本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種尖葉盆距蘭的組培快繁方法。

背景技術(shù)：

尖葉盆距蘭(Gastrochilus acutifolius(Lindley)Kuntze.)為蘭科盆距蘭屬的一種氣生蘭，主要分布于尼泊爾、錫金、不丹、印度東北部、緬甸、老撾、越南、泰國(guó)等國(guó)，我國(guó)僅云南南部有分布，主要生長(zhǎng)于海拔800～1400米的山地林緣樹干上。

尖葉盆距蘭傘形花序，萼片和花瓣黃色帶紫褐色斑點(diǎn)，邊緣具不整齊的流蘇，帶有香氣，具有較高的園藝價(jià)值。此外，在云南思茅地地區(qū)，尖葉盆距蘭被用于淋巴結(jié)核、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、腎炎水腫、呃逆、胃痛等疾病的治療。尖葉盆距蘭為距盆蘭屬稀少種，其分布狹窄，由于過度的采摘以及生境地的破壞，使其處于瀕危狀態(tài)，因此對(duì)其人工繁殖并進(jìn)行野外回歸刻不容緩。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未有尖葉盆距蘭組織培養(yǎng)技術(shù)研究的報(bào)道，也未有尖葉盆距蘭組織培養(yǎng)技術(shù)專利的申請(qǐng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種尖葉盆距蘭的組培快繁方法，目的在于通過誘導(dǎo)、增殖、分化、煉苗移栽等步驟成功獲得了健壯的尖葉盆距蘭試管苗，建立尖葉盆距蘭組培快速繁殖技術(shù)體系。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：一種尖葉盆距蘭的組培快繁方法，所述的方法包括依次進(jìn)行的類原球莖的誘導(dǎo)步驟、增殖步驟和分化培養(yǎng)步驟；所述的類原球莖的誘導(dǎo)步驟為將外植體的芽點(diǎn)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成類原球莖；其中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：1/2MS、0.1～1.0mg/L玉米素、0.1～0.5mg/L吲哚丁酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、50～100ml/L椰子汁，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。

需要說明的是，所述的增殖步驟為將誘導(dǎo)形成的類原球莖接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

其中，所述的增殖培養(yǎng)基包括：MS、0.1～1.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、0.1～0.5mg/L萘乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、0.1～0.3g/L活性炭，所述的增殖培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。

需要說明的是，所述的分化培養(yǎng)步驟為將增殖所得的類原球莖接種到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分化出試管小苗；

其中，所述的分化培養(yǎng)基包括：1/2MS、1.0～1.5mg/L萘乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、0.05～0.1g/L活性炭，所述的分化培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。

需要說明的是，所述的分化步驟之后還包括煉苗和移栽步驟，即將分化所得的試管小苗進(jìn)行煉苗并移栽至混合基質(zhì)中，即可得尖葉盆距蘭種苗；

其中，所述的混合基質(zhì)為：體積比為1:1的樹皮和蘭石。

需要說明的是，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為25～28℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為90～120天。

需要說明的是，所述的增殖步驟的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間為20～30天，培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為12～14小時(shí)/天。

需要說明的是，所述的分化步驟的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為12～14小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為40～60天。

需要說明的是，所述的煉苗和移栽步驟的煉苗時(shí)間為1～3天。

需要說明的是，所述的類原球莖的誘導(dǎo)步驟之前還包括外植體采集步驟。

需要說明的是，所述的類原球莖的誘導(dǎo)步驟為：將外植體經(jīng)清水沖洗、升汞消毒、無(wú)菌水漂洗后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)90～120天即可誘導(dǎo)形成類原球莖。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明通過誘導(dǎo)、增殖、分化、煉苗移栽等步驟成功獲得了健壯的尖葉盆距蘭試管苗，建立尖葉盆距蘭組培快速繁殖技術(shù)體系；

2、通過本發(fā)明的方法獲得的尖葉盆距蘭種苗的存活率可達(dá)90％以上。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求書作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在對(duì)本發(fā)明做有限次修改可獲得的技術(shù)方案仍然屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

(1)外植體采集：2013年秋季將采集于云南思茅的野生尖葉盆距蘭移種到溫室大棚中，2014春季當(dāng)新芽萌動(dòng)時(shí)，用解剖刀小心切取葉鞘未打開的新生營(yíng)養(yǎng)芽，用濕潤(rùn)的白紗布包裹保水處理后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室并及時(shí)實(shí)驗(yàn)；

(2)類原球莖的誘導(dǎo)：將步驟(1)的外植體在自來水下沖洗30分鐘后剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩下最后兩層葉鞘；并置于超凈工作臺(tái)中于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無(wú)菌水沖洗2次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分鐘，用無(wú)菌水漂洗3次后剝?nèi)プ詈笠粚尤~鞘；并迅速置于0.1％的升汞溶液中消毒1分鐘、經(jīng)無(wú)菌水漂洗5次后用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面的水分，用無(wú)菌解剖刀將外植體縱向切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)90天，培養(yǎng)溫度為25℃，即可誘導(dǎo)形成類原球莖，誘導(dǎo)率達(dá)75.3％，污染率低至10％以下；

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0mg/L玉米素+0.5mg/L吲哚丁酸+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+50ml/L椰子汁，pH為5.4；

(3)類原球莖的增殖：將步驟(2)所得的類原球莖用無(wú)菌鑷子搗散并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為1500lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，即可得到大量的類原球莖，增殖系數(shù)達(dá)到5.1；

所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.4；

(4)分化培養(yǎng)：將步驟(3)所得的類原球接種到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為1500lx，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，即能分化出試管小苗，分化率達(dá)到87.4％；

所述的分化培養(yǎng)基為：1/2MS+1.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+0.05g/L活性炭，pH為5.4；

(5)煉苗和移栽：將步驟(4)所得健壯的、高約6～9cm的試管瓶苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗1天，洗凈根部的培養(yǎng)基后在溫室的自然光放置至根系發(fā)白，在體積比為1:1樹皮和蘭石混合基質(zhì)中栽培成苗即得尖葉盆距蘭種苗，移栽30天后成活率達(dá)到90％。

實(shí)施例2

(1)外植體采集：2015春季將采自云南西雙版納的野生尖葉盆距蘭移種到溫室大棚中，當(dāng)新芽萌動(dòng)時(shí)，用解剖刀小心切取葉鞘未打開的新生營(yíng)養(yǎng)芽，用濕潤(rùn)的白紗布包裹保水處理后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室并及時(shí)實(shí)驗(yàn)；

(2)類原球莖的誘導(dǎo)：將外植體在自來水下沖洗50分鐘后剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩下最后兩層葉鞘；并置于超凈工作臺(tái)中于0.1％的升汞溶液中消毒26分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒8分鐘，用無(wú)菌水漂洗4次后剝?nèi)プ詈笠粚尤~鞘；并迅速置于0.1％的升汞溶液中消毒2分鐘、經(jīng)無(wú)菌水漂洗6次后用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面的水分，用無(wú)菌解剖刀將外植體縱向切成0.3～0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)105天，培養(yǎng)溫度為27℃，即可誘導(dǎo)形成類原球莖，誘導(dǎo)率達(dá)82.9％，污染率低于6.5％；

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.5mg/L玉米素+0.3mg/L吲哚丁酸+22g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+80ml/L椰子汁，pH為5.6；

(3)類原球莖的增殖：將步驟(2)所得的類原球莖用無(wú)菌鑷子搗散并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為1700lx，光照時(shí)間為13小時(shí)/天，即可得到大量的類原球莖，增殖系數(shù)為6.0；

所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.3mg/L萘乙酸+24g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂+0.2g/L活性炭，pH為5.6；

(4)分化培養(yǎng)：將步驟(3)所得的類原球接種到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)55天，培養(yǎng)溫度為27℃，光照強(qiáng)度為1700lx，光照時(shí)間為13小時(shí)/天，即能分化出試管小苗，分化率達(dá)到75.7％；

所述的分化培養(yǎng)基為：1/2MS+1.3mg/L萘乙酸+21g/L蔗糖+5.0g/L瓊脂+0.07g/L活性炭，pH為5.6；

(5)煉苗和移栽：將步驟(4)所得健壯的、高約6～9cm的試管瓶苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基后在溫室的自然光放置至根系發(fā)白，在體積比為1:1樹皮和蘭石混合基質(zhì)中栽培成苗即得尖葉盆距蘭種苗，移栽30天后成活率達(dá)到93.8％。

實(shí)施例3

(1)外植體采集：2016春季將采自云南普洱的野生尖葉盆距蘭移種到溫室大棚中，當(dāng)新芽萌動(dòng)時(shí)，用解剖刀小心切取葉鞘未打開的新生營(yíng)養(yǎng)芽，用濕潤(rùn)的白紗布包裹保水處理后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室并及時(shí)實(shí)驗(yàn)；

(2)類原球莖的誘導(dǎo)：將外植體在自來水下沖洗60分鐘后剝?nèi)ネ饷娴娜~鞘至僅剩下最后兩層葉鞘；并置于超凈工作臺(tái)中于0.1％的升汞溶液中消毒30分鐘，無(wú)菌水沖洗3次后剝?nèi)ヒ粚尤~鞘；再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分鐘，用無(wú)菌水漂洗5次后剝?nèi)プ詈笠粚尤~鞘；并迅速置于0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘、經(jīng)無(wú)菌水漂洗7次后用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面的水分，用無(wú)菌解剖刀將外植體縱向切成0.5cm左右的芽點(diǎn)并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)120天，培養(yǎng)溫度為28℃，即可誘導(dǎo)形成類原球莖，誘導(dǎo)率達(dá)到69.5％，污染率低于1％以下；

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1mg/L玉米素+0.1mg/L吲哚丁酸+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+100ml/L椰子汁，pH為5.8；

(3)類原球莖的增殖：將步驟(2)所得的類原球莖用無(wú)菌鑷子搗散并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間為14小時(shí)/天，即可得到大量的類原球莖，增殖系數(shù)為3.8；

所述的增殖培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L 6-芐氨基腺嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+0.3g/L活性炭，pH為5.8；

(4)分化培養(yǎng)：將步驟(3)所得的類原球接種到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天，培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時(shí)間為14小時(shí)/天，即能分化出試管小苗，分化率為68.2％；

所述的分化培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂+0.1g/L活性炭，pH為5.8；

(5)煉苗和移栽：將步驟(4)所得健壯的、高約6～9cm的試管瓶苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基后在溫室的自然光放置至根系發(fā)白，在體積比為1:1樹皮和蘭石混合基質(zhì)中栽培成苗即得尖葉盆距蘭種苗，移栽30天后成活率達(dá)95％以上。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。