本發(fā)明屬于作物雜種優(yōu)勢利用的遺傳育種學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用長雄野生稻(Oryza longistaminata)無性繁殖特性培育多年生稻恢復(fù)系的方法。

背景技術(shù)：

雜種優(yōu)勢現(xiàn)象普遍存在于整個(gè)生物界，而雜種優(yōu)勢也被廣泛利用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等方面，雜交稻的利用大大提高了我國水稻產(chǎn)量，被譽(yù)為是第二次綠色科技革命。生產(chǎn)實(shí)踐證明，在相同條件下，雜交水稻一般比普通良種增產(chǎn)20％左右。解決雜交水稻制種問題的有效途徑首推利用雄性不孕性，雄性不孕性在遺傳上一般分核質(zhì)型和胞質(zhì)型兩類，以后者在雜交優(yōu)勢育種中最有利用價(jià)值。對(duì)于水稻雄性不孕植株，當(dāng)用某一父本類型與之多次重復(fù)雜交，后代仍能保持雄性不孕；而在自由傳粉的某些情況下，則產(chǎn)生孕性分離的后代。因而在自由傳粉的情況下，不同父本核因子與不孕母本細(xì)胞質(zhì)相互作用的特異性，致使F₁發(fā)生不同的孕性分離現(xiàn)象，通過進(jìn)一步選育，從中獲得雄性不孕系、保持系及恢復(fù)系，可用作水稻雜種優(yōu)勢育種的材料。1987年，袁隆平院士提出雜交水稻育種分三個(gè)發(fā)展階段的戰(zhàn)略:育種方法從三系法到兩系法再到一系法，朝著程序由繁到簡而效率越來越高的方向發(fā)展。

雖然雜交稻技術(shù)對(duì)糧食安全具有顯著貢獻(xiàn)，但由于雜交稻種子只能利用一次，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高。如何利用長雄野生稻以多年生性為主的無性繁殖特性培育多年生稻恢復(fù)系，實(shí)現(xiàn)恢復(fù)系種植一次收獲多次、可以進(jìn)行多次制種、配制的雜交稻種植一次收獲多年(多次)，達(dá)到降低稻作生產(chǎn)成 本、提高稻作生產(chǎn)效益的目的，成為農(nóng)業(yè)科技人員亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了利用長雄野生稻無性繁殖特性培育多年生稻恢復(fù)系的方法，實(shí)現(xiàn)多年生稻恢復(fù)系種植一次能夠連續(xù)生長2年及以上，除了可以利用無性繁殖保存和繁殖恢復(fù)系外，還可有效提高雜交稻生產(chǎn)過程中的制種成本，提高生產(chǎn)效益。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

利用長雄野生稻無性繁殖特性培育多年生稻恢復(fù)系的方法，包括如下步驟：

(1)以長雄野生稻為父本，以栽培稻為母本進(jìn)行雜交獲得第一F₁代；

(2)將所述第一F₁代自交，得到第一F₂代；

(3)篩選出攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一F₂代，其中所述多年生性遺傳位點(diǎn)包括主效位點(diǎn)和微效位點(diǎn)；

(4)攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一F₂代連續(xù)自交得到后代材料，從中選育出多年生稻品系，所述多年生稻品系攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)，即具有多年生性狀；

(5)利用步驟(4)選育出的具有多年生性狀的多年生稻品系做供體，以恢復(fù)系做母本，通過雜交將多年生性遺傳位點(diǎn)導(dǎo)入至恢復(fù)系中，獲得第二F₁代；

(6)所述第二F₁代與所述恢復(fù)系做父本進(jìn)行回交，再自交，篩選出攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻恢復(fù)系。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述栽培稻是RD23。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述主效位點(diǎn)包括Rhz2和Rhz3，所述微效位點(diǎn)包括QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述具有多年生性狀的多年生稻品系攜帶選 自Rhz2、Rhz3、QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10的一個(gè)或多個(gè)多年生性遺傳位點(diǎn)。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述第一F₂代連續(xù)自交得到的后代材料包括F₃代、F₄代、F₅代、F₆代、F₇代、F₈代、F₉代、F₁₀代、F₁₁代和/或F₁₂代中的一種或多種。

在本發(fā)明的再一個(gè)方面，所述第二F₁代與恢復(fù)系父本進(jìn)行回交4次，然后連續(xù)自交4代。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對(duì)公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。

在本發(fā)明中，用作父本的是長雄野生稻(Oryza longisatminata)，其為廣泛生長在熱帶非洲的一個(gè)野生種，具有長柱頭和花藥(Oka，1967)、自交不親和(Nayar，1968；Chu，1969)、異花授粉(Causse，1991)和地下莖(Porteres，1949；Bezancon，1977；Ghesquiere，1985)特性。在長雄野生稻中，由于地下莖特有的無性繁殖作用，是發(fā)展多年生稻的理想性狀，本發(fā)明正是基于長雄野生稻的該特性成功培育成多年生稻恢復(fù)系。

在本發(fā)明中用作母本的栽培稻可以是包括秈稻和粳稻在內(nèi)的多數(shù)水稻品種，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述栽培稻是RD23，其為來自泰國的廣泛種植的秈稻品種。

在本文中，術(shù)語“多年生”，“多年生性”或相似術(shù)語是指通過長雄野生稻與栽培稻雜交后代選育的具有種植一次通過無性繁殖可以生長并收獲多年(2年及以上)的品系特性，從而具有良好的多年生能力。

采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，例如但不限于雜交，回交和分子 標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(MAS)，以長雄野生稻為父本，栽培稻為母本獲得第一F₁代，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一F₁代是F₁(RD23/O.longistaminata)。

在本文中，術(shù)語“自交”是指來自同一個(gè)體的雌雄配子的結(jié)合或具有相同基因型個(gè)體間的交配或來自同一無性繁殖系的個(gè)體間的交配。

在本文中，術(shù)語“回交”指子一代與兩個(gè)親本中的任意一親本進(jìn)行雜交，這種方法叫做回交。在育種工作中，常利用回交的方法來加強(qiáng)雜種個(gè)體中某一親本的性狀表現(xiàn)。用回交方法所產(chǎn)生的后代稱為回交雜種。被用來回交的親本稱為輪回親本，未被用來回交的親本稱為非輪回親本。

在本發(fā)明中，通過對(duì)第一F₁代進(jìn)行自交，得到第一F₂代。在本發(fā)明中，還可以包括通過對(duì)第一F₁代進(jìn)行回交，得到BC₁(輪回親本為母本栽培稻，在優(yōu)選的實(shí)施方式中優(yōu)選為母本栽培稻RD23)分離群體。

對(duì)第一F₂代和/或BC₁分離群體進(jìn)行遺傳分析，篩選出多年生性遺傳位點(diǎn)，對(duì)長雄野生稻的多年生性遺傳位點(diǎn)的鑒定和分析可以參見胡鳳益所著“長雄野生稻地下莖分子定位和遺傳研究”，西南農(nóng)業(yè)大學(xué)2002屆碩士論文。在本發(fā)明中全文引入該論文作為參考文獻(xiàn)。其中所述多年生性遺傳位點(diǎn)包括主效位點(diǎn)和微效位點(diǎn)，具體而言：

在本發(fā)明中，所述主效位點(diǎn)包括Rhz2和Rhz3，所述Rhz2和Rhz3分別定位在第3染色體上的SSR分子標(biāo)記OSR16和OSR13之間，其距離分別是1.3cM和8.1cM，和第4染色體上的SSR分子標(biāo)記RM119和RM237之間，其距離分別是2.2cM和7.4cM，須說明的是，OSR16等標(biāo)記名稱是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該都知曉的，屬于基于水稻基因組序列開發(fā)公開發(fā)布的水稻SSR分子標(biāo)記術(shù)語。

如表1所示，在本發(fā)明中，所述微效位點(diǎn)包括QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10。

在本發(fā)明中所使用的，Rhz代表地下莖表達(dá)主效位點(diǎn)；Q代表微效位點(diǎn)(QTL)；RN:單株地下莖多少；RBD：地下莖分枝程度；RBN：二次分枝程度；RL:地下莖平均長度；RIL:地下莖節(jié)間的平均長度；RIN：地下莖節(jié)間 數(shù)；RDW：單株地下莖干重；TN：單株分蘗數(shù)；數(shù)字代表該位點(diǎn)位于第幾號(hào)染色體。

表1 地下莖相關(guān)基因/QTLs及性狀

在本發(fā)明中，將攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一F₂代自交獲得包括F₃代、F₄代、F₅代、F₆代、F₇代、F₈代、F₉代、F₁₀代、F₁₁代和/或F₁₂代中的一種或多種后代材料，基因組基本穩(wěn)定純合形成株系，從而可以用作攜帶多年生性遺傳位點(diǎn)的第一多年生稻品系，其中所述第一多年生稻品系根據(jù)品系基因型(攜帶不同多年生遺傳位點(diǎn))和表現(xiàn)型的不同可以包括一種或多種稻品系，可以根據(jù)需要選擇任一種多年生稻品系進(jìn)行育種。在本發(fā)明中優(yōu)選使用的第一多年生稻品系是采用分子標(biāo)記輔助選擇培育的具有多年生性狀的稻作品系，如本發(fā)明中的PR23、PR24等稻作品系，即多年生稻23號(hào)，多年生稻24號(hào)，根據(jù)英文Perennial Rice 23，Perennial Rice 24命名，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，不同品系攜帶不同多年生性遺傳位點(diǎn)。獲得多年生稻，同時(shí)獲得足夠的產(chǎn)量，例如PR24攜帶了多年生性遺傳位點(diǎn)Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)，可以實(shí)現(xiàn)多年生性。

在本發(fā)明中，將上述具有不同多年生性遺傳位點(diǎn)的第一多年生稻品系為供體，在優(yōu)選實(shí)施方式中以所述PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，以恢復(fù)系做母本，通過雜交方法將多年生性遺傳位點(diǎn)導(dǎo)入至恢復(fù)系中。此處可以使用的三系雜交稻中包括本領(lǐng)域中已知的三系雜交稻恢復(fù)系、也可以使用兩系雜交稻恢復(fù)系、也可以是自己選育的三系或兩系恢復(fù)系，例如不育系(如珍汕97A)、保持系(珍汕97B)、恢復(fù)系(蜀恢527)，本發(fā)明中優(yōu)選使用的是云南大學(xué)提供的三系雜交稻，即恢復(fù)系R2066、不育系芽1A和保持系芽1B(暫命名)。

在本發(fā)明中采用MAS技術(shù)，所述MAS技術(shù)即分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker-Assisted Selection MAS)是利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行間接選擇，是對(duì)目標(biāo)性狀在DNA水平的選擇，不受環(huán)境影響，不受等位基因顯隱性關(guān)系干擾，選擇結(jié)果可靠，同時(shí)又可避免等位基因間顯隱性關(guān)系的干擾，從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良；分子標(biāo)記輔助選擇育種具有標(biāo)記基因型鑒定可以在低世代和植株生長的任何階段進(jìn)行、共顯性的分子標(biāo)記允許在雜合體階段進(jìn)行鑒 定隱性基因、對(duì)目的基因的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助選擇育種是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物改良的一種手段，其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的。

MAS根據(jù)分子標(biāo)記的不同，如常用的有SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記、CAPS標(biāo)記等，但原理和步驟基本相同，雖然操作方式會(huì)有差異，在本領(lǐng)域中有大量的相關(guān)文章和書籍，在育種領(lǐng)域已經(jīng)成為很常用的技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?；静襟E包括DNA提取、PCR標(biāo)記的擴(kuò)增、凝膠電泳、和/或結(jié)果(帶型)分析。

本發(fā)明參考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，對(duì)各株系的代表單株分別提取基因組DNA。

對(duì)多年生性遺傳位點(diǎn)緊密連鎖多態(tài)的SSR標(biāo)記進(jìn)行各單株基因組DNA為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染后，參考雙親的擴(kuò)增條帶，對(duì)帶型進(jìn)行判別記錄，篩選目的基因型單株。

在本發(fā)明中，用多年生稻品系做供體，在優(yōu)選實(shí)施方式中以所述PR23和/或PR24多年生稻品系作為供體，恢復(fù)系做受體獲得的第二F₁代，在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述第二F₁代是F₁(恢復(fù)系/PR24)。所述第二F₁代與所述恢復(fù)系母本進(jìn)行回交和/或自交，每代都通過相應(yīng)遺傳位點(diǎn)緊密連鎖分子標(biāo)記(SSR標(biāo)記，表1)進(jìn)行遺傳位點(diǎn)的追蹤與鑒定，篩選獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻恢復(fù)系。此處，回交目的是遺傳背景的清除，利用MAS留下需要的性狀，其它則和輪回親本一致。因此，在本發(fā)明中所述第二F₁代與所述恢復(fù)系母本進(jìn)行回交和/或自交的先后順序以及重復(fù)次數(shù)沒有特別限制，只要最終能篩選出獲得攜帶長雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)的多年生稻恢復(fù)系。其中，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行回交1次，或者連續(xù)回交2次、3次、4次或更多次；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行自交1次，或者連續(xù)自交2次、3次、4次或更多次。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 單次或連續(xù)的回交和單次或連續(xù)的自交可以交替進(jìn)行。

在本發(fā)明中，所述遺傳位點(diǎn)的追蹤與鑒定是MAS過程，從而獲得帶有長雄野生稻多年生性(無性繁殖特性)遺傳位點(diǎn)的單株。

本發(fā)明通過在本領(lǐng)域的一年生稻恢復(fù)系中引入長雄野生稻中控制無性繁殖特性(多年生性)的遺傳位點(diǎn)，培育多年生稻恢復(fù)系，實(shí)現(xiàn)了利用長雄野生稻無性繁殖特性來保存和繁殖恢復(fù)系的目的，同時(shí)可以利用其多年生性進(jìn)行連續(xù)多年配制雜交種，從第二季開始省去了重新播種、育秧、插秧等環(huán)節(jié)，降低了稻作生產(chǎn)成本，提高了稻作生產(chǎn)效益。

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料包括以下

長雄野生稻：從尼日爾收集，由日本物理與化學(xué)研究所的Hiroshi Hyakutake博士友好提供；

栽培稻RD23：來自泰國的秈稻品種；

恢復(fù)系R2066：由云南大學(xué)提供；

不育系芽1A：由云南大學(xué)提供。

雜交方法在本領(lǐng)域中廣泛已知，完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，具體可以參考作物育種學(xué)-中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社。

MAS及多年生性遺傳位點(diǎn)的分子標(biāo)記檢測參考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，對(duì)各株系的代表單株分別提取基因組DNA。對(duì)多年生性遺傳位點(diǎn)緊密連鎖多態(tài)的SSR標(biāo)記進(jìn)行各單株基因組DNA為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過8％的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染后，參考雙親的擴(kuò)增條帶，對(duì)帶型進(jìn)行判別記錄，篩選目的基 因型單株。

本案例所涉及材料與方法，如無特殊說明，均為常規(guī)材料與方法。

實(shí)施例1 F₁(RD23/O.longistaminata)代的培育

以RD23為母本去雄后，長雄野生稻為父本直接授粉后通過幼胚挽救得到F₁(RD23/O.longistaminata)植株，其開花時(shí)期表現(xiàn)出花藥不開裂，具有約30％左右的花粉育性、地下莖表現(xiàn)介于父本和母本之間。

實(shí)施例2 多年生稻品系PR24的培育

種植實(shí)施例1中所獲得的F₁(RD23/O.longistaminata)代，通過對(duì)F₁植株進(jìn)行強(qiáng)制自交授粉獲得了F₂種子,這些種子用1/4MS培養(yǎng)基(3％蔗糖+0.7％瓊脂，pH值5.8)進(jìn)行胚培養(yǎng)獲得株苗，通過練苗后移栽種植，最終獲得分離的F₂單株進(jìn)行篩選。

利用選自Rhz2和Rhz3中的一個(gè)或多個(gè)主效位點(diǎn)，選自QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10中的一個(gè)或多個(gè)微效位點(diǎn)對(duì)分離的F₂單株進(jìn)行篩選，選育出多年生稻品系PR24(Perennial Rice 24,PR24)，經(jīng)分子檢測，該品系攜帶了來自長雄野生稻多年生性遺傳位點(diǎn)Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)(表2),經(jīng)過水稻生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，其產(chǎn)量表現(xiàn)穩(wěn)定，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有很好的多年生性。

表2列出了在實(shí)施例中所使用的品系的基因型。

表2 所用品系基因型列表

注：A為母本帶型，B為父本帶型，H為雜合帶型,Rhz代表地下莖表達(dá)主效位點(diǎn)；Q代表微效位點(diǎn)(QTL)；Rn代表單株地下莖個(gè)數(shù)多少；Rbd：地下莖分枝程度；Rl:地下莖平均長度；數(shù)字代表該位點(diǎn)位于第幾號(hào)染色體。

實(shí)施例3 多年生稻恢復(fù)系的培育

以雜交稻恢復(fù)系R2066為母本進(jìn)行人工去雄，以多年生稻PR24為父本進(jìn)行雜交獲得F₁(恢復(fù)系R2066/PR24)代種子。

用F₁(恢復(fù)系R2066/PR24)代種子和恢復(fù)系R2066進(jìn)行回交4次，然后連續(xù)自交4次。在回交和自交過程中利用基于SSR的分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker-Assisted Selection,MAS)育種技術(shù)，對(duì)多年生性位點(diǎn)Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)進(jìn)行檢測，選擇攜帶這些位點(diǎn)的植株進(jìn)行進(jìn)一步的回交、自交，直至純合穩(wěn)定，獲得多年生稻恢復(fù)系，命名為Perennial Rice R2066，即PRR2066(表2)。

實(shí)施例4多年生稻恢復(fù)系田間評(píng)價(jià)

(1)多年生稻恢復(fù)系與不育系雜交試驗(yàn)

將多年生稻恢復(fù)系PRR2066與三系雜交稻不育系芽1A進(jìn)行田間雜交制種，結(jié)果顯示，PRR2066可以恢復(fù)三系雜交稻不育系芽1A的育性獲得雜交種。

(2)多年生稻恢復(fù)系多年生性試驗(yàn)

將多年生稻恢復(fù)系PRR2066在景洪試驗(yàn)田進(jìn)行多年生性評(píng)價(jià)和雜交稻制種試驗(yàn)，供體多年生稻PR24作為對(duì)照在景洪試驗(yàn)田進(jìn)行同田種植，經(jīng)過2年4季的田間試驗(yàn)，結(jié)果如下表所示(表3)：

表3 多年生稻恢復(fù)系田間評(píng)價(jià)結(jié)果

注：第一季為第一年早稻，第二季為第一年晚稻，第三季為第二年早稻，第四季為第二年晚稻。

由上述結(jié)果可知：1.多年生稻恢復(fù)系PRR2066可以恢復(fù)不育系芽1A的育性；2.多年生稻恢復(fù)系PRR2066可以實(shí)現(xiàn)多年生性。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的上述具體實(shí)施方式僅僅用于示例性說明或解釋本發(fā)明的原理，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。因此，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入所附權(quán)利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內(nèi)的全部變化和修改例。