本發(fā)明涉及植物嫁接及耐逆分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用鹽芥與擬南芥的嫁接體系研究植物耐逆分子機(jī)理的方法。

背景技術(shù)：

植物之間的嫁接是源于我國的一種古老的農(nóng)藝技術(shù)，時(shí)至今日，在園藝生產(chǎn)上，嫁接仍舊是園藝領(lǐng)域常用的技藝。其作為一種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)，已廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝植物的栽培及科研開發(fā)。盡管嫁接技術(shù)歷史悠久，但真正大量的研究始于上世紀(jì)七八十年代，特別是近十年來，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，嫁接的研究逐漸從過去傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀的研究過渡到分子機(jī)理的研究。在國內(nèi)外掀起一次空前的研究熱潮。但是遠(yuǎn)緣嫁接不親和嚴(yán)重限制了該技術(shù)的推廣與應(yīng)用，若能針對不同的情況找出不親和的具體原因，并通過一些巧妙的手段克服或減弱不親和現(xiàn)象，這在植物嫁接研究中具有特別重要的意義。

目前為止，嫁接雜交、嫁接育種發(fā)展較迅速，相應(yīng)的對此分子機(jī)制研究也在逐漸興起，國內(nèi)外均有關(guān)于嫁接引起的基因轉(zhuǎn)移的報(bào)道。水平基因的轉(zhuǎn)移，主要發(fā)生在微生物中，常常是由質(zhì)粒介導(dǎo)，是僅次于基因垂直傳遞重要的基因交流。由于此現(xiàn)象的存在，使生物早期的演化關(guān)系更為復(fù)雜。目前為止，已發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移不僅僅是發(fā)生在細(xì)菌之間，而且也發(fā)生在細(xì)菌與高等生物之間，甚至是高等生物之間。而植物的嫁接引起的水平基因轉(zhuǎn)移有些是可以遺傳的，但有些是不可以遺傳的，這就使得本來就不明朗的這種植物嫁接引起的水平基因轉(zhuǎn)移更加撲朔迷離。而且大部分的研究材料局限于同一物種之間進(jìn)行。

遠(yuǎn)緣雜交在育種上能提供豐富的遺傳材料，拓展育種范圍，創(chuàng)造突變優(yōu)勢更強(qiáng)的新品種，具有重要的意義，而且遠(yuǎn)緣雜交的成功對研究植物嫁接分子機(jī)理的機(jī)制提供有利的基礎(chǔ)保障。然而大部分植物遠(yuǎn)緣雜交是不親和的。

鹽芥和擬南芥為十字花科中兩個(gè)不同屬的小型植株，其中，鹽芥為耐鹽的模式植物，具有對高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫極高的耐受能力，使得鹽芥成為研究植物耐受非生物脅迫逆境機(jī)理的理想材料；而擬南芥為研究雙子葉植物的模式植物，且為不耐鹽的甜土植物。而且鹽芥和擬南芥的基因組測序已經(jīng)完成，因此，通過構(gòu)建鹽芥和擬南芥的嫁接體系對于植物嫁接的分子機(jī)制及嫁接的耐逆分子機(jī)理研究具有重要的意義。但是，擬南芥和鹽芥作為同科不同屬的兩種植物，這兩種植物之間的嫁接屬于屬間的遠(yuǎn)緣嫁接，遠(yuǎn)緣嫁接不親和的特點(diǎn)使得擬南芥和鹽芥嫁接體系的構(gòu)建極為困難。目前還未見有通過構(gòu)建鹽芥與擬南芥的嫁接體系來研究植物耐逆分子機(jī)理的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用鹽芥與擬南芥的嫁接體系研究植物耐逆分子機(jī)理的方法。本發(fā)明首先構(gòu)建了鹽芥與擬南芥的嫁接體系；然后進(jìn)行ICP-OES檢測，以觀察嫁接前后耐鹽性的改變；再提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜檢測，以觀察鹽處理前后的基因的變化及基因交流情況。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用鹽芥與擬南芥的嫁接體系研究植物耐逆分子機(jī)理的方法，步驟如下：

(1)將鹽芥種子經(jīng)消毒處理后，播種于含有瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基上，層積一周后轉(zhuǎn)入長日照光照條件下培養(yǎng)；待鹽芥萌發(fā)時(shí)，將擬南芥種子進(jìn)行消毒處理，并播種于含有瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基上，層積或直接置于長日照光照條件下培養(yǎng)；

(2)在無菌條件下進(jìn)行擬南芥/鹽芥的嫁接、擬南芥/擬南芥的自嫁接、鹽芥/鹽芥的自嫁接和鹽芥/擬南芥的嫁接；

(3)將嫁接好的擬南芥/鹽芥、擬南芥/擬南芥、鹽芥/鹽芥和鹽芥/擬南芥復(fù)合體置于短日照條件下培養(yǎng)，得嫁接苗；

(4)將嫁接苗移栽至水培營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，然后用NaCl進(jìn)行處理，對嫁接苗鹽處理前后離子組含量進(jìn)行檢測，并提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜檢測。

優(yōu)選的，步驟(1)中，鹽芥種子和擬南芥種子消毒處理的方法為：用濃度為0.5％的NaClO消毒6-8分鐘，然后用無菌水清洗4-6次。上述消毒處理的方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO進(jìn)行二次消毒，操作步驟簡化，從而減少了二次污染，而且種子不會(huì)滅過而影響種子萌發(fā)及后期實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述1/2MS培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量百分含量為1-1.5％；進(jìn)一步優(yōu)選為1.2％。研究發(fā)現(xiàn)，選用上述瓊脂含量的1/2MS培養(yǎng)基，既保證足夠的水分利于種子正常萌發(fā)生長，又有利于后續(xù)的取材嫁接。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述長日照培養(yǎng)的條件為：16h光照/8h黑暗，光照條件下的溫度為21-23℃，黑暗條件下的溫度為18-20℃，光強(qiáng)為8000lux，相對濕度大于70％。

優(yōu)選的，步驟(2)中，擬南芥/鹽芥的嫁接方法為：將萌發(fā)后7-10天的鹽芥的真葉及生長點(diǎn)切去，只保留兩片子葉作為砧木；將萌發(fā)后3-5天的擬南芥下胚軸距上端1/4處切下作為接穗，嫁接到鹽芥砧木上。

優(yōu)選的，步驟(2)中，鹽芥/擬南芥、鹽芥/鹽芥、擬南芥/擬南芥的嫁接方法為：將作為砧木擬南芥或鹽芥移至另一含有瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基中，并套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

具體的，鹽芥/擬南芥的嫁接方法為：以萌發(fā)后7-10天的鹽芥作為接穗，以萌發(fā)后5-7天的擬南芥作為砧木，在砧木上套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

鹽芥/鹽芥的嫁接方法為：將長勢一致的鹽芥下胚軸1/2偏上端處切下，然后將作為砧木的部分移至另一含有瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基中，并套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

擬南芥/擬南芥的嫁接方法為：以萌發(fā)后3-5天的擬南芥分別作為接穗和砧木，在作為砧木的擬南芥上套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

優(yōu)選的，步驟(3)中，嫁接好的擬南芥/鹽芥、擬南芥/擬南芥、鹽芥/鹽芥和鹽芥/擬南芥復(fù)合體在短日照條件下的培養(yǎng)時(shí)間分別為：6-8天、6-8天、10-12天和10-12天。

優(yōu)選的，步驟(3)中，短日照培養(yǎng)的條件為：8h光照/16h黑暗，光照條件下的溫度為21-23℃，黑暗條件下的溫度為18-20℃，光強(qiáng)為8000lux，相對濕度大于70％。

優(yōu)選的，步驟(4)中，所述水培營養(yǎng)液為1/2Hogland營養(yǎng)液。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明系首次通過構(gòu)建鹽芥與擬南芥的嫁接體系來研究植物耐逆分子機(jī)理，由于擬南芥和鹽芥屬于同科不同屬的兩種植物，這兩種植物之間的嫁接屬于屬間的遠(yuǎn)緣嫁接，遠(yuǎn)緣嫁接不親和的特點(diǎn)使得擬南芥和鹽芥嫁接體系的構(gòu)建極為困難，本發(fā)明經(jīng)過大量的試驗(yàn)摸索，成功構(gòu)建了鹽芥/擬南芥、鹽芥/鹽芥、擬南芥/鹽芥、擬南芥/擬南芥嫁接體系，然后通過對嫁接體系鹽處理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等離子組含量檢測，以觀察嫁接前后耐鹽性的改變；通過提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜檢測，以觀察鹽處理前后的基因的變化及基因交流情況。因此，本發(fā)明構(gòu)建的鹽芥與擬南芥的嫁接體系為植物耐逆機(jī)理的研究提供了一種新的方向和思路。

(2)在本發(fā)明的鹽芥、擬南芥的嫁接體系構(gòu)建過程中，選擇以萌發(fā)生長到特定時(shí)期的鹽芥或擬南芥分別作為砧木和接穗，通過直接用NaClO單一滅菌減少污染，有利于種子正常萌發(fā)；通過選用1.2％的瓊脂和雙面刀片的使用，有利于得到切口平整，光滑且傷害最小的切面；通過在解剖鏡下操作嫁接，有利于砧木與接穗形成層的更好的吻合，提高嫁接成功率，克服實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)緣雜交不親和的難題。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1：嫁接成功的鹽芥/擬南芥(E/A)嫁接苗；圖中，B為A的嫁接部位放大圖。

圖2A-圖2F：嫁接苗鹽處理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等離子組含量；圖中，A為擬南芥縮寫；E為鹽芥縮寫；S為地上莖葉部分；R為地下根部分；CK為對照；NaCl為100mmol/LNaCl鹽處理。

圖3A：擬南芥/擬南芥自嫁接RNA-Seq測序結(jié)果；At為擬南芥縮寫。

圖3B：擬南芥/鹽芥嫁接RNA-Seq測序二者水平基因交流結(jié)果；At為擬南芥；Es為鹽芥。

圖3C：鹽芥/鹽芥自嫁接RNA-Seq測序結(jié)果；Es為鹽芥。

圖3D：鹽芥/擬南芥嫁接RNA-Seq測序二者水平基因交流結(jié)果；Es為鹽芥；At為擬南芥。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

術(shù)語說明：

1/2MS培養(yǎng)基：指將MS培養(yǎng)基中的大量元素成分減半后的MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配方組成是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(如專利CN104604539A中公開的MS培養(yǎng)基)，該培養(yǎng)基可以購買得到，也可以自行配制。

本申請中所采用培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，并對1/2MS培養(yǎng)基中的瓊脂粉的含量進(jìn)行了優(yōu)化，培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量百分含量為1-1.5％；更優(yōu)選為1.2％。

1/2Hogland營養(yǎng)液：指將Hogland營養(yǎng)液中的全部成分減半后的營養(yǎng)液。Hogland營養(yǎng)液為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的營養(yǎng)液，該營養(yǎng)液的配方是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未見有通過構(gòu)建鹽芥與擬南芥的嫁接體系來研究植物耐逆分子機(jī)理的報(bào)道，基于此，本申請首先構(gòu)建了鹽芥與擬南芥的嫁接體系，然后利用構(gòu)建的嫁接體系來研究植物耐逆分子機(jī)理。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所提供的利用鹽芥與擬南芥的嫁接體系研究植物耐逆分子機(jī)理的方法，步驟如下：

(1)砧木和接穗材料的準(zhǔn)備：首先是將籽粒飽滿的鹽芥種子用0.5％的次氯酸鈉消毒并種在瓊脂粉濃度為1.2％的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃層積1周后置于長日照或短日照光照培養(yǎng)箱內(nèi)豎直培養(yǎng)萌發(fā)備用。待鹽芥萌發(fā)時(shí)，用同樣的消毒方法將擬南芥種子進(jìn)行消毒并種于瓊脂粉濃度為1.2％的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃層積或直接置于長日照光照培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)，待擬南芥種子萌發(fā)后3-5天進(jìn)行擬南芥/鹽芥(A/E)的嫁接、擬南芥/擬南芥(A/A)的自嫁接、鹽芥/鹽芥(E/E)的自嫁接；待擬南芥種子萌發(fā)5-7天進(jìn)行鹽芥/擬南芥(E/A)的嫁接。

(2)無菌條件下嫁接：首先用雙面刀片將長勢一致的鹽芥下胚軸1/2偏上端處切下，然后將作為砧木的擬南芥或鹽芥用鑷子輕輕夾起移至一新的瓊脂粉濃度為1.2％的1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并套上事先準(zhǔn)備好的長約3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管中，其次在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。擬南芥/擬南芥的自嫁接、鹽芥/鹽芥的自嫁接及鹽芥/擬南芥的嫁接均可用此法。

擬南芥/鹽芥的嫁接方法是將長勢一致的無菌苗鹽芥用鑷子移至新的瓊脂濃度1.2％的1/2MS培養(yǎng)基上，用刀片將鹽芥的的真葉及生長點(diǎn)切去，只保留兩片子葉作為砧木備用。將長勢一致的在解剖鏡下能看到有真葉剛萌發(fā)的擬南芥下胚軸距上端1/4左右處切下作為接穗嫁接到事先準(zhǔn)備好的鹽芥砧木上。

(3)嫁接體的培養(yǎng)：將嫁接好的擬南芥/擬南芥的自嫁接、鹽芥/鹽芥的自嫁接及鹽芥/擬南芥及擬南芥/鹽芥復(fù)合體置于短日照光照培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)分別6-8天、10-12天、10-12天和6-8天。然后將嫁接成功的嫁接苗移至1/2Hogland營養(yǎng)液中水培備用。

(4)嫁接苗鹽處理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等離子組含量檢測：嫁接苗水培35天后將長勢一致的嫁接苗分成兩批，一批為對照，一批用100mmol/L的NaCl進(jìn)行處理一周后取材，進(jìn)行ICP-OES檢測以觀察嫁接前后耐鹽性的改變。

(5)嫁接苗的RNA-seq檢測：嫁接苗水培35天后將長勢一致的嫁接苗分成兩批，一批為對照，一批用150mmol/L的NaCl進(jìn)行處理24小時(shí)后取材，提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜檢測，以觀察鹽處理前后的基因的變化及基因交流情況。

上述方法中，對于種子的消毒方法為：直接用濃度為0.5％的NaClO消毒6-8分鐘，然后用無菌水清洗4-6次。此種方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO進(jìn)行二次消毒，操作步驟簡化從而減少了二次污染而且種子不會(huì)滅過而影響種子萌發(fā)及后期實(shí)驗(yàn)。

上述方法中，選用瓊脂粉濃度為1.2％的1/2MS培養(yǎng)基，既保證足夠的水分利于種子正常萌發(fā)生長，又有利于后續(xù)的取材嫁接。

上述方法中，對于鹽芥、擬南芥嫁接體系的構(gòu)建而言，如何選擇砧木和嫁接苗是影響嫁接成活率的關(guān)鍵所在。本發(fā)明在擬南芥/鹽芥的嫁接中，選用萌發(fā)7-10天的略大的鹽芥幼苗作為砧木，其側(cè)根已長出，這樣可以滿足其接穗——擬南芥生長速度快的特點(diǎn)，能大大提高嫁接成活率及保證嫁接苗后期生長旺盛。由于擬南芥生長周期短，用較大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易導(dǎo)致擬南芥提前開花，嫁接苗長勢較差，選用萌發(fā)3-5天的較嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，還能進(jìn)一步保證嫁接苗后期生長的旺盛強(qiáng)壯。

在鹽芥/鹽芥的嫁接中，選用萌發(fā)7-10天的略大的鹽芥幼苗，其側(cè)根已長出，且細(xì)胞分生能力強(qiáng)，能大大提高嫁接成活率及保證嫁接苗后期生長旺盛。由于鹽芥在萌發(fā)初期生長緩慢，在營養(yǎng)土中萌發(fā)后的前三周為其生長緩慢期，三周后會(huì)迅速生長，在培養(yǎng)皿中其生長緩慢期有所縮短，但仍存在，在萌發(fā)一周后會(huì)迅速生長，因此用較小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易導(dǎo)致嫁接后的嫁接苗生長緩慢側(cè)根較多且長勢較差，選用萌發(fā)7-10天的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，還能進(jìn)一步保證嫁接苗后期生長的旺盛強(qiáng)壯。

在鹽芥/擬南芥的嫁接中，以萌發(fā)生長到特定時(shí)期——4片真葉，即萌發(fā)后7-10天的鹽芥為接穗，以萌發(fā)后5-7天的擬南芥為砧木，此時(shí)作為砧木的擬南芥的主根已有側(cè)根出現(xiàn)，能有利保障嫁接成活率及嫁接苗后期長勢。

上述方法中，嫁接后的嫁接體置于短日照下培養(yǎng)，不僅有利于提高嫁接體的成活率，而且還有利于嫁接苗后期生長強(qiáng)壯。這是因?yàn)閿M南芥生長周期短，在其受到傷害后，其生長周期就更進(jìn)一步大大縮短，如果在長日照條件下，就會(huì)導(dǎo)致嫁接苗弱小而過早的開花結(jié)果完成其生活史。而短日照可以延長其營養(yǎng)生長，就彌補(bǔ)長日照下的不足。

上述方法中，種子消毒接種均在無菌超凈臺(tái)中操作，嫁接過程也在無菌超凈臺(tái)中操作，而且嫁接傷口的對接是在解剖鏡下操作，更有利于接穗和砧木形成層的對接，可以提高嫁接苗的成功率。

上述方法中，步驟(4)和步驟(5)中，對鹽處理前后的嫁接苗的砧木和接穗分別取材，取材過程中均離嫁接部位5mm外取材，避免造成污染以至于實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本申請的技術(shù)方案。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實(shí)施例1：利用鹽芥與擬南芥的嫁接體系研究植物耐逆分子機(jī)理的方法

(1)砧木和接穗材料的準(zhǔn)備：首先是將籽粒飽滿的鹽芥種子用0.5％的次氯酸鈉消毒并種在瓊脂粉濃度為1.2％的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃層積1周后置于長日照或短日照光照培養(yǎng)箱內(nèi)豎直培養(yǎng)萌發(fā)備用。待鹽芥萌發(fā)時(shí)，用同樣的消毒方法將擬南芥種子進(jìn)行消毒并種于瓊脂粉濃度為1.2％的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃層積或直接置于長日照光照培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)，待擬南芥種子萌發(fā)后3-5天進(jìn)行擬南芥/鹽芥(A/E)的嫁接、擬南芥/擬南芥(A/A)的自嫁接、鹽芥/鹽芥(E/E)的自嫁接。而鹽芥/擬南芥(E/A)的嫁接是待擬南芥種子萌發(fā)5-7天進(jìn)行嫁接，此時(shí)作為砧木的擬南芥的主根已有側(cè)根出現(xiàn)，能有利保障嫁接成活率及嫁接苗后期長勢。

(2)無菌條件下嫁接：

1)擬南芥/鹽芥的嫁接方法為：將萌發(fā)后7-10天的鹽芥的真葉及生長點(diǎn)切去，只保留兩片子葉作為砧木；將萌發(fā)后3-5天的擬南芥下胚軸距上端1/4處切下作為接穗，嫁接到鹽芥砧木上。

2)鹽芥/擬南芥的嫁接方法為：以萌發(fā)后7-10天的鹽芥作為接穗，以萌發(fā)后5-7天的擬南芥作為砧木，在砧木上套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

3)鹽芥/鹽芥的嫁接方法為：將長勢一致的鹽芥下胚軸1/2偏上端處切下，然后將作為砧木的部分移至另一含有瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基中，并套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

4)擬南芥/擬南芥的嫁接方法為：以萌發(fā)后3-5天的擬南芥分別作為接穗和砧木，在作為砧木的擬南芥上套上長3-6mm，內(nèi)徑/外徑為0.3mm/1.5mm的無菌塑料管，在解剖鏡下將接穗的下胚軸與砧木在套管內(nèi)對接形成嫁接體，最后將培養(yǎng)皿迅速封口。

(3)嫁接體的培養(yǎng)：將嫁接好的擬南芥/擬南芥的自嫁接、鹽芥/鹽芥的自嫁接及鹽芥/擬南芥及擬南芥/鹽芥復(fù)合體置于短日照光照培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)分別6-8天、10-12天、10-12天和6-8天。然后將嫁接成功的嫁接苗移至1/2Hogland營養(yǎng)液中水培備用。

(4)嫁接苗鹽處理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等離子組含量檢測：嫁接苗水培35天后，將長勢一致的嫁接苗隨機(jī)分成兩批，一批為空白對照，一批用100mmol/L的NaCl進(jìn)行處理，一周后取材(對鹽處理前后的嫁接苗的砧木和接穗分別取材，取材過程中均離嫁接部位5mm外取材，避免造成污染以至于實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠)，進(jìn)行ICP-OES檢測，以觀察嫁接前后Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等離子組含量的變化。

結(jié)果如圖2A-圖2F所示，由圖可以看出，嫁接前后Na⁺、K⁺含量差異較明顯，說明耐鹽性發(fā)生明顯改變，而其它離子變化不是很明顯。

(5)嫁接苗的RNA-seq檢測：嫁接苗水培35天后，將長勢一致的嫁接苗分成兩批，一批為對照，一批用150mmol/L的NaCl進(jìn)行處理，24小時(shí)后取材，提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，以觀察鹽處理前后的基因的變化及基因交流情況，結(jié)果如圖3A-圖3D所示。

由圖可以看出，根據(jù)RNA-seq檢測發(fā)現(xiàn)在鹽芥和擬南芥的相互嫁接中均存在水平基因交流現(xiàn)象，這為進(jìn)一步揭示植物耐逆分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

對比例1：

將實(shí)施例1的擬南芥/鹽芥嫁接中，對于砧木苗的選擇分別調(diào)整為：萌發(fā)后3-5天的鹽芥苗和萌發(fā)后11-15天的鹽芥苗，其他操作同實(shí)施例1。

對比例2：

將實(shí)施例1中擬南芥/鹽芥的嫁接中，對于接穗苗的選擇調(diào)整為：萌發(fā)后6-8天的擬南芥苗；將砧木苗的選擇分別調(diào)整為：萌發(fā)后3-5天的鹽芥苗、萌發(fā)后7-10天的鹽芥苗和萌發(fā)后11-15天的鹽芥苗，其他操作同實(shí)施例1。

考察實(shí)施例1、對比例1和對比例2嫁接后嫁接苗的成活率以及后期長勢，結(jié)果如表1所示。

表1：萌發(fā)時(shí)間長短對嫁接苗的影響

(注：表1中接穗為擬南芥，砧木為鹽芥)

由表1可以看出，在擬南芥/鹽芥的嫁接中，作為砧木和接穗的鹽芥和擬南芥幼苗，其萌發(fā)時(shí)間的選擇會(huì)影響嫁接的成活率以及嫁接苗后期的長勢。與對比例1和對比例2相比，本發(fā)明實(shí)施例1選用萌發(fā)7-10天的略大的鹽芥幼苗，其側(cè)根已長出，這樣可以滿足其接穗擬南芥生長速度快的特點(diǎn)，能大大提高嫁接成活率及保證嫁接苗后期生長旺盛。由于擬南芥生長周期短，用較大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易導(dǎo)致擬南芥提前開花，嫁接苗長勢較差，選用萌發(fā)3-5天的較嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，還能進(jìn)一步保證嫁接苗后期生長的旺盛強(qiáng)壯。

對比例3：

將實(shí)施例1的鹽芥/鹽芥的嫁接中，對于砧木苗和接穗苗選擇調(diào)整為：萌發(fā)后3-5天的鹽芥苗，其他操作同實(shí)施例1。

對比例4：

將實(shí)施例1的鹽芥/鹽芥的嫁接中，對砧木苗和接穗苗選擇調(diào)整為：萌發(fā)后13-17天的鹽芥苗；其他操作同實(shí)施例1。

考察實(shí)施例1、對比例3和對比例4嫁接后嫁接苗的成活率以及后期長勢，結(jié)果如表2所示。

表2：萌發(fā)時(shí)間長短對嫁接苗的影響

由表2可以看出，在鹽芥/鹽芥的嫁接中，作為砧木和接穗的鹽芥幼苗，其萌發(fā)時(shí)間的選擇會(huì)影響嫁接的成活率以及嫁接苗后期的長勢。與對比例1和對比例2相比，本發(fā)明實(shí)施例1選用萌發(fā)7-10天的略大的鹽芥幼苗，其側(cè)根已長出，且細(xì)胞分生能力強(qiáng)，能大大提高嫁接成活率及保證嫁接苗后期生長旺盛。由于鹽芥在萌發(fā)初期生長緩慢，在營養(yǎng)土中萌發(fā)后的前三周為其生長緩慢期，三周后會(huì)迅速生長，在培養(yǎng)皿中其生長緩慢期有所縮短，但仍存在，在萌發(fā)一周后會(huì)迅速生長，因此用較小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易導(dǎo)致嫁接后的嫁接苗生長緩慢側(cè)根較多且長勢較差，選用萌發(fā)7-10天的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，還能進(jìn)一步保證嫁接苗后期生長的旺盛強(qiáng)壯。

對比例5：

將實(shí)施例1的鹽芥/擬南芥的嫁接中，對于砧木苗的選擇分別調(diào)整為：萌發(fā)后3-4天的擬南芥苗和萌發(fā)后15±2天的鹽芥苗，其他操作同實(shí)施例1。

對比例6：

將實(shí)施例1的鹽芥/擬南芥的嫁接中，對于接穗苗的選擇調(diào)整為：萌發(fā)后3-5天的鹽芥芥苗和萌發(fā)后15±2的鹽芥苗，其他操作同實(shí)施例1。

考察實(shí)施例1、對比例5和對比例6嫁接后嫁接苗的成活率以及后期長勢，結(jié)果如表3所示。

表3：萌發(fā)時(shí)間長短對嫁接苗的影響

(注：表3中接穗為鹽芥，砧木為擬南芥)

由表3可以看出，在鹽芥/擬南芥的嫁接中，以萌發(fā)生長到特定時(shí)期——4片真葉，即萌發(fā)后7-10天的鹽芥為接穗，以萌發(fā)后5-7天的擬南芥為砧木，此時(shí)作為砧木的擬南芥的主根已有側(cè)根出現(xiàn)，能有利保障嫁接成活率及嫁接苗后期長勢。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。