本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種寬葉獨行菜的體外快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

寬葉獨行菜為多年生草本植物，分布于海拔1800～4250米的歐洲南部、非洲北部、亞洲西部及中部，具有耐鹽堿、抗旱耐澇等多種抗逆性狀。寬葉獨行菜全草入藥，中醫(yī)認為可治菌痢、腸炎；其種子含有谷甾醇及強心甙成分，可以使心臟收縮加強，心率減慢，對衰竭的心臟可以增加血液的輸出量，降低靜脈壓。

根據(jù)中國植物志的記載，寬葉獨行菜分為原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜(原變種)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)和原產(chǎn)于華北的光果寬葉獨行菜(變種)北獨行菜(lepidiumlatifoliuml.var.affine)。隨著對寬葉獨行菜食用價值的不斷開發(fā)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜(原變種)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)富含維生素a、c，以及銅、鈣、鉀等多種微量元素，是一種營養(yǎng)價值極高的新型保健蔬菜。其作為飼料可飼喂豬、羊，是我國西北鹽堿地較普遍的飼用植物。此外，獨行菜種子富含豐富脂肪酸，產(chǎn)量比冬油菜平均水平高出30％左右，是一種新型油料作物。

鑒于寬葉獨行菜抗逆性強，且在食用、藥用、飼用等方面有較高的應(yīng)用價值，因此具有很好的推廣開發(fā)前景。然而原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜(原變種)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)在國內(nèi)分布于西北地區(qū)，在東部地區(qū)雖然能夠正常生長結(jié)實，但其所結(jié)種子多數(shù)胚胎發(fā)育不良難以獲得正常的幼苗，使得寬葉獨行菜的栽培推廣受到極大限制。

因此，開發(fā)一種針對于原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜(原變種)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)的體外快繁技術(shù)，對于寬葉獨行菜的栽培推廣具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種寬葉獨行菜的體外快速繁殖方法。本發(fā)明克服了寬葉獨行菜在我國東部地區(qū)繁殖效率低的問題，極大的促進了寬葉獨行菜的栽培推廣。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種寬葉獨行菜的體外快速繁殖方法，步驟如下：

(1)制備寬葉獨行菜的無菌外植體；

(2)將無菌外植體接種到快繁培養(yǎng)基上，進行再生苗的誘導(dǎo)以及快速擴增繁殖；

(3)將誘導(dǎo)生成的再生苗轉(zhuǎn)入ms基本培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)；

(4)將生根后的寬葉獨行菜完整再生植株移栽入栽培基質(zhì)中正常生長。

所述寬葉獨行菜為原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜(原變種)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)。

步驟(1)中，無菌外植體的制備方法為：挑選成熟飽滿的獨行菜種子，滅菌，然后播種于ms基本培養(yǎng)基上，將萌發(fā)后10～14天苗齡獨行菜幼苗整株切碎作為體外快速繁殖的無菌外植體。

優(yōu)選的，滅菌的方法為：用質(zhì)量濃度為2％次氯酸鈉滅菌25min，然后用無菌水沖洗。

步驟(2)中，所述快繁培養(yǎng)基是在ms基本培養(yǎng)基中添加30g/l的蔗糖、1mg/l的6-ba、0.25mg/l的naa，6～8g/l的瓊脂，調(diào)節(jié)ph為5.8。

步驟(2)中，再生苗的誘導(dǎo)以及快速擴增繁殖采用的條件為23～25℃培養(yǎng)，每日14小時光照，10小時黑暗，14～21天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)28～42天。

步驟(3)中，生根誘導(dǎo)采用的條件為：23～25℃培養(yǎng)，每日14小時光照，10小時黑暗，共誘導(dǎo)培養(yǎng)20天。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明針對原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜(原變種)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)首次提供了一種快速繁殖的方法，為寬葉獨行菜在我國東部(特別是華北、華東地區(qū))的推廣應(yīng)用提供了技術(shù)保障。

(2)本發(fā)明的快繁技術(shù)采用的是組培條件下萌發(fā)幼苗整株切碎作為外植體，結(jié)構(gòu)不完整的幼苗也能利用，因此不受胚發(fā)育不良的影響，降低了外植體取材難度，擴大了外植體來源范圍。

(3)本發(fā)明中，擴繁系數(shù)為8.54～11.04，即每棵無菌幼苗最終形成再生植株的平均數(shù)目。上述各步驟是一個有機的整體，互為條件，有效提高了寬葉獨行菜的繁殖效率。

綜上，本發(fā)明為國內(nèi)外首個針對原產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜體外快繁技術(shù)，有效擴大了寬葉獨行菜的繁殖系數(shù)，克服了寬葉獨行菜種子繁殖的地域限制問題。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1：采自青海的寬葉獨行菜無菌播種；

圖2：再生苗的誘導(dǎo)及快速繁殖；

圖3：生根培養(yǎng)；

圖4：移栽后的植株。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，開發(fā)寬葉獨行菜的體外快繁技術(shù)對于寬葉獨行菜的栽培推廣具有十分重要的意義?；诖?，本申請?zhí)岢隽艘环N寬葉獨行菜的體外快速繁殖方法。

在本申請的一種實施方案中，提供了一種寬葉獨行菜的體外快速繁殖方法，步驟如下：

(1)無菌外植體的制備：挑選成熟飽滿的獨行菜種子，用質(zhì)量濃度為2％次氯酸鈉滅菌25min，無菌水沖洗4次后，播種于ms基本培養(yǎng)基上，將萌發(fā)后10～14天苗齡獨行菜幼苗整株切碎作為體外快速繁殖的無菌外植體。

(2)將無菌外植體接種到快繁培養(yǎng)基上，進行再生苗的誘導(dǎo)以及快速擴增繁殖；快速擴增繁殖采用的條件為23～25℃培養(yǎng)，每日14小時光照，10小時黑暗，14～21天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)28～42天。

(3)將誘導(dǎo)生成的再生苗轉(zhuǎn)入ms基本培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)；生根誘導(dǎo)采用的條件為：23～25℃培養(yǎng)，每日14小時光照，10小時黑暗，共誘導(dǎo)培養(yǎng)20天。

(4)將生根后的獨行菜完整再生植株移栽入栽培基質(zhì)中正常生長。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本申請的技術(shù)方案。

本發(fā)明實施例中所用的試驗材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

本發(fā)明實施例中所用的培養(yǎng)基，具體如下：

ms培養(yǎng)基：市售產(chǎn)品。

快繁培養(yǎng)基：在ms基本培養(yǎng)基中添加30g/l的蔗糖，1mg/l的6-ba，0.25mg/l的naa，6g/l的瓊脂，調(diào)節(jié)ph為5.8；配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

栽培基質(zhì)為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的栽培基質(zhì)。

實施例1：采收于青海的寬葉獨行菜正常幼苗快繁

具體方法如下：

(1)無菌外植體的獲得：從采收于青海地區(qū)的寬葉獨行菜種子中選取成熟飽滿者，用2％次氯酸鈉滅菌25min，無菌水沖洗4次后，播種于ms基本培養(yǎng)基上，待無菌苗萌發(fā)后10天，將整株幼苗均勻切成10塊作為體外快速繁殖的無菌外植體。

(2)將無菌外植體接種到快繁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為23～25℃培養(yǎng)，每天14小時光照，10小時黑暗，14天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)28天，獲得體外擴繁的再生寬葉獨行菜離體苗，此步驟中每塊外植體形成離體再生苗的平均數(shù)目為1.104株；

(3)將上述誘導(dǎo)生成的離體再生苗轉(zhuǎn)入ms基本培養(yǎng)基中，以步驟(2)中的條件繼續(xù)進行生根誘導(dǎo)，生根率為100％。

(4)將生根后的獨行菜完整再生植株移栽入栽培基質(zhì)中，按照常規(guī)栽培方式使其進入正常生長，此步驟移栽成活率為100％。

綜上，采收于青海的寬葉獨行菜每棵無菌幼苗最終形成再生植株的平均植株數(shù)目，即擴繁系數(shù)為11.04。

寬葉獨行菜無菌播種、再生苗的誘導(dǎo)及快速繁殖、生根培養(yǎng)以及栽培后的植株分別如圖1-4所示。

實施例2：采收于山東的寬葉獨行菜胚根缺失幼苗快繁

具體方法如下：

(1)無菌外植體的獲得：從采收于山東地區(qū)的寬葉獨行菜種子中選取成熟飽滿者，用2％次氯酸鈉滅菌25min，無菌水沖洗4次后，播種于ms基本培養(yǎng)基上，待無菌苗萌發(fā)后14天，將缺失胚根的整株幼苗均勻切成10塊作為體外快速繁殖的無菌外植體。

(2)將無菌外植體接種到快繁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為23～25℃培養(yǎng)，每天14小時光照，10小時黑暗，21天繼代一次，共誘導(dǎo)培養(yǎng)42天，獲得體外擴繁的再生寬葉獨行菜離體苗，此步驟中每塊外植體形成離體再生苗的平均數(shù)目為0.854株；

(3)將上述誘導(dǎo)生成的離體再生苗轉(zhuǎn)入ms基本培養(yǎng)基中，以步驟(2)中的條件繼續(xù)進行生根誘導(dǎo)，生根率為100％。

(4)將生根后的獨行菜完整再生植株移栽入栽培基質(zhì)中，按照常規(guī)栽培方式使其進入正常生長，此步驟移栽成活率為100％。

綜上，采收于山東的寬葉獨行菜每棵無菌幼苗最終形成再生植株的平均植株數(shù)目，即擴繁系數(shù)為8.54。

對比例1：

采集產(chǎn)于青海的寬葉獨行菜的幼葉和嫩莖，消毒處理，將消毒處理后的寬葉獨行菜幼葉切成0.5cm²大小的片段，嫩莖切成0.5-1.0cm的小段，作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體接種于盛有無菌培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)基的組成為：ms培養(yǎng)基中添加1.5mg/l2,4-d+1.0mg/liaa+0.5mg/l6-ba。

將接種有外植體的三角瓶置于25攝氏度、1800-2000lx光照強度下進行培養(yǎng)。將生根后的獨行菜完整再生植株移栽入栽培基質(zhì)中，按照常規(guī)栽培方式使其進入正常生長。

本對比例中，移栽的成活率為82％，擴繁系數(shù)為5.02。

對比例2：

將所用的材料替換為采自唐山地區(qū)的寬葉獨行菜的幼葉和嫩莖，其余處理方法同對比例1。

本對比例中，移栽的成活率為86％，擴繁系數(shù)為6.13。

由上述實施例和對比例可以看出，將具有不同遺傳背景(分別采自青海、山東和唐山的寬葉獨行菜)的材料進行組織培養(yǎng)，其所需的組培體系不同，在組培體系上沒有可比性和可參考性。另外，對于產(chǎn)自青海的寬葉獨行菜而言，其組培體系的選擇對于擴繁的效果具有十分關(guān)鍵的影響，經(jīng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的寬葉獨行菜的體外快速繁殖方法，通過再生苗的誘導(dǎo)以及快速擴增繁殖、生根誘導(dǎo)等步驟的優(yōu)選與結(jié)合，非常好的實現(xiàn)了對采集于青海的寬葉獨行菜的快速繁殖。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本申請的保護范圍之內(nèi)。