本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種外源GA3誘導(dǎo)月季成花的方法，具體涉及一種外源GA3誘導(dǎo)月季無(wú)菌苗開(kāi)花的方法。

背景技術(shù)：

月季(Rosahybrida)在我國(guó)已經(jīng)有1000多年的歷史，主要分為種豐花月季、壯花月季、藤蔓月季、香水月季、灌木月季和月季六大類(lèi)。2005～2008年三年間，總共831個(gè)月季品種在國(guó)際上登錄，這當(dāng)中有豐花月季169個(gè)、雜種香水月季204個(gè)、小花月季89個(gè)、灌叢月季161個(gè)、月季106個(gè)。在國(guó)外，月季在17-18世紀(jì)傳入英國(guó)和法國(guó)。在此之后，歐洲人民將其作為重要種質(zhì)與薔薇進(jìn)行雜交，培育出眾多優(yōu)質(zhì)的新品種。目前，全世界培育了20000多月季新品種。在國(guó)內(nèi)，科學(xué)家們經(jīng)過(guò)大量探索，成功培育出多種抗寒、抗旱、抗病的優(yōu)良月季新品，并進(jìn)行了改變花色的育種。時(shí)至今日，大多數(shù)月季種質(zhì)資源還未曾用于人工育種，其優(yōu)良性狀還沒(méi)有得到挖掘和開(kāi)發(fā)，月季新品種培育因此擁有著巨大的潛力。在國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)育種過(guò)程中，科學(xué)家們大多只注重于月季表觀性狀的改良，如花的形態(tài)、直徑、數(shù)量，而忽視了如成活率、壽命、耐受能力等優(yōu)秀品質(zhì)的保留，這就導(dǎo)致了多種月季優(yōu)良品質(zhì)的缺失，致使品種的衰退。因此，傳統(tǒng)的雜交育種方法遠(yuǎn)不能滿足人們?nèi)找嫣岣叩膶徝酪蟆?/p>

為了滿足人們的需要，組織培養(yǎng)技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)末應(yīng)運(yùn)而生，以此為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因手段為傳統(tǒng)的月季育種提供了一條全新途徑。這種手段可以高效將優(yōu)良的外源基因轉(zhuǎn)入到生物體當(dāng)中并得以表達(dá)，同時(shí)保持生物體性狀相對(duì)的穩(wěn)定性。穩(wěn)定的組培體系和基因轉(zhuǎn)化體系對(duì)月季新品種的獲得意義重大，并已獲得重大成就。

外源植物激素與植物的成花過(guò)程息息相關(guān)，不同激素種類(lèi)及配比對(duì)組培苗的成花誘導(dǎo)千差萬(wàn)別。有相關(guān)研究證明：添加外源的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)植物成花的必要條件，且只有當(dāng)外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度和配比適宜時(shí)，才能誘導(dǎo)植物達(dá)到最高的成花率。關(guān)于對(duì)外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物成花的報(bào)道，科學(xué)家們大多選擇GA3進(jìn)行相關(guān)研究，因?yàn)镚A3可以對(duì)植物分枝和成花有著明顯影響。一些學(xué)者報(bào)道：GA3促進(jìn)植物生長(zhǎng)并使花期提前，加速其生活周期，并且能增強(qiáng)花卉品質(zhì)，增加其觀賞價(jià)值。研究表明：外施GA3能夠打破月季枝條的休眠狀態(tài)，并且使開(kāi)花率大大提高；噴施以50mg/L的GA3對(duì)枝條的伸長(zhǎng)、葉片質(zhì)量、花數(shù)量及鮮重都有促進(jìn)作用，同時(shí)增益花瓣顏色品質(zhì)。另有研究表明：外源GA3處理后的月季枝條與未經(jīng)過(guò)處理的枝條相以，其生長(zhǎng)發(fā)育速度明顯加快。因此，在月季無(wú)菌苗的基礎(chǔ)上，探究外源GA3對(duì)月季成花的影響對(duì)克服月季成花率低，開(kāi)花周期長(zhǎng)，并培育出生長(zhǎng)狀態(tài)良好，色澤艷麗，觀賞性強(qiáng)的月季有著重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在月季無(wú)菌苗培育過(guò)程中，提供一種施加外源GA3的方法，從而快速誘導(dǎo)月季花芽，縮短成花周期，增強(qiáng)花卉品質(zhì)，增加其觀賞價(jià)值，使月季無(wú)菌苗快速成花。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的外源GA3誘導(dǎo)月季成花的方法是將外源GA3添加至月季無(wú)菌苗花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，具體配方為MS培養(yǎng)基+蔗糖+瓊脂+赤霉素(GA3)；其中，所述蔗糖的濃度為40g/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述GA3的濃度為100mg/mL，pH5.83～5.85，然后經(jīng)過(guò)成花培養(yǎng)的過(guò)程，成功誘導(dǎo)出色澤艷麗的月季花朵。

該方法的具體步驟如下：

(1)月季無(wú)菌苗的獲得

a、于花市購(gòu)買(mǎi)普通月季，高約20cm-40cm，花色不限；剪取月季當(dāng)年生健壯枝條，以軟毛刷清除其表面灰塵，置于盛有清水的燒杯中，加少量清洗劑浸泡10min，期間不斷搖動(dòng)燒杯，流水沖洗1h，Cl₂滅菌20min；超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌蒸餾水浸泡清洗3次，無(wú)菌濾紙吸干。

b、取步驟a)中的月季枝條，剪取1.5cm-2cm單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；其中，所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+噻苯隆(TDZ)+萘乙酸(NAA)+瓊脂+蔗糖，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述NAA的濃度為0.1mg/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述蔗糖的濃度為30g/L，pH值為5.83～5.85；接種后培養(yǎng)條件為25℃，光強(qiáng)2000lx，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)30d。

c、取步驟b)中的培養(yǎng)30d后的無(wú)菌苗，超凈工作臺(tái)中，將無(wú)菌苗切取為1.5cm-2cm帶節(jié)間莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于芽增殖培養(yǎng)基中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段；其中，所述的芽增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+TDZ+NAA+瓊脂+蔗糖，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述NAA的濃度為0.05mg/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述蔗糖的濃度為30g/L，pH值為5.83～5.85；接種后培養(yǎng)條件為25℃，光強(qiáng)2000lx，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)45d后，獲得月季無(wú)菌苗。

(2)花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

取步驟(1)月季無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的月季無(wú)菌苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于施加GA3的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期；其中，所述花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖+瓊脂+赤霉素(GA3)，所述蔗糖的濃度為40g/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述GA3的濃度為100mg/mL，pH值為5.83～5.85；培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)40d后，獲得月季的叢生芽；

(3)成花培養(yǎng)

取步驟(2)中培養(yǎng)40d的月季叢生芽切取為單叢，接種于芽增殖培養(yǎng)基中；其中，所述芽增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+TDZ+NAA+活性炭+蔗糖+瓊脂，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述NAA的濃度為0.1mg/L，所述活性炭的濃度為0.6g/L，所述蔗糖的濃度為30g/L，所述瓊脂的濃度為7g/L，pH值為5.83～5.85；培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，10天后即可成花。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1、本發(fā)明的誘導(dǎo)月季成花的方法中，完整的提供了從普通月季植株到無(wú)菌苗成花這一過(guò)程，巧妙的運(yùn)用外源激素GA3誘導(dǎo)月季花芽的形成，大大提高了月季的成花率，使成花率高達(dá)91.7％。

2、本發(fā)明的方法中，合理的調(diào)配從普通月季植株經(jīng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程至無(wú)菌苗成花各個(gè)階段的培養(yǎng)基配方，和花芽誘導(dǎo)過(guò)程中所施加的外源GA3濃度，可快速誘導(dǎo)月季花芽，縮短成花周期，保證最終培育出的月季無(wú)菌苗花朵色澤艷麗、花期長(zhǎng)，觀賞價(jià)值增加，對(duì)月季無(wú)性育種具有重要的理論和實(shí)踐意義，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)獲得的月季無(wú)菌苗。

圖2本發(fā)明花誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中獲得的月季叢生芽。

圖3本發(fā)明成功開(kāi)花的月季再生植株。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚明白本發(fā)明的技術(shù)方案及其優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1

本發(fā)明具體實(shí)施方式里所用到的MS培養(yǎng)基的配制是參照中國(guó)專(zhuān)利CN 104115743 B中記載的MS培養(yǎng)基的配制方法進(jìn)行配制的。而且，所有培養(yǎng)基配制好后均采用121℃高壓蒸汽滅菌20min，待培養(yǎng)基冷凝至室溫后方可使用。

1)、月季無(wú)菌苗的獲得

a、于花市購(gòu)買(mǎi)普通月季，高約20cm-40cm，花色粉紅，剪取月季當(dāng)年生健壯枝條，以軟毛刷清除其表面灰塵，置于盛有清水的燒杯中，加少量清洗劑(1-3滴白貓洗潔精)浸泡10min，期間不斷搖動(dòng)燒杯，流水沖洗1h，Cl2滅菌20min；超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌蒸餾水浸泡清洗3次，無(wú)菌濾紙吸干。

b、取步驟a)中的月季枝條，剪取1.5cm-2cm單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85中，接種后培養(yǎng)條件為25℃，光強(qiáng)2000lx，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)30d。

c、取步驟b)中的培養(yǎng)30d后的無(wú)菌苗，超凈工作臺(tái)中，將無(wú)菌苗切取為1.5cm-2cm帶節(jié)間莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于芽增殖培養(yǎng)基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.05mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段，接種接種后培養(yǎng)條件為25℃，光強(qiáng)2000lx，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)45d后，獲得月季無(wú)菌苗(如圖1所示)。

2)、花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

取步驟1)月季無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的月季無(wú)菌苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于施加GA3的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+蔗糖40g/L+瓊脂7.2g/L+GA3100mg/mL)，pH5.83～5.85中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期，培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得月季的叢生芽(如圖2所示)。

3)、成花培養(yǎng)

取步驟2)中培養(yǎng)40d的月季叢生芽切取為單叢，接種于芽增殖培養(yǎng)基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭0.6g/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L)，pH5.83～5.85中，每瓶均勻接種4叢，接種100瓶，接種后標(biāo)注日期；培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗；10d后月季無(wú)菌苗成功開(kāi)花(如圖3所示)。

本發(fā)明按照上述方法培育出的月季無(wú)菌苗花朵色澤艷麗、花期長(zhǎng)(15-25天)，觀賞價(jià)值增加。同時(shí)，本發(fā)明按照上述方法重復(fù)試驗(yàn)3次；其中，無(wú)菌苗成功開(kāi)花275瓶，不開(kāi)花25瓶，成花率達(dá)91.7％。

本發(fā)明無(wú)菌苗的獲得、花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程對(duì)月季最終的成花情況均是有影響的，現(xiàn)將對(duì)其影響較大的GA3作為對(duì)比進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

對(duì)比例1

1)、月季無(wú)菌苗的獲得

具體操作步驟同實(shí)施例1。

2)、花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

取步驟1)月季無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的月季無(wú)菌苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于不施加GA3的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+蔗糖40g/L+瓊脂7.2g/L)，pH5.83～5.85中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期，培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得月季的叢生芽。

3)、成花培養(yǎng)

具體操作步驟同實(shí)施例1。

結(jié)果：本發(fā)明按照上述方法培育出的月季無(wú)菌苗經(jīng)成花培養(yǎng)后30d左右有花朵形成，花色較淡，花朵小，花期短(8-15天)重復(fù)試驗(yàn)3次；其中，無(wú)菌苗成功開(kāi)花163瓶，不開(kāi)花137瓶，開(kāi)花率為54.3％。

對(duì)比例2

1)、月季無(wú)菌苗的獲得

具體操作步驟同實(shí)施例1。

2)、花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

取步驟1)月季無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的月季無(wú)菌苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于施加GA3的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+蔗糖40g/L+瓊脂7.2g/L+GA350mg/mL)，pH5.83～5.85中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期，培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得月季的叢生芽。

3)、成花培養(yǎng)

具體操作步驟同實(shí)施例1。

結(jié)果：本發(fā)明按照上述方法培育出的月季無(wú)菌苗經(jīng)成花培養(yǎng)后20d左右有花朵形成，花色較淡，花朵小，花期短(8-15天)，重復(fù)試驗(yàn)3次；其中，無(wú)菌苗成功開(kāi)花186瓶，不開(kāi)花114瓶，開(kāi)花率為62％。

對(duì)比例3

1)、月季無(wú)菌苗的獲得

具體操作步驟同實(shí)施例1。

2)、花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

取步驟1)月季無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的月季無(wú)菌苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于施加GA3的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+蔗糖40g/L+瓊脂7.2g/L+GA3200mg/mL)，pH5.83～5.85中，每瓶均勻接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期，培養(yǎng)條件為：25℃，光強(qiáng)2000lux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得月季的叢生芽。

3)、成花培養(yǎng)

具體操作步驟同實(shí)施例1。

結(jié)果：本發(fā)明按照上述方法培育出的月季無(wú)菌苗經(jīng)成花培養(yǎng)后30d有花朵形成，花朵小，色澤差，花期短(5-10天)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，無(wú)菌苗開(kāi)花94瓶，未開(kāi)花206瓶，花朵開(kāi)花率僅為31.3％。具體GA3對(duì)月季無(wú)菌苗成花的影響見(jiàn)表1。

表1 GA3濃度對(duì)月季無(wú)菌苗成花的影響

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，本發(fā)明外源GA3誘導(dǎo)月季成花的過(guò)程中，需要嚴(yán)格控制GA3的濃度，施加適當(dāng)濃度的GA3對(duì)月季無(wú)菌苗成花有促進(jìn)作用，GA3濃度高會(huì)延長(zhǎng)成花時(shí)間，減少成花率，縮短了月季無(wú)菌苗花期。濃度過(guò)低對(duì)月季無(wú)菌苗成花作用不明顯，但縮短了月季花期。本發(fā)明通過(guò)研究明確的提供了最適月季無(wú)菌苗成花的GA3濃度為100mg/mL，在此條件下生長(zhǎng)的月季成花率可達(dá)91.7％，且花期較長(zhǎng)，對(duì)月季的組織培養(yǎng)具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)后續(xù)的分子生物學(xué)研究有重要的意義。

同時(shí)，本發(fā)明還曾嘗試按照中國(guó)專(zhuān)利CN 104115743 B中無(wú)菌苗的獲得方法培養(yǎng)無(wú)菌苗，然后按照實(shí)施例1中步驟(2)與步驟(3)的方式進(jìn)行花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，最后進(jìn)行成花培養(yǎng)，但成花培養(yǎng)后20d有花朵形成，花朵小，色澤差，花期短(8-15天)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，花朵開(kāi)花率僅為72.3％。因此，本發(fā)明對(duì)目前現(xiàn)有的月季無(wú)菌苗獲得方法進(jìn)行綜合與改進(jìn)，將TDZ與NAA進(jìn)行配比，應(yīng)用于芽誘導(dǎo)和芽增殖過(guò)程中，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，最終選擇了最適于月季無(wú)菌苗生成的TDZ與NAA的濃度配比，并在芽誘導(dǎo)過(guò)程中培養(yǎng)基使用MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，芽增殖過(guò)程中培養(yǎng)基使用MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.05mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L。通過(guò)此方法獲得了生長(zhǎng)狀態(tài)良好，成活高的月季無(wú)菌苗。在此無(wú)菌苗基礎(chǔ)上利用本發(fā)明的方法進(jìn)行月季無(wú)菌苗的成花誘導(dǎo)，保證了月季成花品質(zhì)，對(duì)獲得成花率高，花朵色澤艷麗、花期長(zhǎng)的月季有重要的意義。