本發(fā)明屬于植物無性繁殖的方法，主要涉及木本植物的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

云南金花茶(Camellia fascicularis H.T.Chang)是山茶科(Theaceae)，山茶屬(Camellia)金花茶組的一個種，又稱簇蕊金花茶、云南顯脈金花茶，屬于云南特有極小種群植物。云南金花茶被植物分類學公認與金花茶(Camellia nitidissima)分屬于兩個種(閔天祿,張文駒.山茶屬古茶組和金花茶組的分類學問題[J].植物分類與資源學報,1993,15(1):1-15.中國科學院昆明植物研究所.云南植物志(第八卷)上冊[M].北京:科學出版社,1997:26.閔天祿.世界山茶屬的研究[M].昆明:云南科技出版社,2000:99-100.)。此外，分子分類學用ISSR或AFLP分子標記區(qū)分該兩個不同種的基因有明顯差別(唐紹清,杜林方,王燕.山茶屬金花茶組金花茶系的AFLP分析[J].植物科學學報,2004,22(1):44-48.肖政,李紀元,李志輝,等.金花茶組物種遺傳關(guān)系的ISSR分析[J].林業(yè)科學研究,2014,27(1):71-76.)。云南金花茶花朵大且金黃，蒴果呈橙黃或紫紅，觀賞價值極高；花葉中含人體所需的微量元素和營養(yǎng)成分。亟待解決的是，作為云南省珍貴樹種，本發(fā)明人實地踏查測量現(xiàn)存數(shù)量不到700株，分布僅限于河口、個舊、馬關(guān)的三縣市，按IUCN標準屬極危等級(CR)，該種結(jié)實量較少，且種子易裂開，不易保存。由于人為嚴重破壞，長勢贏弱，無法結(jié)實，影響了林下更新。在種質(zhì)創(chuàng)新方面，云南金花茶是亟待保護的金花茶組內(nèi)重要種質(zhì)資源。金花茶組內(nèi)其他種的繁育研究目前已有報道。如CN104488712A“一種嫩芽金花茶的組培快繁方法”和CN104285813A“一種金花茶組培繁殖方法”，前者包括愈傷組織分化芽和生根培養(yǎng)等步驟；后者用種子培育的無菌苗頂芽增殖培養(yǎng)獲得叢生芽等。這些方法均使用離體組織或器官——葉片或種子通過細胞增殖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所獲得的種苗與母株之間會存在變異，增殖倍數(shù)及生根率較低。除外，云南金花茶的組織培養(yǎng)未見相關(guān)研究報道。問題是，目前組培實驗步驟停留于經(jīng)驗和直觀性，重復(fù)和冗繁降低了實驗效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于以性狀優(yōu)良的云南金花茶的嫩莖或頂芽為啟動材料，通過以芽繁芽的方式，進行種苗快速擴繁，從而提供一種遺傳性狀穩(wěn)定，繁殖系數(shù)高，可全年生產(chǎn)的云南金花茶種苗組培快繁方法。

上述目的按以下方法實現(xiàn)，該方法包括：

對于兩種削弱了頂端優(yōu)勢的不同種的金花茶，設(shè)這兩種金花茶組培培養(yǎng)基的集合G和H中的第n個組培培養(yǎng)基分別是<g_n，α_n>和<h_n，β_n>，α_n和β_n為g_n和h_n的多元運算，那么，設(shè)f是G→H的映射，使任意的植物激素a₁⁽ⁿ⁾，a₂⁽ⁿ⁾…∈g_n，有f(a₁)＝b₁⁽ⁿ⁾，f(a₂)＝b₂⁽ⁿ⁾，…，且b₁⁽ⁿ⁾、b₂⁽ⁿ⁾，…∈h_n，b₂⁽ⁿ⁾…是a₁⁽ⁿ⁾、a₂⁽ⁿ⁾，…激素的同態(tài)像。

進一步，所述方法是：

設(shè)云南金花茶為組培培養(yǎng)基的集合G，G＝{<g₁，α₁>，<g₂，α₂>，…<g_n，α_n>}，g₁、g₂、…g_n為云南金花茶組織培養(yǎng)不同生長發(fā)育期的培養(yǎng)基，α₁，α₂，…α_n分別是g₁、g₂、…g_n的組合方式；

另一種的金花茶組培培養(yǎng)基的集合H，H＝{<h₁，β₁>，<h₂，β₂>，…<h_n，β_n>}，h₁、h₂、…h(huán)_n為金花茶組織培養(yǎng)不同生長發(fā)育期的培養(yǎng)基，β₁、β₂、…β_n分別是h₁、h₂、…h(huán)_n的組合方式；

設(shè)f是G→H的映射，使集合G中第n個組培方法的植物激素a₁⁽ⁿ⁾，a₂⁽ⁿ⁾，…∈A_n，有f(a₁⁽ⁿ⁾)＝b₁⁽ⁿ⁾，f(a₂⁽ⁿ⁾)＝b₂⁽ⁿ⁾，…，且b₁⁽ⁿ⁾，b₂⁽ⁿ⁾，…∈h_n，h_n為集合H中的組培方法，那么，b₁⁽ⁿ⁾、b₂⁽ⁿ⁾，…是a₁⁽ⁿ⁾、a₂⁽ⁿ⁾，…激素的同構(gòu)像，這兩個集合是同構(gòu)的。

進一步，所述的方法包括如下步驟：

(1)選取性狀優(yōu)良的云南金花茶當年生嫩莖或頂芽為外植體，沖洗中去除葉片，切成3-4厘米長帶1-3個葉腋的莖段，消毒、沖洗、備用；

(2)切除莖段兩端，保持新鮮切口斜插于啟動培養(yǎng)基上誘導芽，該培養(yǎng)基配方為：

MS或WPM+1.0-2.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L IAA，

附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L瓊脂，pH值5.6-5.8；培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強度1500-2000Lux，30-40天獲得增殖小芽；

(3)切割步驟(2)高度在2-3厘米小芽，接種到以下增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)：

改良WPM+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA，

培養(yǎng)基中附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L瓊脂，pH值5.8-6.0，培養(yǎng)條件同(2)，經(jīng)50天培養(yǎng)形成叢生芽；

(4)選取步驟(3)叢生芽中高在2-3厘米的單個芽，保留1-3葉片，接種到以下生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-7周，得到生根苗：

改良1/2MS+2.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3g/L活性炭，

附加15-20.0g/L白砂糖，4g/L卡拉膠，pH值5.6-5.8，培養(yǎng)條件同(2)；

(5)在室內(nèi)自然光下培養(yǎng)7-10天后取出生根苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽到消毒基質(zhì)中，該基質(zhì)體積比為：紅土:腐質(zhì)土＝2:1，空氣相對濕度70-80％、溫度20-30℃，30天的移栽成活率大于95％。

所述的方法是：改良WPM培養(yǎng)基和改良1/2MS培養(yǎng)基的組成及含量如下表(單位mg/L)：

本發(fā)明具有的實質(zhì)性特點和顯著進步是：

本發(fā)明云南金花茶嫩莖培養(yǎng)基的激素與“一種嫩芽金花茶的組培快繁方法”的植物激素具有同態(tài)像或同構(gòu)像。盡管兩者按植物學分類分別屬于金花茶組不同的兩個種，但這兩種植物各步驟培養(yǎng)基激素的性質(zhì)相同，區(qū)別僅在于培養(yǎng)基微量元素、激素濃度、環(huán)境條件。因此，本發(fā)明提供了這樣一種方法，當不同種的削弱了頂端優(yōu)勢的金花茶進行組織培養(yǎng)時，如果其中一種獲得成功，那么另一種金花茶的組培的植物激素組合與前者同態(tài)或同構(gòu)，通過調(diào)整激素濃度等而達到組培目的。因此，即使在基因轉(zhuǎn)錄水平上，存在差異的兩種金花茶，也可以將二者視為同質(zhì)的植物。從而提高實驗效率，降低成本。

盡管上述方法是在本發(fā)明實驗類比和歸納之后得到的結(jié)果，然而根據(jù)上述方法，在改良了培養(yǎng)基微量元素，調(diào)整了激素濃度和環(huán)境條件后，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明流程簡單。直接以優(yōu)良單株嫩莖為材料“以芽繁芽”，培育的種苗無變異，可與母株的性狀完全保持一致。

2、本發(fā)明不針對叢生芽愈傷組織，無需用種子為啟動材料萌發(fā)小苗，也無壯苗環(huán)節(jié)。(盡管根據(jù)類比推理，壯苗環(huán)節(jié)可以與生根環(huán)節(jié)兼并。)直接采用以芽繁芽的方式增殖，

3、本發(fā)明所用的培養(yǎng)基激素為6-BA+IAA和IBA+NAA兩種，所篩選的培養(yǎng)基在增殖和生根階段其組培苗均不會產(chǎn)生褐化。

4、本發(fā)明的增殖培養(yǎng)基配方，平均增殖倍數(shù)達到了6.83倍，為“一種金花茶組培繁殖方法”的平均增殖倍數(shù)為4.6倍的1.48倍。而我們使用后者相近配方于云南金花茶上，其增殖倍數(shù)只有4.33倍。

5、本發(fā)明的生根培養(yǎng)基的生根率高，達到了100％。其中的凝固劑選用卡拉膠替代瓊脂粉，降低了生產(chǎn)成本。并且不需生根苗的前期激素預(yù)處理，也不需芽生根前期護理，減少了操作環(huán)節(jié)，減少了切口褐化和污染發(fā)生的概率。

5、本發(fā)明在煉苗階段，選用腐質(zhì)土與紅土，紅土為腐質(zhì)土的2倍，保證有效供給營養(yǎng)，兼顧基質(zhì)的保水和透氣。重要是，配比酸性紅土使基質(zhì)呈酸性，有利于云南金花茶的組培苗成活，30天移栽成活率達到95％以上。

6、本發(fā)明用白砂糖代替了蔗糖，降低了組培苗的生產(chǎn)成本。

本發(fā)明可實現(xiàn)云南金花茶種苗的的工廠化生產(chǎn)，為保護和開發(fā)云南金花茶這一瀕危的名貴花卉資源提供了一種種苗遺傳性狀穩(wěn)定、增殖速度快、生根苗質(zhì)量好、移栽成活率高的方法。

附圖說明

圖1啟動階段，添加NAA時的生長情況，長勢較差(40d)；

圖2啟動階段，高濃度生長素導致誘導的芽基部產(chǎn)生大量愈傷組織(40d)；

圖3啟動階段，正常生長的無菌小芽(40d)；

圖4增殖階段，激素配比問題導致增殖苗嚴重愈傷化(50d)；

圖5增殖階段，正常增殖的芽叢(50d)；

圖6生根階段，激素配比問題導致生根苗無法生根，且基部有較多愈傷組織(40d)；

圖7生根階段，正常的生根組培苗(40d)；

圖8移栽成活的云南金花茶組培苗(125d)。

圖9實施案例(增殖苗)

圖10實施案例(生根苗)

圖11實施案例(煉苗)

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明方法做進一步說明，實施例包括但不限制本發(fā)明的保護范圍。

具體實施方式

實施例1

設(shè)云南金花茶為組培培養(yǎng)基的集合G，G＝{<g₁，α₁>，<g₂，α₂>，<g₃，α₃>}，g₁、g₂、g₃分別是叢生芽增殖、增殖擴繁、生根的培養(yǎng)基，α₁，α₂，α₃分別是g₁、g₂、g₃的組合方式；

另一種的金花茶組培培養(yǎng)基的集合H，H＝{<h₁，β₁>，<h₂，β₂>，<h_n，β₃>}，h₁、h₂、h₃分別是叢生芽增殖、增殖擴繁、生根的培養(yǎng)基，β₁、β₂、β₃分別是h1、h2、h3的組合方式；

設(shè)f是G→H的映射，使集合G中第n個(n＝1，2，3)組培方法的植物激素a₁⁽ⁿ⁾，a₂⁽ⁿ⁾，…∈A_n，有f(a₁⁽ⁿ⁾)＝b₁⁽ⁿ⁾，f(a₂⁽ⁿ⁾)＝b₂⁽ⁿ⁾，…，且b₁⁽ⁿ⁾，b₂⁽ⁿ⁾，…∈h_n，h_n為集合H中的組培方法，那么，b₁⁽ⁿ⁾、b₂⁽ⁿ⁾，…與a₁⁽ⁿ⁾、a₂⁽ⁿ⁾，…具有激素的同構(gòu)像，這兩個系統(tǒng)是同構(gòu)的。

本發(fā)明中，云南金花茶的植物激素與“一種嫩芽金花茶的組培快繁方法”的激素比較：愈傷組織培養(yǎng)基前者6-BA、IAA，后者6-BA、NAA；叢生芽增殖培養(yǎng)基前者6-BA、IAA，后者6-BA、NAA；生根培養(yǎng)基前者為IBA、NAA，后者為IAA、NAA。其中，叢生芽增殖或壯苗培養(yǎng)基可以與生根培養(yǎng)基兼并。因此，兩者的組培各培養(yǎng)基具有同構(gòu)像。盡管兩者按植物學分類分屬于金花茶不同種，這兩個培養(yǎng)基激素是同構(gòu)的，區(qū)別僅在于調(diào)整基本培養(yǎng)基的微量元素、激素的濃度、pH值以及部分環(huán)境條件。

實施例2：

(1)外植體的選擇與消毒：于2015年3月在西南林業(yè)大學智能溫室大棚內(nèi)，選擇生長健狀，半木質(zhì)化的云南金花茶的嫩枝，用剪刀剪下，帶回實驗室，在流水下沖洗10-20分鐘，在沖洗過程中去除葉片，并切成3-4厘米長帶1-3個葉腋的莖段，轉(zhuǎn)移到消毒容器內(nèi)。先用75％酒精噴灑在外植體上，使外植體濕潤，再轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi)，加入0.1％升汞，振蕩消毒8-12min，最后用無菌水沖洗3～5次，備用。

(2)芽的誘導。將消毒后的莖段，切除兩端3-5毫米，使其兩端保持新鮮切口，斜插于啟動培養(yǎng)基上，其培養(yǎng)基配方為：MS或WPM+1.0-2.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L IAA中，培養(yǎng)基中附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L瓊脂，pH值5.6-5.8。培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強度1500-2000Lux。其平均腋芽誘導率超過90％。

(3)芽的增殖。將步驟(2)中長出的高度在2-3厘米小芽切割下來，接種到繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)50天的培養(yǎng)形成叢生芽，表1增殖培養(yǎng)基為：改良WPM+6-BA+TDZ+IAA組合及其結(jié)果，其中，改良WPM+3.0mg/L6-BA+0.1mg/L IAA組合效果較為突出，芽的增值系數(shù)為6.83，平均苗高3.5cm(見表1)，該培養(yǎng)基中附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L瓊脂，pH值5.8-6.0，培養(yǎng)條件同(2)。

表2增殖培養(yǎng)基為MS或WPM+6-BA+KT+IAA組合及其結(jié)果，各組合與表1較好增殖結(jié)果比較，差異較大；

表1不同激素配比對云南金花茶腋芽增殖的影響

注：表中相同列不同字母代表在0.05水平上差異顯著，以下表2～4相同。

表2 6-BA與KT組合對云南金花茶增殖的影響

(4)生根培養(yǎng)。步驟(3)的叢生芽中的單個芽長至2-3厘米左右時，選取葉片舒展的單個芽，去除多余葉片，使葉片數(shù)保留1-3片。切取后接種到生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)6-7周左右，得到云南金花茶的生根苗(見表3)。其中，以生根培養(yǎng)基為：改良1/2MS+2.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3g/L活性炭，生根率最高，達100％(見表4)。該培養(yǎng)基中附加15-20.0g/L白砂糖，4g/L卡拉膠，pH值5.6-5.8，培養(yǎng)條件同(2)。

表3不同生長素組合下的云南金花茶生根結(jié)果

表4云南金花茶生根配方的進一步篩選結(jié)果

(5)生根苗的移栽。生根的小苗移栽前先在室內(nèi)自然光下培養(yǎng)7-10天左右，然后再取出生根苗，洗凈根部周圍的培養(yǎng)基，之后移栽到消過毒的基質(zhì)中，移栽基質(zhì)為紅土:腐質(zhì)土(體積比)＝2:1。移栽前一個月注意保溫保濕和透氣，空氣相對濕度保持在70-80％，溫度在20-30℃，一個月后小苗基本適應(yīng)外界環(huán)境，其成活率達95％，然后轉(zhuǎn)入正常的水肥管理。