本發(fā)明屬于植物組培領(lǐng)域，尤其是一種涉及浙江金線蓮組織培養(yǎng)體系的建立方法。

背景技術(shù)：

浙江金線蓮（Anoectochilus zhejiangensis）為蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生珍稀草本植物，主要分布在浙江、福建等地，作為一種珍貴中草藥，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。浙江金線蓮的生物學(xué)特性及藥理活性與同屬基原植物金線蓮相近，對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較嚴(yán)格，自然萌發(fā)率不到千分之一，且自然繁殖時(shí)間長(zhǎng)且繁殖率不高，再加上近年來(lái)人為大量采挖，導(dǎo)致浙江金線蓮野生資源日趨枯竭，因此保護(hù)野生浙江金線蓮已經(jīng)到了刻不容緩的地步。

植物組織培養(yǎng)是保護(hù)瀕危植物的有效技術(shù)手段，可在短時(shí)間內(nèi)繁殖出大量新生植株。在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的篩選將直接影響到組織培養(yǎng)的成功與否，植物激素的濃度配比將直接影響到植株快繁的效率。因此培養(yǎng)基與激素配比的選擇對(duì)組織培養(yǎng)的成功與否具有重要作用。

迄今有關(guān)金線蓮基原植物，如中國(guó)臺(tái)灣金線蓮、金線蓮、福建金線蓮等快速繁殖體系的研究已有報(bào)道[王勇.金線蓮組織培養(yǎng)新體系建立及優(yōu)化.北方園藝,2010,13: 178-179；陳永快,林一心,鄒暉等.福建金線蓮和中國(guó)臺(tái)灣金線蓮的組培快繁技術(shù).現(xiàn)代園藝,2008,10:9-12.]，并發(fā)現(xiàn)不同基原植物間的快速繁殖體系相差較大，但是關(guān)于浙江金線蓮組織培養(yǎng)方面的研究尚屬空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法。

一種浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法，包括類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根步驟，

其中，類原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，pH 5.8，液體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中添加質(zhì)量含量10%香蕉泥；

１）類原球莖誘導(dǎo)：采用液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，

液體培養(yǎng)基中含 TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.4 mg/L；

固體培養(yǎng)基含TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L；

2）類原球莖增殖：

增值培養(yǎng)基中含稀效唑1.5 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L，其中稀效唑是類原球莖增殖的主要因子；

3）類原球莖分化：對(duì)類原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)，10天類原球莖球體頂部開(kāi)始突起變尖，變綠，60 天后可分化成帶有莖節(jié)、葉片及幼小毛狀根的小苗，

分化培養(yǎng)基中含6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L；

4）植株生根：分化的幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后開(kāi)始有根長(zhǎng)出，生根培養(yǎng)基中含 NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L。

所述１）類原球莖誘導(dǎo)，取生長(zhǎng)健康的無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)上將其葉片從柄部切除，氣生根從基部切除，將莖切成含2-4個(gè)節(jié)的莖段。

所述１）類原球莖誘導(dǎo)，采用液體培養(yǎng)基，第一次接種3 天后即更換培養(yǎng)基，以后每7 天更換1次培養(yǎng)基，90 r/min，光照時(shí)間12 h/d，3000 lx，溫度為25℃。

所述類原球莖固體誘導(dǎo)、增殖、分化及生根的培養(yǎng)條件為：3000 lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度為25℃。

本發(fā)明的有益效果是，為了解決資源稀缺問(wèn)題，有必要建立其快速繁殖的最優(yōu)體系。因此本申請(qǐng)以浙江金線蓮為材料，探討不同植物激素配比對(duì)類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根的影響，建立植株快速繁殖的最優(yōu)體系，為浙江金線蓮的擴(kuò)大培養(yǎng)打下基礎(chǔ)，也為今后對(duì)浙江金線蓮成分等方面的研究及開(kāi)發(fā)利用提供條件。同時(shí)研究結(jié)果對(duì)解決金線蓮基原植物資源保護(hù)與合理利用之間的矛盾具有一定的指導(dǎo)意義。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

圖1是浙江金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)圖；

圖2是浙江金線蓮類原球莖的增殖圖；

圖3是浙江金線蓮類原球莖分化圖；

其中A部分：分化培養(yǎng)10d；B部分：分化培養(yǎng)60d；

圖4 是60 d后浙江金線蓮的生根培養(yǎng)情況圖，

其中A部分：4號(hào)培養(yǎng)基；B部分：7號(hào)培養(yǎng)基；

圖5是120 d后浙江金線蓮的生根培養(yǎng)情況圖，

其中A部分：4號(hào)培養(yǎng)基，B部分：7號(hào)培養(yǎng)基；

圖6是180 d后浙江金線蓮的生根培養(yǎng)情況圖，

其中A部分：4號(hào)培養(yǎng)基，B 部分：7號(hào)培養(yǎng)基。

具體實(shí)施方式

一、材料與方法

1.1 材料

浙江金線蓮（ZJJ）組培苗由同濟(jì)大學(xué)麗水中藥研究院資源植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

類原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，pH 5.8，液體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中額外添加10%香蕉泥。所有培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.2 類原球莖的誘導(dǎo)

液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖。選取TDZ和NAA各0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L 3種濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)健康的無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)上將其葉片從柄部切除，氣生根從基部切除，將莖切成含2-4個(gè)節(jié)的莖段，隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組4瓶，每瓶接種10個(gè)，第一次接種3 d后即更換培養(yǎng)基，以后每7 d更換1次培養(yǎng)基，接種31 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，取平均值計(jì)算其誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率 =（誘導(dǎo)出類原球莖莖段數(shù)/接種莖段數(shù)）× 100% 。

固體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖。選取TDZ 0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L 、NAA 0.2 mg/L、0.4 mg/L和6-BA 2.0 mg/L共5種濃度配比組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。莖段處理與3.2.2.1相同，隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶7個(gè)-8個(gè)，每7 d更換1次培養(yǎng)基，接種30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，取平均值計(jì)算其誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)效率。誘導(dǎo)率 =（誘導(dǎo)出類原球莖莖段數(shù)/接種莖段數(shù)）× 100% ；誘導(dǎo)效率 =（誘導(dǎo)出的類原球莖個(gè)數(shù)/接種莖段數(shù)）× 100%

1.2.3 類原球莖的增殖

選取稀效唑0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，6-BA1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L各3個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將誘導(dǎo)出的帶類原球莖的莖段隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組5瓶，每瓶接種10個(gè)-15個(gè)，60 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果，取平均值計(jì)算增殖系數(shù)。增殖系數(shù) =（增殖出的類原球莖個(gè)數(shù)/接種莖段數(shù)）× 100% 。

1.2.4 類原球莖的分化

選取6-BA 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L各3種濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將增殖培養(yǎng)后的類原球莖切割成團(tuán)，隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組5瓶，每瓶接種5個(gè)類原球莖團(tuán)，培養(yǎng)60 d統(tǒng)計(jì)分化情況，取平均值計(jì)算分化率。分化率 =（分化的類原球莖數(shù)/接種類原球莖數(shù)）× 100%。

1.2.5 生根培養(yǎng)

選取IBA和NAA各0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L 3種濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將分化培養(yǎng)得到的幼嫩小苗（約2.0 cm）隨機(jī)接入生根培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶接種7個(gè)-8個(gè)幼嫩小苗，每培養(yǎng)60 d統(tǒng)計(jì)生根情況，取平均值計(jì)算生根率。生根率 =（生根幼嫩小苗數(shù)/接種幼嫩小苗數(shù)）× 100% 。

1.2.6 培養(yǎng)條件

類原球莖液體誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為：90 r/min，光照時(shí)間12 h/d，3000 lx，25℃；

類原球莖固體誘導(dǎo)、增殖、分化及生根的培養(yǎng)條件為：3000 lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度為25℃。

二、結(jié)果與分析

2.1 類原球莖的誘導(dǎo)

2.1.1 液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖

莖段經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，節(jié)間部位形成2個(gè)-6個(gè)乳白色類原球莖（圖1），培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，如表1。結(jié)果表明：TDZ和NAA配合使用能誘導(dǎo)浙江金線蓮莖段長(zhǎng)出類原球莖，但不同的激素對(duì)類原球莖的誘導(dǎo)效果影響不同。當(dāng)TDZ濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加類原球莖的誘導(dǎo)率沒(méi)有明顯變化，例如TDZ濃度為0.2 mg/L，NAA濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L 時(shí)，類原球莖的誘導(dǎo)率依次為10.8%、12.5%、9.2%。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著TDZ濃度的增加，類原球莖的誘導(dǎo)率有較為顯著地提高，例如當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L，TDZ的濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L時(shí)，類原球莖的誘導(dǎo)率依次為10.8%、29.2%、50.0%。可見(jiàn)TDZ對(duì)類原球莖的誘導(dǎo)效果的影響大于NAA。在所有激素配比中，8號(hào)培養(yǎng)基類原球莖的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到62.5%。因此，優(yōu)選的誘導(dǎo)條件為TDZ和NAA的濃度分別為0.6 mg/L和0.4 mg/L。

2.1.2 固體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖

與液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖類似，固體誘導(dǎo)培養(yǎng)一周左右，在莖段節(jié)間部位開(kāi)始出現(xiàn)乳白色類原球莖。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，結(jié)果如表2所示。TDZ、NAA和6-BA按不同的配比使用均能誘導(dǎo)浙江金線蓮莖段長(zhǎng)出類原球莖，但不同激素配比對(duì)金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)效果不同，從誘導(dǎo)率來(lái)看3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)能力均較好，類原球莖的誘導(dǎo)率在3者間不存在明顯的差異，其中3號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到68.0%。從誘導(dǎo)效率來(lái)看，5號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率最高，為144.6%，顯著高于其他4組。因此綜合誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)效率，固體培養(yǎng)基中類原球莖誘導(dǎo)優(yōu)選條件為TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L。

2.2 類原球莖的增殖

將誘導(dǎo)出類原球莖的莖段轉(zhuǎn)移至固體增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)60 d后觀察到新增殖的類原球莖數(shù)量眾多、生長(zhǎng)旺盛（見(jiàn)圖2）。統(tǒng)計(jì)類原球莖個(gè)數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明：稀效唑、6-BA和NAA配合使用能有效使浙江金線蓮類原球莖增殖，且不同的激素配比對(duì)類原球莖的增殖效果存在差異，其中第8號(hào)培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，為8.4。從極差R值分析可知，稀效唑?qū)︻愒蚯o的增殖起主要作用，其次為6-BA，影響最小的是NAA。根據(jù)k值大小，可以得出類原球莖增殖的優(yōu)選條件為稀效唑1.5 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。

2.2.1 類原球莖的分化

對(duì)類原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)，10 d左右類原球莖球體頂部開(kāi)始突起變尖，變綠，然后逐漸伸長(zhǎng)，分化出嫩芽（圖3 A），60 d后可分化成帶有莖節(jié)、葉片及幼小毛狀根的小苗（圖3 B）。對(duì)分化的類原球莖數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算分化率。結(jié)果如表4所示，不同的激素配比對(duì)類原球莖的分化效果產(chǎn)生不同影響。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加，分化率逐漸降低，例如，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L時(shí)，分化率分別為73.3%、65.3%、57.3%。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，分化率逐漸降低，例如，當(dāng)NAA濃度為0.2mg/L，6-BA濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L時(shí)，分化率分別為81.3%、65.3%、46.7%。因此1號(hào)培養(yǎng)基的分化率最高，分化的優(yōu)選條件為6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L。

2.2.2 生根培養(yǎng)

分化的幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后開(kāi)始有根長(zhǎng)出，生根培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)及植株生長(zhǎng)狀況（圖4），計(jì)算生根率，結(jié)果如表5所示。7種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)浙江金線蓮生根，且不同激素配比對(duì)生根效果的影響不同，其中1-6號(hào)培養(yǎng)基的生根率都達(dá)到了100%，但是從生根數(shù)、根長(zhǎng)等植株生長(zhǎng)的整體狀況看，4號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況最好，平均根數(shù)為1.51條，根長(zhǎng)為1.53 cm，株高7.90 cm，莖節(jié)數(shù)6.50個(gè)，7號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況最差，生根率僅為70%，株高、莖節(jié)數(shù)、平均根數(shù)等指標(biāo)均低于其他6組培養(yǎng)基。因此浙江金線蓮生根培養(yǎng)的優(yōu)選條件為1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L。

60 d后，即累計(jì)培養(yǎng)120 d再次觀察和統(tǒng)計(jì)植株生根狀況（圖5），結(jié)果如表6所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，根不斷增多變長(zhǎng)，植株不斷生長(zhǎng)。從整體上看4號(hào)培養(yǎng)基和6號(hào)培養(yǎng)基中植株生長(zhǎng)狀況都較好，平均株高、莖節(jié)數(shù)、根長(zhǎng)及根數(shù)在2者間均無(wú)顯著差異。7號(hào)培養(yǎng)基的平均株高、莖節(jié)數(shù)、根長(zhǎng)、根數(shù)及生根率也都有所增加，生根率達(dá)到92%，但相比其他幾組整體生長(zhǎng)狀況依然最差。

60 d后即累計(jì)培養(yǎng)180 d，再次觀察植株的生根狀況（圖6），結(jié)果如表7所示。植株整體都在不斷生長(zhǎng)，7組植株間生長(zhǎng)狀況的差距逐漸減小，其中7號(hào)培養(yǎng)基中的植株的生根率達(dá)到了100%，可見(jiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生根率不斷增加，但其生長(zhǎng)狀況與其他組比依然較差。生長(zhǎng)狀況較好的為4號(hào)培養(yǎng)基和5號(hào)培養(yǎng)基。

綜合3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生根數(shù)不斷增多，根不斷變長(zhǎng)，平均株高不斷增長(zhǎng)，誘導(dǎo)率不斷升高，在4號(hào)培養(yǎng)基上浙江金線蓮植株生長(zhǎng)狀況一直最好，7號(hào)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況則始終最差。可見(jiàn)優(yōu)選的生根培養(yǎng)條件為1/2 MS + NAA1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L，生根率可達(dá)100%。

在建立浙江金線蓮快速繁殖體系的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的植物激素配比對(duì)類原球莖的誘導(dǎo)、增殖、分化及生根產(chǎn)生較大的影響。

對(duì)于類原球莖的誘導(dǎo)，在不同的培養(yǎng)基中，優(yōu)選激素配比不同。在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)中優(yōu)選類原球莖誘導(dǎo)條件分別為TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.4 mg/L和TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L，誘導(dǎo)率分別為62.5%，59.3%。類原球莖增殖、分化、生根的優(yōu)選激素組合依次為：稀效唑1.5 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L、6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L、1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L，增殖系數(shù)、分化率、生根率分別為8.4、87.3%、100%，其中稀效唑是促進(jìn)類原球莖增殖的主要因子。