本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種耐熱粳稻育種新方法。
背景技術(shù)：
水稻是主要糧食作物，全世界有50%以上的人口以稻米為主食，我國(guó)更高達(dá)60%以上。據(jù)研究分析，2030年我國(guó)人口可能增至16億，屆時(shí)糧食需求總量將達(dá)7.4億t。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織預(yù)測(cè)，世界人口在2050年將上升至91億人，全球糧食產(chǎn)出需增長(zhǎng)70%才有可能滿足迅速增長(zhǎng)的人口需求。由此可見水稻生產(chǎn)作為主要糧食來源不僅關(guān)系到我國(guó)糧食安全而且直接影響到世界糧食安全。
近年來，由于全球范圍的氣候異常變化，溫室效應(yīng)不斷加劇，整個(gè)種植業(yè)正面臨高溫挑戰(zhàn)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，過去百年我國(guó)年均溫度升高了近1℃，預(yù)測(cè)到2020年，將升高1.3～2.1℃。IRRI對(duì)近26年的溫度升高與世界稻米產(chǎn)量的分析結(jié)果認(rèn)為，平均溫度升高1℃，世界稻米產(chǎn)量將降低10%。我國(guó)水稻種植主要是在長(zhǎng)江中下游及其以南的地區(qū)，這些地區(qū)的水稻抽穗開花期主要集中在7月下旬至8月上旬，而這段時(shí)間很容易遇上高溫?zé)岷?。水稻抽穗開花期遇到高溫?zé)岷?，?huì)使水稻結(jié)實(shí)率下降，產(chǎn)量大幅下降，嚴(yán)重地甚至顆粒無收。
2003年7、8月，長(zhǎng)江流域長(zhǎng)時(shí)間異常高溫，有些地區(qū)持續(xù)38℃以上高溫達(dá)到20天，對(duì)水稻生產(chǎn)產(chǎn)生了十分嚴(yán)重的后果，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，水稻熱害受災(zāi)面積達(dá)3.0×107hm2，損失稻谷達(dá)5.2×107t，造成經(jīng)濟(jì)損失近100億元。2006 年，川渝地區(qū)發(fā)生百年不遇的特大高溫干旱災(zāi)害，7～9月各地日最高氣溫超過35℃的日數(shù)在40～60d，導(dǎo)致當(dāng)年川渝地區(qū)水稻減產(chǎn)25%以上，局部甚至超過5成，給水稻生產(chǎn)造成了慘重的損失。2013年7～8月，我國(guó)南方種植的水稻也遭受到了較為嚴(yán)重的高溫?zé)岷Γ斐稍缰械靖邷乇剖?，空秕率增加，千粒重下降，?yán)重減產(chǎn)。高溫已經(jīng)成為水稻產(chǎn)量潛力發(fā)揮的主要限制因素，并隨全球溫室效應(yīng)的加劇影響在進(jìn)一步擴(kuò)大。
水稻可以分為秈稻和粳稻2個(gè)亞種，秈稻是由野生稻演變來的，耐熱、耐濕、耐強(qiáng)光等習(xí)性與野生稻相似，而粳稻是由秈稻在人們不斷向高緯度、高海拔地區(qū)引種的過程中不斷演變和人工選育而來的，耐熱、耐濕、耐強(qiáng)光的能力較差。由于我國(guó)夏季普遍高溫，粳稻比秈稻更易遭受高溫?zé)岷?，因此，開展粳稻耐熱育種研究具有重要意義。
研究發(fā)現(xiàn)，水稻生殖生長(zhǎng)階段對(duì)高溫脅迫的敏感程度高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段。水稻減數(shù)分裂和抽穗揚(yáng)花期時(shí)期，對(duì)溫度極為敏感，最適宜的溫度是25～30℃，30℃以上就會(huì)產(chǎn)生不利影響，當(dāng)平均溫度超過30℃，連續(xù)3d以上就會(huì)造成花粉的受精程度和花藥的生活力下降，以致花粉不能正常發(fā)育并最終導(dǎo)致花粉敗育，進(jìn)而影響穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率；水稻抽穗開花期對(duì)溫度特別敏感，也是受危害最為嚴(yán)重的時(shí)期，Satake等研究表明水稻抽穗開花期持續(xù)5d的35℃以上高溫，就會(huì)影響花粉管伸長(zhǎng)和正常散粉，導(dǎo)致不能受精而形成空、秕粒；灌漿期遇到高溫可以加快水稻灌漿速度，縮短灌漿時(shí)間，35℃以上高溫就會(huì)導(dǎo)致水稻灌漿速率明顯下降，子粒的充實(shí)度受到影響，使得產(chǎn)量和粒重都顯著降低。綜合而言，作為產(chǎn)量構(gòu)成因素中最為重要的結(jié)實(shí)率的下降是熱害最為敏感的指標(biāo)之一，可綜合反映水稻穎花開放、撒粉和受精的綜合受害程度，高溫下結(jié)實(shí)率的穩(wěn)定性是耐熱性的重要指標(biāo)。
利用品種的耐熱性開展水稻耐熱性育種是解決水稻高溫?zé)岷ψ罱?jīng)濟(jì)、有效的辦法。對(duì)不同水稻品種進(jìn)行耐熱性鑒定發(fā)現(xiàn)，品種間的耐熱性差異很大，部分品種在苗期就已死亡，大多數(shù)品種不能結(jié)實(shí)，只有少數(shù)幾個(gè)品種結(jié)實(shí)。耐熱性強(qiáng)的品種的劍葉光合速率高溫脅迫后下降幅度明顯較小，脅迫解除后恢復(fù)的程度也高。葉綠素含量、RUBPc活性及內(nèi)源多胺含量的變化趨勢(shì)與光合速率一致，這可能是水稻耐高溫逼熟的重要生理基礎(chǔ)。
水稻耐熱性只有在合適的高溫脅迫下，其耐熱性遺傳特性才能表現(xiàn)出來。目前，育種家在進(jìn)行耐熱性品種篩選時(shí)，大多采用大田多年多點(diǎn)鑒定的方法，將鑒定田安置于易發(fā)生高溫?zé)岷Φ牡貐^(qū)進(jìn)行，且當(dāng)培育出大量后代時(shí)，往往給予一定的高溫脅迫，然后根據(jù)耐熱性狀差異，再篩選這些后代的耐熱性。不同的育種家評(píng)價(jià)耐熱與非耐熱品種/家系的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，但是都是根據(jù)在高溫脅迫下，水稻株高、穗長(zhǎng)、粒重、結(jié)實(shí)率、產(chǎn)量損失等性狀進(jìn)行劃分的。由于大田鑒定容易受多種因素（施肥不均等栽培條件差異、水稻抽穗期差異等）的干擾，這些指標(biāo)往往需要多年多點(diǎn)的重復(fù)鑒定才能獲得相對(duì)可信的結(jié)果，因此，常規(guī)耐熱育種的周期都非常長(zhǎng)，一般都7、8年，甚至10年以上，而且需要耗費(fèi)大量的人力物力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有耐熱粳稻育種周期長(zhǎng)、育種成本高的缺陷，提供了一種通過選擇花培愈傷熱處理來進(jìn)行篩選，通過常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)、復(fù)蘇劑處理來保障愈傷的存活，從而顯著縮短了育種周期的耐熱粳稻育種新方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：
一種耐熱粳稻育種新方法，其特征在于：該育種新方法步驟如下：
1）分別選取耐熱粳稻品種/系和粳稻育種骨干品種/系作親本，雜交獲得F1，F(xiàn)1與母本回交獲得BCF1：選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良的粳稻育種骨干品種/系作為母本，選取耐熱粳稻品種/系作為父本，然后將父本和母本正季大田種植，抽穗后雜交，獲得F1，F(xiàn)1與母本回交獲得BCF1；
2）取BCF1花藥進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到花藥愈傷后進(jìn)行熱處理：將BCF1雜交種正季種植，選取健壯主穗花藥進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得花藥愈傷組織，待花藥愈傷組織普遍長(zhǎng)至直徑0.3～0.6cm后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)室溫度至35～36℃，持續(xù)5～7天；
3）挑選花藥愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)：挑選直徑為0.4～0.7cm的花藥愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)，溫度控制為25～27℃，時(shí)間控制為7～9天，再變換為熱處理，溫度控制為35～36℃，時(shí)間控制為3～4天，然后恢復(fù)至常溫分化培養(yǎng)，如此常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)3～4次至褐化愈傷組織部分超過一半；
4）將活性愈傷投入復(fù)蘇劑中浸泡，然后轉(zhuǎn)入新分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)：熱處理后愈傷組織部分褐化變黑，一些愈傷組織白化喪失活性，切下褐化和白化部分，將留下的活性愈傷投入濕熱滅菌過的復(fù)蘇劑中浸泡處理，然后將活性愈傷轉(zhuǎn)入新的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)；
5）愈傷組織誘導(dǎo)出苗后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中壯苗，煉苗后移栽入溫室：部分愈傷組織經(jīng)過熱處理、復(fù)蘇劑處理后存活下來，并分化出苗，待花培苗長(zhǎng)至2cm之后轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗，待花培苗長(zhǎng)至8cm后打開封口膜煉苗，10～15天后移栽入溫室；
6）花培苗單株收種獲得花培家系，進(jìn)一步農(nóng)藝性狀、耐熱篩選獲得耐熱粳稻新品系：溫室內(nèi)花培單株收種，獲得粳稻花培家系若干，正季將收獲的花培家系大田種植，以粳稻育種骨干品種/系親本為對(duì)照，篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且耐熱性得到改良的粳稻新品系。
所述步驟1）中耐熱粳稻品種/系的特點(diǎn)為：在大田栽培遭遇極端高溫天氣時(shí)，相比于普通水稻品種/系，株高、穗長(zhǎng)、粒重變化幅度較小，空殼率低，水稻產(chǎn)量損失程度低的水稻品種/系；粳稻育種骨干品種/系的特點(diǎn)為：產(chǎn)量高，米質(zhì)好，抗性優(yōu)良但不耐熱的粳稻品種/系。
所述步驟2）中進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體過程如下：
（2.1）取材與預(yù)處理：將選取的BCF1雜交種正季大田常規(guī)栽培，取葉枕距為5～7cm、穗與花藥呈淡黃綠色、花藥長(zhǎng)度為穎殼的1/3～1/2且孕穗不裂開的健壯主穗，保留2～3張葉片，75%酒精表面消毒，用濕紗布包裹后置于4℃冰箱中低溫預(yù)處理2～3天；
（2.2）接種：預(yù)處理后，將含主穗的稻苞剪下，然后將該稻苞浸泡于75%的酒精中表面消毒3～4min，接著將該稻苞轉(zhuǎn)移于超凈工作臺(tái)中剝離主穗，進(jìn)一步剝?nèi)⌒∷霝榇笮【鶆虻男≈Ч＃酉聛碛孟具^的紗布包裹小支梗，然后將紗布投入濃度為0.1%的升汞滅菌10min，無菌水漂洗3～4次，打開紗布晾干，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
所述步驟（2.2）中的花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+MS微量元素+MS有機(jī)質(zhì)+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝膠，pH值為5.8。
所述步驟2）中誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件控制為：溫度25～27℃，暗培養(yǎng)。
所述步驟3）常溫分化培養(yǎng)與熱處理的光照條件均為：光照強(qiáng)度為1000～1500Lux，光周期為14h光/10h暗。
所述步驟3）和4）中分化培養(yǎng)基配方為：MS無機(jī)鹽+MS有機(jī)物+蔗糖3%+瓊脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L，pH值為5.8。
所述步驟4）中活性愈傷特點(diǎn)為：結(jié)構(gòu)疏松、表面具球形顆粒、顏色淺而透明。
所述步驟4）中復(fù)蘇劑成分為：每升水含維生素C 0.3～0.4g、維生素E 0.6～0.8g、Na2-EDTA 0.8～1.0g、FeSO4?7H2O 0.5～0.7g、ZnSeO4·5H2O1.2～1.5g、MgSO4·7H2O 0.6～0.8g、植物硫化激動(dòng)素PSK-α 0.02～0.03μmol；所述復(fù)蘇劑浸泡處理的時(shí)間為6-8h。
所述步驟5）中繼代培養(yǎng)基配方為：1/2MS大量+MS微量+MS有機(jī)物+蔗糖3%+多效唑 0.2～0.3mg/L+瓊脂0.8%，pH值為5.8。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：
常規(guī)耐熱粳稻育種中待鑒定水稻材料只有發(fā)育到生殖生長(zhǎng)階段再通過熱處理后表型差異來鑒定水稻材料的耐熱性，由于鑒定表型易受多種因素的干擾，因此需要多年多點(diǎn)的重復(fù)才能獲得相對(duì)可信的結(jié)果，所以常規(guī)耐熱育種周期都非常長(zhǎng)，一般都7、8年，甚至10年以上，且需要耗費(fèi)大量的人力物力。本發(fā)明的耐熱粳稻育種新方法創(chuàng)造性的通過選擇花培愈傷熱處理來進(jìn)行篩選，通過花培愈傷熱處理篩選的方法不僅節(jié)約了大量的人力物力，而且鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確，鑒定周期更短，從而大大降低了育種成本。
水稻愈傷組織是一團(tuán)結(jié)構(gòu)疏松、表面具球形顆粒、顏色淺而透明的薄壁細(xì)胞團(tuán)，非常嬌嫩，通常置于高溫下會(huì)逐漸衰老褐化，喪失生長(zhǎng)活性。本發(fā)明通過常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)的方式，既實(shí)現(xiàn)了熱處理篩選的目的，又減弱了愈傷組織損傷，進(jìn)而通過復(fù)蘇劑浸泡處理來提高了愈傷組織的活性，保障了耐熱愈傷的存活率。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
一種耐熱粳稻育種新方法，該育種新方法步驟如下：
1）分別選取耐熱粳稻品種/系和粳稻育種骨干品種/系作親本，雜交獲得F1，F(xiàn)1與母本回交獲得BCF1：
選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良的粳稻育種骨干品種/系作為母本，粳稻育種骨干品種/系的特點(diǎn)為：產(chǎn)量高，米質(zhì)好，抗性優(yōu)良但不耐熱的粳稻品種/系；選取耐熱粳稻品種/系作為父本，耐熱粳稻品種/系是指在大田栽培遭遇極端高溫天氣時(shí)，相比于普通水稻品種/系，株高、穗長(zhǎng)、粒重變化幅度較小，空殼率低，水稻產(chǎn)量損失程度低的水稻品種/系；然后將父本和母本正季大田種植，抽穗后雜交，獲得F1，F(xiàn)1與母本回交獲得BCF1。
2）取BCF1花藥進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到花藥愈傷后進(jìn)行熱處理：
將BCF1雜交種正季種植，選取健壯主穗花藥進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體過程如下：
（2.1）取材與預(yù)處理：將選取的BCF1雜交種正季大田常規(guī)栽培，取葉枕距為5～7cm、穗與花藥呈淡黃綠色、花藥長(zhǎng)度為穎殼的1/3～1/2且孕穗不裂開的健壯主穗，保留2～3張葉片，75%酒精表面消毒，用濕紗布包裹后置于4℃冰箱中低溫預(yù)處理2～3天；
（2.2）接種：預(yù)處理后，將含主穗的稻苞剪下，然后將該稻苞浸泡于75%的酒精中表面消毒3～4min，接著將該稻苞轉(zhuǎn)移于超凈工作臺(tái)中剝離主穗，進(jìn)一步剝?nèi)⌒∷霝榇笮【鶆虻男≈Ч?，接下來用消毒過的紗布包裹小支梗，然后將紗布投入濃度為0.1%的升汞滅菌10min，無菌水漂洗3～4次，打開紗布晾干，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+MS微量元素+MS有機(jī)質(zhì)+2mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L水解蛋白+5%蔗糖+0.8%植物凝膠，pH值為5.8）；
花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件控制為：溫度25～27℃，暗培養(yǎng)；花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得花藥愈傷組織，待愈傷組織普遍長(zhǎng)至直徑0.3～0.6cm后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)室溫度至35～36℃，持續(xù)5～7天。
3）挑選花藥愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)：
挑選直徑為0.4～0.7cm的花藥愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（分化培養(yǎng)基配方為：MS無機(jī)鹽+MS有機(jī)物+蔗糖3%+瓊脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L，pH值為5.8），進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)，溫度控制為25～27℃，時(shí)間控制為7～9天，再變換為熱處理，溫度控制為35～36℃，時(shí)間控制為3～4天，然后恢復(fù)至常溫分化培養(yǎng)，如此常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)3～4次至褐化愈傷組織部分超過一半，常溫分化培養(yǎng)與熱處理的光照條件均為：光照強(qiáng)度為1000～1500Lux，光周期為14h光/10h暗。
4）將活性愈傷投入復(fù)蘇劑中浸泡，然后轉(zhuǎn)入新分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)：
熱處理后愈傷組織部分褐化變黑，一些愈傷組織白化喪失活性，切下褐化和白化部分，留下的活性愈傷結(jié)構(gòu)疏松、表面具球形顆粒、顏色淺而透明，將活性愈傷投入濕熱滅菌過的復(fù)蘇劑中浸泡處理（復(fù)蘇劑成分為：每升水含維生素C 0.3～0.4g、維生素E 0.6～0.8g、Na2-EDTA 0.8～1.0g、FeSO4?7H2O 0.5～0.7g、ZnSeO4·5H2O1.2～1.5g、MgSO4·7H2O 0.6～0.8g、植物硫化激動(dòng)素PSK-α 0.02～0.03μmol），浸泡處理的時(shí)間為6-8h；然后將活性愈傷轉(zhuǎn)入新的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)。
5）愈傷組織誘導(dǎo)出苗后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中壯苗，煉苗后移栽入溫室：
部分愈傷組織經(jīng)過熱處理、復(fù)蘇劑處理后存活下來，并分化出苗，待花培苗長(zhǎng)至2cm之后轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基（繼代培養(yǎng)基配方為：1/2MS大量+MS微量+MS有機(jī)物+蔗糖3%+多效唑 0.2～0.3mg/L+瓊脂0.8%，pH值為5.8）進(jìn)行壯苗，待花培苗長(zhǎng)至8cm后打開封口膜煉苗，10～15天后移栽入溫室。
6）花培苗單株收種獲得花培家系，進(jìn)一步農(nóng)藝性狀、耐熱篩選獲得耐熱粳稻新品系：
溫室內(nèi)花培單株收種，獲得粳稻花培家系若干，正季將收獲的花培家系大田種植，以粳稻育種骨干品種/系親本為對(duì)照，篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且耐熱性得到改良的粳稻新品系。
實(shí)施例
（1）分別篩選日本晴和自有品系S09-3作為耐熱粳稻品種/系和粳稻育種骨干品種/系：
育種主干品系S09-3具有產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、多抗（高抗條紋葉枯病、黑條矮縮病、紋枯病，中抗稻瘟病、稻曲病）的優(yōu)點(diǎn)，全生育期僅有148天左右，多年來一直用作中熟中粳的優(yōu)良育種主干親本，但S09-3不耐熱，2013年S09種植于江蘇東辛農(nóng)場(chǎng)，當(dāng)年7～8月遭受到了高溫?zé)岷?，造成S09-3高溫逼熟，空秕率達(dá)到54.2%，千粒重下降了14.4%，造成了較為嚴(yán)重的減產(chǎn)。日本晴是日本愛知縣農(nóng)試場(chǎng)于1957年將“山彥”與“幸風(fēng)”雜交選育6年育成的粳稻品種，其多穗稈強(qiáng)、米質(zhì)優(yōu)良、食味佳，作為粳稻品種，日本晴有極其優(yōu)良的耐熱性能，在高溫下保持較高的結(jié)實(shí)率。
2）親本雜交獲得F1，F(xiàn)1與母本回交獲得BCF1，取BCF1花藥進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到花藥愈傷后進(jìn)行熱處理：
2013年正季大田種植，抽穗后雜交，獲得F1，2014年初海南南繁，F(xiàn)1與母本回交獲得BCF1，2014年正季BCF1大田種植，8月20日選取健壯主穗花藥進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，25天后花藥開始陸續(xù)分化出愈傷組織，45天左右愈傷組織普遍長(zhǎng)大，一般直徑在0.3～0.6cm，此時(shí)將培養(yǎng)室溫度調(diào)節(jié)至35.5℃，進(jìn)行第一次熱處理，熱處理持續(xù)6天。
3）挑選花藥愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)：
一次熱處理后，愈傷組織表型并未出現(xiàn)明顯變化，此時(shí)挑選直徑為0.4～0.7cm的花藥愈傷組織，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（分化培養(yǎng)基配方為：MS無機(jī)鹽+MS有機(jī)物+蔗糖3%+瓊脂0.7%+KT2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+水解蛋白1g/L，pH值為5.8）。取20瓶分化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中，控制光照條件為：光照強(qiáng)度為1300Lux，光周期為14h光/10h暗；溫度26℃，時(shí)間控制為24天，然后進(jìn)行熱處理：溫度控制為35℃，時(shí)間控制為10.5天。其它的全部置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室光照條件為：光照強(qiáng)度為1300Lux，光周期為14h光/10h暗，先進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)，溫度控制為26℃，時(shí)間控制為8天，再變換為熱處理，溫度控制為35.5℃，時(shí)間控制為3.5天，然后恢復(fù)至常溫分化培養(yǎng)，如此常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)，1次循環(huán)后部分愈傷組織色澤開始變暗，愈傷組織邊緣出現(xiàn)褐紋，2次循環(huán)后部分愈傷組織褐化，褐化部位從邊緣迅速蔓延，3次循環(huán)后愈傷組織褐化程度顯著，按體積算，約半數(shù)愈傷組織發(fā)生褐化，極少數(shù)愈傷組織白化（約5%），此時(shí)停止熱處理。
4）將活性愈傷投入復(fù)蘇劑中浸泡，然后轉(zhuǎn)入新分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)：
將培養(yǎng)室培養(yǎng)的愈傷組織于超凈工作臺(tái)中切下褐化和白化部分，留下的活性愈傷結(jié)構(gòu)疏松、表面具球形顆粒、顏色淺而透明，將活性愈傷投入濕熱滅菌過的復(fù)蘇劑中浸泡處理（復(fù)蘇劑成分為：每升水含維生素C 0.35g、維生素E 0.7g、Na2-EDTA 0.9g、FeSO4?7H2O 0.6g、ZnSeO4·5H2O 1.35g、MgSO4·7H2O 0.7g、植物硫化激動(dòng)素PSK-α 0.025μmol），浸泡處理的時(shí)間為7h；然后將活性愈傷轉(zhuǎn)入新的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)分化培養(yǎng)。
為檢驗(yàn)不同處理方式對(duì)水稻愈傷組織分化效果的影響，同期進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，選擇培養(yǎng)室培養(yǎng)的相同或相近的愈傷組織進(jìn)行試驗(yàn)：第一組進(jìn)行復(fù)蘇劑浸泡處理試驗(yàn)，處理時(shí)間7h；第二組采用滅菌水浸泡處理，處理時(shí)間7h；第三組不進(jìn)行任何處理。第一組和第二組處理后轉(zhuǎn)入新分化培養(yǎng)基，第三組直接轉(zhuǎn)入新分化培養(yǎng)基。第四組采用人工氣候箱中培養(yǎng)的愈傷組織，相比于1、2、3組，第四組培養(yǎng)光照、光周期、熱處理溫度和總時(shí)間均相同，區(qū)別僅僅在于第四組進(jìn)行持續(xù)熱處理，而1、2、3組進(jìn)行常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)，熱處理完成后，第四組亦采用復(fù)蘇劑浸泡處理，方法同第一組。35天后愈傷組織分化成苗，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率，結(jié)果如下表1。
由表1試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)熱處理后的愈傷組織進(jìn)行復(fù)蘇劑浸泡處理可以顯著提高愈傷組織的活性，從而大大提高了愈傷組織分化率和綠苗比例，而滅菌水處理對(duì)愈傷組織分化沒有顯著效果。通過第一組與第四組比較可以發(fā)現(xiàn)，相較于持續(xù)熱處理，通過常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)的熱處理方式可以顯著減弱愈傷組織損傷，大大提高了愈傷組織分化率和綠苗比例，保障了耐熱愈傷的存活率。
5）愈傷組織誘導(dǎo)出苗后，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中壯苗，煉苗后移栽入溫室：
部分愈傷組織經(jīng)過熱處理、復(fù)蘇劑處理后存活下來，并分化出苗，待花培苗長(zhǎng)至2cm之后轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基（繼代培養(yǎng)基配方為：1/2MS大量+MS微量+MS有機(jī)物+蔗糖3%+多效唑 0.2～0.3mg/L+瓊脂0.8%，pH值為5.8）進(jìn)行壯苗，待花培苗長(zhǎng)至8cm后打開封口膜煉苗，13天后移栽入溫室。
6）花培苗單株收種獲得花培家系，進(jìn)一步農(nóng)藝性狀、耐熱篩選獲得耐熱粳稻新品系：
2015年8月上旬，溫室內(nèi)花培單株收種，獲得粳稻花培家系207個(gè)，正季將收獲的花培家系大田種植，以育種主干品系S09-3為對(duì)照，篩選獲得3個(gè)農(nóng)藝形狀良好且耐熱性得到改良的粳稻新品系，進(jìn)入后續(xù)的品比試驗(yàn)。
本發(fā)明的耐熱粳稻育種新方法通過選擇花培愈傷熱處理來進(jìn)行篩選，通過常溫分化培養(yǎng)～熱處理循環(huán)、復(fù)蘇劑處理來保障愈傷的存活，顯著縮短了耐熱粳稻育種周期，3年左右即可完成耐熱粳稻育種，具有較大的育種應(yīng)用價(jià)值。
以上實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動(dòng)，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。