愈傷組織轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根

圖3染色體未加倍處理時(shí)韭菜單倍體染色體(2n＝16)

圖4經(jīng)過秋水仙素處理后韭菜染色體(2n＝4x＝32)

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段，或按照制造廠商的建議條件。

實(shí)施例1

1、培養(yǎng)基配制

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良bds培養(yǎng)基)：bds+2,4-d1.5mg/l+kt1mg/l，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

分化培養(yǎng)基(改良ms培養(yǎng)基1)：ms+5％鮮椰汁+6-ba2mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0；

擴(kuò)大培養(yǎng)基(改良ms培養(yǎng)基2)：ms+5％鮮椰汁+6-ba2.5mg/l+naa0.3mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8-6.0；

改良ms培養(yǎng)基3：ms+0.5ppmzt+0.1ppmmcpa，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

改良ms培養(yǎng)基4：ms+2,4-d1.5mg/l+kt1mg/l，蔗糖含量10％，ph5.8-6.0；

生根培養(yǎng)基(改良ms培養(yǎng)基5)：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l，蔗糖含量3％，ph5.8。

鮮椰汁過除菌過濾器。培養(yǎng)基裝在三角瓶?jī)?nèi)滅菌，滅菌(121℃,20min)后倒入預(yù)先滅菌(121℃,20min)的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷涼，備用。

2、材料選擇

2.1品種選擇：市售品種，791寬葉雪韭、紫根韭菜、多抗富韭6號(hào)。

2.2材料獲得：花苞開花前2天，花蕾表現(xiàn)為飽滿、圓潤(rùn)，花苞苞膜完好，花蕾長(zhǎng)度1-2cm。

2.3材料處理：1)花蕾取下，進(jìn)行消毒，流水沖洗5次以上，然后75％酒精浸泡25s，然后0.2％升汞浸泡8min，最后無菌水沖洗5次以上；2)在無菌操作臺(tái)中，剝?nèi)セㄝ唷⒒ò?，取出子房?/p>

3.接種

在無菌操作臺(tái)中，將取出的子房立即進(jìn)行切片，切片厚度1-2mm。將切口接觸改良bds培養(yǎng)基，接入三角瓶中，每瓶接種9-10個(gè)子房，共60個(gè)。同時(shí)，以改良ms培養(yǎng)基3、4作為對(duì)照組，每組30個(gè)，處理方式為溫度光照誘導(dǎo)處理。

同時(shí)，在以改良bds培養(yǎng)基作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，分2組，每組30個(gè)，一組進(jìn)行溫度光照誘導(dǎo)處理：4℃預(yù)處理24h-48h，然后33℃熱激24h，進(jìn)入25℃暗培養(yǎng)，36-60h。一組不做處理。培養(yǎng)35天后，觀察胚胎膨大數(shù)、胚胎誘導(dǎo)率、出芽率。不同培養(yǎng)基條件對(duì)胚胎發(fā)生影響如表1所示，從圖中看出，ms培養(yǎng)機(jī)組，子房幾乎全部褐化死亡，說明激素在愈傷組織形成過程中是重要的；不同品種成胚率不完全相同，均表現(xiàn)出改良ms培養(yǎng)基3、4組比改良bds培養(yǎng)基組數(shù)量少，說明改良bds培養(yǎng)基對(duì)子房的誘導(dǎo)效果明顯高于改良ms培養(yǎng)基3、4。同時(shí)，經(jīng)過溫度光照誘導(dǎo)處理和未經(jīng)溫度光照誘導(dǎo)處理的結(jié)果，從表中可以看出，經(jīng)過誘導(dǎo)處理后，膨大胚珠數(shù)和成胚數(shù)均有明顯增加，說明溫度光照誘導(dǎo)處理是有益成胚的。

表1不同培養(yǎng)基對(duì)成胚的影響

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平(p<0.05),a:溫度光照誘導(dǎo)處理，b：未進(jìn)行溫度光照誘導(dǎo)處理

4.轉(zhuǎn)接

待獲得愈傷組織產(chǎn)生后，取出，切除已經(jīng)褐化或壞死的組織，小心地轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基中，要求在3-5天內(nèi)完成，盡量減少對(duì)組織的損傷；轉(zhuǎn)接后，培養(yǎng)溫度為培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照2500lux，7h白天/5h黑夜，經(jīng)過10天左右，愈傷組織分化出芽，如圖1所示。

5.生根

將分化出芽的植株轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，10天左右，根迅速生長(zhǎng)，獲得韭菜單倍體植株，如圖2所示。取再生植株幼嫩葉片為檢測(cè)對(duì)象，將0.2g待檢測(cè)葉片置于培養(yǎng)皿中，加入2ml細(xì)胞裂解液，用單片迅速將其切片，400目尼龍網(wǎng)過濾，2000r/m離心3min。采用nikon55i1000倍觀測(cè)，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以清楚得看到單倍體植株染色體倍數(shù)，2n＝16。

實(shí)施例2

生根之前步驟如實(shí)施例1所示。

在愈傷組織分化出芽后，將獲得芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，擴(kuò)增培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照2500lux，7h白天/5h黑夜，擴(kuò)增培養(yǎng)10天左右。

將擴(kuò)增培養(yǎng)的植株轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件如實(shí)施例1。

實(shí)施例3

單倍體植株獲得步驟如實(shí)施例2所示。

將單倍體植株接種在0.01％秋水仙素的ms培養(yǎng)基上，蔗糖含量3％，ph5.8，處理3天，然后轉(zhuǎn)接在不含秋水仙素的ms培養(yǎng)基上，獲得染色體加倍的韭菜，即2n＝4x＝32。以實(shí)施例1中所示觀測(cè)方法，觀察植株的染色體，如圖4所示。

加倍后的韭菜幼苗擴(kuò)大生產(chǎn)進(jìn)行煉苗，選擇幼苗特征為長(zhǎng)4—5條根，根長(zhǎng)4cm以上；進(jìn)行煉苗時(shí)，設(shè)置溫室溫度24-28℃，濕度75％，光照第1周5000-10000lux，第二周1.5萬—2萬lux。獲得可以直接栽種于大棚中的幼苗。

可以知道，上述實(shí)施例僅為了說明發(fā)明原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā)明不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)情況下，可以做出各種改進(jìn)和變更，這些改進(jìn)和變更也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。