本發(fā)明屬于玉米轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，涉及一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法。

背景技術(shù)：

近年來，世界人口不斷增長(zhǎng)、耕地日趨減少、環(huán)境污染、全球氣候變暖、鹽漬化土地的面積逐年擴(kuò)大等問題，嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，造成的土地危機(jī)、糧食危機(jī)和能源危機(jī)已成為全球亟待解決的問題。傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)不能滿足人類社會(huì)發(fā)展的需要。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一門新興的生物技術(shù)，已經(jīng)展現(xiàn)出巨大的潛力和應(yīng)用前景。玉米作為主要的糧食作物，其品質(zhì)和產(chǎn)量對(duì)全人類的可持續(xù)發(fā)展具有極重要的意義。所以通過植物基因工程手段，培育新的植物品種以適應(yīng)氣候的變化，解決環(huán)境問題，已經(jīng)成為巨大的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

草銨膦(glufosinateammonium)又名草丁膦、雙丙氨膦，是德國(guó)赫斯特公司開發(fā)的一種有機(jī)磷類滅生性仿生莖葉處理劑，是一種廣譜觸殺型除草劑，其作用靶標(biāo)是植物氮代謝過程中起著重要作用的谷氨酰胺合成酶(gs)。通過抑制此酶,引起氮代謝紊亂和氨過量積累，造成植物中毒,葉綠體解體，光合作用受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致植物死亡。草銨膦已經(jīng)用于大面積的雜草預(yù)防，且作為篩選藥劑成功應(yīng)用于基因工程育種，已取得巨大成就。

轉(zhuǎn)基因后代遺傳不穩(wěn)定性一直是轉(zhuǎn)基因育種存在的問題。轉(zhuǎn)基因植株后代的目的基因拷貝數(shù)多以及在基因減數(shù)分裂時(shí)重組交換等因素都可能導(dǎo)致目的基因的丟失或沉默。而玉米基因組強(qiáng)大，轉(zhuǎn)座子多，轉(zhuǎn)座率高達(dá)80％，目的基因更容易丟失或沉默。所以如何快速、高效的獲得轉(zhuǎn)基因玉米遺傳穩(wěn)定株系，是轉(zhuǎn)基因育種工作者要解決的重大難題。

現(xiàn)階段用于轉(zhuǎn)基因玉米抗性篩選的方法主要包括葉片噴灑、涂抹、種子萌發(fā)和根吸收等，實(shí)驗(yàn)證明葉片噴灑法篩選效果最佳，但是隨著玉米代數(shù)的增加，后代性狀分離以及基因沉默和丟失，采用同一噴施強(qiáng)度的效果已經(jīng)無法滿足育種工作的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法，包括如下步驟：

(1)轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲取：

采用基因工程方法將含有bar基因的載體pcambia2300-bar導(dǎo)入非轉(zhuǎn)基因玉米材料中，獲得t0代轉(zhuǎn)化植株幼苗，待生長(zhǎng)健壯后移栽入大田，進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉，成熟期收獲t1代種子；

(2)除草劑草銨膦水溶液的噴施篩選

挑選飽滿無病的t1代種子，種植于大田并噴灌澆水；待t1代植株生長(zhǎng)至三葉期，進(jìn)行初次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.2-0.3l/m²；初次噴施處理7-9天，進(jìn)行第二次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.5-0.7l/m²；第二次噴施處理15-20天，進(jìn)行第三次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為1.0-1.2l/m²；三次噴施處理均采用葉片噴施方式，草銨膦水溶液濃度為450-650mg/l；三次噴施處理期間，持續(xù)觀察植株存活情況，不斷淘汰死亡植株；

(3)存活植株的自花授粉與收獲：

對(duì)經(jīng)過三次草銨膦水溶液噴施處理的存活植株進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉；授粉40天后，玉米果穗苞葉逐漸變黃即可收獲，干燥、脫粒后置于-20℃環(huán)境下保藏；

所述基因工程方法為成熟胚原位轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、peg介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法或子房注射法。

所述非轉(zhuǎn)基因玉米材料為天塔五號(hào)、鐵7922、綜31、1312或1314。

所述步驟(2)除草劑草銨膦水溶液的噴施篩選為：挑選飽滿無病的t1代種子，種植于大田并噴灌澆水；待t1代植株生長(zhǎng)至三葉期，進(jìn)行初次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.29l/m²；初次噴施處理8天，進(jìn)行第二次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.61l/m²；第二次噴施處理18天，進(jìn)行第三次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為1.2l/m²；三次噴施處理均采用葉片噴施方式，草銨膦水溶液濃度為500mg/l；三次噴施處理期間，持續(xù)觀察植株存活情況，不斷淘汰死亡植株。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的方法操作流程清晰簡(jiǎn)單，篩選過程快速高效，篩選結(jié)果穩(wěn)定可靠，能夠有效去除玉米轉(zhuǎn)基因事件中廣泛存在的基因轉(zhuǎn)座、沉默或丟失等遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象，提高轉(zhuǎn)基因玉米后代的遺傳穩(wěn)定性，為利用基因工程方法培育優(yōu)質(zhì)玉米新品種提供技術(shù)輔助與支持，具有較高的田間應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為轉(zhuǎn)基因玉米所用含bar基因的載體pcambia2300；

圖2為第一次草銨膦噴施結(jié)果；

圖3為第二次草銨膦噴施結(jié)果；

圖4為第三次草銨膦噴施結(jié)果；

圖5為pcr產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，m:dnamarkerⅲ；1:質(zhì)粒(載體pcambia2300-bar)；2-11:t1代存活植株；12:野生型植株天塔五號(hào)。

具體實(shí)施方式

天塔五號(hào)、鐵7922、綜31、1312或1314等玉米品種或品系購于天津科潤(rùn)津豐種業(yè)有限責(zé)任公司。

載體pcambia2300-bar購于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明：

實(shí)施例1

一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法，包括如下步驟：

(1)轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲?。?/p>

采用成熟胚原位轉(zhuǎn)化法將含有bar基因載體(圖1載體pcambia2300-bar)導(dǎo)入非轉(zhuǎn)基因玉米材料天塔五號(hào)中獲得t0代轉(zhuǎn)化植株幼苗，待其生長(zhǎng)健壯后移栽入天津大學(xué)遺傳工程研究所隔離試驗(yàn)田，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉，成熟期收獲t1代種子并干燥脫粒，置于-20℃環(huán)境保藏；

(2)除草劑草銨膦水溶液的噴施篩選：

挑選飽滿無病的t1代種子，種植于大田并噴灌澆水；待t1代植株生長(zhǎng)至三葉期，進(jìn)行初次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.29l/m²；初次噴施處理8天(見圖2)，進(jìn)行第二次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.61l/m²；第二次噴施處理18天(見圖3)，進(jìn)行第三次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為1.2l/m²(第三次噴施處理20天，見圖4)；三次噴施處理均采用葉片噴施方式，草銨膦水溶液濃度為500mg/l；三次噴施處理期間，持續(xù)觀察植株存活情況，不斷淘汰死亡植株；

(3)存活植株的自花授粉與收獲：

對(duì)經(jīng)過三次草銨膦水溶液噴施處理的存活植株進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉；授粉40天后，玉米雌穗苞葉逐漸變黃即可收獲，干燥、脫粒后置于-20℃環(huán)境下保藏。

t2代及以后各世代植株的篩選按照(2)至(3)的步驟進(jìn)行。

玉米葉片基因組的提?。?/p>

取經(jīng)三次篩選后存活的t1代植株嫩葉葉片(步驟(2)完成時(shí))，應(yīng)用ctab法提取基因組，具體方法如下：

①取少量新鮮玉米嫩葉于研缽中，用液氮破碎至粉末狀，取0.1g左右轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；

②加入2％ctab提取液600μl，混勻，加入0.1％β-巰基乙醇；

③在65℃水浴中溫浴1h，每隔10min倒置混勻；

④冷卻到室溫后，加入600μl的氯仿，充分振蕩混勻；

⑤離心：室溫，12000r/min，10min；

⑥取上清，重復(fù)步驟④，再次抽提；

⑦取上清，加等體積異丙醇，室溫沉淀30min，室溫，12000r/min，離心10min；

⑧棄上清，用75％乙醇洗兩次；

⑨烘干沉淀，溶于50μlddh2o中備用。

pcr驗(yàn)證：取上述玉米基因組，以bar(streptomyceshygroscopicus吸水鏈霉菌)為目的基因，bar基因序列如seqidno.1所示，設(shè)計(jì)引物序列如seqidno.2、3所示，進(jìn)行pcr反應(yīng)。

pcr反應(yīng)體系：

pcr程序如下：

pcr產(chǎn)物取5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在目的條帶的位置大多數(shù)均出現(xiàn)亮帶(550bp)。證明經(jīng)過草銨膦篩選后的玉米植株陽性比例很高,凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，充分驗(yàn)證了本方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米篩選的高效性，有效消除基因轉(zhuǎn)座、沉默或丟失帶來的影響，有利于轉(zhuǎn)基因玉米的穩(wěn)定遺傳和生產(chǎn)推廣。

實(shí)施例2

一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法，包括如下步驟：

(1)轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲?。?/p>

采用花粉管通道法將含有bar基因的載體pcambia2300-bar導(dǎo)入非轉(zhuǎn)基因玉米材料鐵7922中，獲得t0代轉(zhuǎn)化植株幼苗，待生長(zhǎng)健壯后移栽入大田，進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉，成熟期收獲t1代種子；

(2)除草劑草銨膦水溶液的噴施篩選

挑選飽滿無病的t1代種子，種植于大田并噴灌澆水；待t1代植株生長(zhǎng)至三葉期，進(jìn)行初次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.25l/m²；初次噴施處理9天，進(jìn)行第二次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.5l/m²；第二次噴施處理20天，進(jìn)行第三次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為1.0l/m²；三次噴施處理均采用葉片噴施方式，草銨膦水溶液濃度為650mg/l；三次噴施處理期間，持續(xù)觀察植株存活情況，不斷淘汰死亡植株；

(3)存活植株的自花授粉與收獲：

對(duì)經(jīng)過三次草銨膦水溶液噴施處理的存活植株進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉；授粉40天后，玉米雌穗苞葉逐漸變黃即可收獲，干燥、脫粒后置于-20℃環(huán)境下保藏；

t2代及以后各世代植株的篩選按照(2)至(3)的步驟進(jìn)行。

存活植株基因組的提取與pcr驗(yàn)證，步驟同實(shí)施例1，結(jié)果表明，t1代目的條帶的位置出現(xiàn)亮帶(550bp)。

實(shí)施例3

一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法，包括如下步驟：

(1)轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲?。?/p>

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有bar基因的載體pcambia2300-bar導(dǎo)入非轉(zhuǎn)基因玉米材料綜31中，獲得t0代轉(zhuǎn)化植株幼苗，待生長(zhǎng)健壯后移栽入大田，進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉，成熟期收獲t1代種子；

(2)除草劑草銨膦水溶液的噴施篩選：

挑選飽滿無病的t1代種子，種植于大田并噴灌澆水；待t1代植株生長(zhǎng)至三葉期，進(jìn)行初次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.3l/m²；初次噴施處理7天，進(jìn)行第二次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為0.7l/m²；第二次噴施處理15天，進(jìn)行第三次草銨膦水溶液噴施處理：噴施量為1.2l/m²；三次噴施處理均采用葉片噴施方式，草銨膦水溶液濃度為650mg/l；三次噴施處理期間，持續(xù)觀察植株存活情況，不斷淘汰死亡植株；

(3)存活植株的自花授粉與收獲：

對(duì)經(jīng)過三次草銨膦水溶液噴施處理的存活植株進(jìn)行常規(guī)農(nóng)事管理并自花授粉；授粉40天后，玉米雌穗苞葉逐漸變黃即可收獲，干燥、脫粒后置于-20℃環(huán)境下保藏；

t2代及以后各世代植株的篩選按照(2)至(3)的步驟進(jìn)行；

存活植株基因組的提取與pcr驗(yàn)證，步驟同實(shí)施例1，結(jié)果表明，t1代目的條帶的位置出現(xiàn)亮帶(550bp)。

實(shí)驗(yàn)證明，用peg介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法或子房注射法替代本實(shí)施例的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，其它同本實(shí)施例，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株進(jìn)行篩選。

實(shí)驗(yàn)證明，用1312或1314替代本實(shí)施例的綜31，其它同本實(shí)施例，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株進(jìn)行篩選。

實(shí)施例1-3自花授粉用下述步驟：

玉米植株花期時(shí)，雄穗須在散粉前進(jìn)行套袋，雌穗須在即將吐絲時(shí)進(jìn)行套袋，待玉米雌穗吐絲2天后，選擇晴朗的上午進(jìn)行授粉操作。保留柱頭花絲3cm，收集雄穗花粉散落在同一植株的雌穗的花絲上，并套袋。每一株玉米授粉操作完畢后須用酒精擦拭手掌，保證玉米花粉純合。授粉操作全部結(jié)束后，將授過粉植株的雄穗剪去，在距離玉米植株氣根10cm處追加尿素，單次施肥量為10g/株，用土掩埋即可，每星期澆水一次。

sequencelisting

<110>天津大學(xué)

<120>一種淘汰轉(zhuǎn)基因玉米遺傳不穩(wěn)定植株的篩選方法

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>streptomyceshygroscopicus

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