本發(fā)明屬于通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生領(lǐng)域，具體地涉及一種桔梗葉片的快速誘芽及組培繁殖方法。

背景技術(shù)：

桔梗(Platycodon grandiflorus)，有祛痰、利咽、鎮(zhèn)咳、排膿、寬胸順氣之功效，其水提取液也具有抗癌作用。近年來，隨著其保健及醫(yī)療功能為人所熟知，其價格也不斷上漲，導(dǎo)致市場上桔梗供不應(yīng)求，因此，提高桔梗的種苗繁殖速度對滿足市場對桔梗種苗的需求有重要意義，也將會帶來巨大的經(jīng)濟效益。

目前，桔梗的繁殖方式主要有：種子繁殖、育苗移栽、扦插以及組織離體培養(yǎng)，其中又以種子繁殖為主要的繁殖方式。種子繁殖需要留種、選種、進行發(fā)芽實驗、播種、田間管理等步驟，而且播種時除種子本身需要浸種催芽，對田間的溫濕度也有較高要求，其出苗的時間也都在10-15天左右，生長周期為2-3年，而且種子的壽命一般只有1年，當(dāng)年的發(fā)芽率也只有70%左右，種子繁殖也容易導(dǎo)致品質(zhì)退化，因此采用種子繁殖的方法限制了桔梗生產(chǎn)的發(fā)展。而育苗移栽的方法，雖然周期只有一年但其步驟依然比較繁瑣，且對人工、氣溫、水分、土壤要求較高，不便操作，而且產(chǎn)量低于種子繁殖。桔梗也可以進行扦插繁殖，但其屬于宿根草本，喜歡低濕干燥的環(huán)境，采用扦插的方法易感染病蟲害，而且生根率低，導(dǎo)致成活率不高，因此生產(chǎn)上運用較少。

植物組織離體培養(yǎng)因不受外界環(huán)境條件影響，可利用少量材料短時間內(nèi)培養(yǎng)出大量無菌苗木，因此被廣泛運用于苗木的快速繁殖。在傳統(tǒng)的組培快繁技術(shù)中，其操作流程一般為：葉片、莖段等外植體→形成愈傷組織→愈傷組織繼代培養(yǎng)增殖→愈傷誘導(dǎo)成芽→誘導(dǎo)生根→馴化移栽成苗。目前，因為采用葉片進行組織培養(yǎng)叢生芽的誘導(dǎo)率不高，桔梗的組織離體培養(yǎng)主要采用幼嫩的莖段、莖尖進行快繁。然而莖段、莖尖的外植體數(shù)量遠(yuǎn)低于葉片的外植體數(shù)量，而且，以莖為外植體（如不含莖節(jié)）無法做到不經(jīng)愈傷直接誘導(dǎo)成芽，培養(yǎng)周期較長；如果是含有莖節(jié)的莖段則可以做到不經(jīng)愈傷直接誘導(dǎo)成芽，但繁殖系數(shù)較低，只有2倍。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種桔梗葉片的快速誘芽及組培繁殖方法，該發(fā)明以葉片切塊作為外植體直接進行芽的誘導(dǎo)分化，分化率達(dá)到98%以上，繁殖（增殖）系數(shù)達(dá)10.15倍，并且從葉片切塊到形成成熟芽只需要20天左右，大大減少了成芽周期。

一種桔梗葉片組培繁殖的快速誘芽方法，包括對桔梗種子處理并萌發(fā)培養(yǎng)獲得桔梗葉片的步驟，將所得桔梗葉片去柄切塊得葉片切塊的步驟，其特征在于：將葉片切塊作為外植體，轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，不經(jīng)愈傷組織的形成與增殖階段，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生分化芽；

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為pH= 5.8的MS培養(yǎng)基，向其中添加工作濃度分別為 1mg/L的 6-芐氨基嘌呤（6-BA）、0.1mg/L的萘乙酸（NAA）、6.5g/L的瓊脂粉和30g/L的蔗糖；

所述轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的條件為：溫度23 ± 2 ℃，光照時間12h/d，光照強度2000 lx。

進一步的，所述外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d即可產(chǎn)生分化芽。

進一步的，所述葉片切塊的大小為0.5cm × 0.5cm。

上述桔梗葉片組培繁殖的快速誘芽方法，還包括對桔梗種子處理并萌發(fā)培養(yǎng)獲得桔梗葉片的步驟，其操作方法為：將桔梗種子在赤霉素溶液中浸泡，再經(jīng)消毒劑消毒，接種到MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待種子萌發(fā)長出7-10片葉子時，獲取無菌試管苗，取其葉片。

進一步的，所述的赤霉素溶液的濃度為250 mg/L，浸泡時間為8h。

進一步的，所述的消毒劑消毒步驟為：先用75%酒精消毒10 s，然后用1.5 g/L HgCl2 消毒10-15 min。

利用所述誘芽方法進行桔梗葉片組培繁殖的方法，其特征在于：進行快速誘芽后，將所得的分化芽從基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-35天，獲得無菌桔梗苗，待條件成熟后即可進行移栽。

進一步的，所述的生根培養(yǎng)基為pH=5.8的1/2 MS培養(yǎng)基，向其中添加工作濃度分別為0.5 mg/L 的吲哚丁酸（IBA）、0.5 mg/L 的NAA、6.5 g/L的瓊脂粉和30 g/L。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明所述方法中所用外植體是將桔梗種子處理萌發(fā)至一定程度后取葉片并切塊，在此過程中，將種子首先在250 mg/L的高濃度赤霉素溶液（GA₃）中浸泡8h進行預(yù)處理，打破種子休眠，增加種子中游離型赤霉素的含量，促進發(fā)芽，同時使發(fā)芽產(chǎn)生的試管苗組織中的赤霉素含量高于一般水平，促進誘芽；之后消毒，防止霉菌污染影響試管苗生長活力，經(jīng)上述綜合處理，種子發(fā)芽率達(dá)95%以上，生長發(fā)育狀態(tài)良好，濃度與預(yù)處理時間的有效結(jié)合避免了蓮座狀生長或莖段徒長，待長至7-10片葉子時剪取葉片，此時試管苗生長趨于健壯，同時葉片細(xì)胞分裂能力較強，去柄切塊后作為外植體，來源豐富，殘存的赤霉素能繼續(xù)促進發(fā)芽，為外植體快速誘芽奠定基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明利用種子獲得的無菌試管苗葉片切塊為外植體，結(jié)合特定培養(yǎng)基與激素配比，所用發(fā)芽培養(yǎng)基為pH= 5.8的MS培養(yǎng)基，還包含1mg/L的6-BA、0.1mg/L 的NAA和30g/L的蔗糖，其中，6-BA的活性較高，能促進外植體內(nèi)物質(zhì)積累和細(xì)胞分裂，促進芽的形成，同時也可誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，加入的NAA進入到外植體內(nèi)，隨同營養(yǎng)流疏導(dǎo)到作用部位，特定的6-BA和NAA的激素含量配比，加之預(yù)處理中赤霉素的后續(xù)影響，可抑制愈傷的形成，加速芽的生成誘導(dǎo)，這樣就省去了愈傷組織形成和增殖兩個階段的培養(yǎng)時間，從葉片切塊到形成成熟芽（能夠用于生根的芽/苗）只需要20天左右，而通常通過葉片切塊長愈傷再由愈傷誘導(dǎo)成芽需要 35-50天，大大縮短了生長周期，且其葉片誘導(dǎo)芽的分化率達(dá)到98%以上，對科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)帶來了便利，節(jié)約成本。

3、對桔梗的組織培養(yǎng)來說，從試驗結(jié)果及研究文獻來看，以根為外植體還無法做到不經(jīng)愈傷直接誘導(dǎo)成芽；以莖為外植體（如不含莖節(jié)）也無法做到不經(jīng)愈傷直接誘導(dǎo)成芽；如果是含有莖節(jié)的莖段則可以做到不經(jīng)愈傷直接誘導(dǎo)成芽，但繁殖系數(shù)較低，只有2倍，而利用本發(fā)明方法，其繁殖系數(shù)可達(dá)10.15倍，高出約10%。所以，本發(fā)明所述方法繁殖系數(shù)高能夠得到大量桔梗苗，便于進行規(guī)?；a(chǎn)。

附圖說明

圖1是葉片切塊接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天時苗分化及長勢情況；

圖2是分化芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)35d的生根情況；

圖3是0.1mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA兩種生長調(diào)節(jié)劑組合對叢生芽的誘導(dǎo)情況。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明做進一步的解釋說明。

實施例1

培養(yǎng)基的配置：

MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基 + 瓊脂粉6.5 g/L + 蔗糖30 g/L，pH 5.8；

芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基 + 6-BA 1 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 瓊脂粉6.5 g/L + 蔗糖30 g/L，pH 5.8；

生根培養(yǎng)基組成為1/2 MS培養(yǎng)基 + 0.5 mg/L IBA + 0.5 mg/L NAA +瓊脂粉6.5 g/L + 蔗糖30 g/L，pH 5.8。

選取飽滿、健康的桔梗種子，在250 mg/L的赤霉素（GA3）溶液中浸泡8h，用無菌水沖洗后進行消毒，首先將桔梗種子置于75%酒精中處理10s，無菌水沖洗一次，之后于1.5 g/L的 HgCl₂ 溶液中浸泡10-15 min，用無菌水沖洗4-5次，達(dá)到消毒的目的。將經(jīng)消毒的種子置于無菌濾紙上，吸干表面水分，接種于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，以上步驟均在超凈工作臺上操作。然后將接種種子的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于組織培養(yǎng)間進行培養(yǎng)，組織培養(yǎng)間的條件設(shè)定為：溫度23±2℃、光照時間每天12 h和光照強度2000 lx。培養(yǎng)至種子萌發(fā)成苗，苗上葉子為7-10片時，獲得無菌試管苗。

在無菌條件下，取無菌試管苗的葉片，去柄，用手術(shù)刀將其切成約0.5 cm × 0.5 cm大小的切塊，將葉片切塊轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于組織培養(yǎng)間培養(yǎng)20d，葉片切塊邊沿分化產(chǎn)生叢生芽，在無菌條件下將叢生芽從其基部切下，分別轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)30-35d，獲得桔梗苗。之后即可進行常規(guī)煉苗與移栽。

試驗例1 桔梗常規(guī)組培方法

1、材料及處理

以桔梗種子為試材，首先將種子放入三角瓶中用自來水浸泡數(shù)小時，再用加有少量洗潔精的自來水浸泡10-15min，用自來水沖洗干凈；加入75%的酒精中消毒1min，用蒸餾水沖洗1-2次；將種子轉(zhuǎn)入滅菌的三角瓶中，加入0.1%升汞液浸泡殺菌10min，用無菌水沖洗5-6次；將經(jīng)消毒的種子放在無菌濾紙上，吸干表面水分，接種到MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，接種完成后將其置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，帶種子萌發(fā)長出3-5片葉子時，即可作為外植體。

2、培養(yǎng)程序

將培養(yǎng)好的無菌苗從培養(yǎng)容器中取出，將葉片剪成0.5-1cm的小塊，葉面朝上，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3周，即可見外植體表面形成很多愈傷組織。其中，愈傷組織培養(yǎng)基配方為：MS培養(yǎng)基 + 6-BA 0.8-1.5mg/L + IAA 0.3-0.7mg/L +蔗糖20g/L+瓊脂 5-7g/L，pH=5.8。

將帶有愈傷組織的外植體轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-4周，即可從愈傷組織上形成許多不定芽，又稱叢生芽。其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS培養(yǎng)基 + 6-BA 0.3-0.5mg/L，pH=5.8。將叢生芽從基部切下，置于同一培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可長成較大的無根試管苗。

將無根試管苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4周誘導(dǎo)其生根長成桔梗苗，隨后可移栽。其中，生根培養(yǎng)基配方為:1/2 MS培養(yǎng)基+ IAA 0.3-0.5mg/L + IBA 0.01-0.03mg/L + 蔗糖 20-25g/L + 瓊脂 5.5g/L，pH=5.8.

將實施例1與試驗例1進行綜合評價，首先采用實施例1方法可完成快速生芽，從葉片切塊到形成叢生芽（能夠用于生根的芽/苗）只需要20天左右，且叢生芽產(chǎn)量較多，而試驗例1方法通過葉片切塊長愈傷再由愈傷誘導(dǎo)成芽需要約 35-50天，只培養(yǎng)愈傷組織就需要21-28天，相比來說，實施例1方法加快了生芽，大大縮短了生長周期，節(jié)約成本。另外，如圖1，實施例1所得叢生芽在生根培養(yǎng)之前就有少量根發(fā)生分化，且叢生芽只有輕微玻璃化現(xiàn)象，而常規(guī)的試驗例1叢生芽無根分化，玻璃化現(xiàn)象可達(dá)50%，嚴(yán)重影響桔梗苗的產(chǎn)量。

相對于試驗例1，實施例1所得桔梗苗生長更為健壯，莖、葉和根均發(fā)育良好，如圖2，平均每株苗生根數(shù)為9條，平均根長為2.5cm，且根毛較發(fā)達(dá)。

試驗例2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對叢生芽的誘導(dǎo)影響分析

配置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，綜合考慮桔梗生長發(fā)育和組織培養(yǎng)需求，結(jié)合前期試驗結(jié)果，確定6-BA和NAA兩種生長調(diào)節(jié)劑的組合，針對組合中兩種成分的含量分別三個水平，如下表1所示。

表1：兩因素三水平設(shè)計

根據(jù)表1中6-BA和NAA的兩因素三水平，設(shè)計下表2中九個處理實驗，除培養(yǎng)基外，其他處理及培養(yǎng)條件與實施例1相同，最后對這九組試驗所得分化苗的增值系數(shù)和生長情況進行分析，其中，繁殖系數(shù)是指用一塊外植體平均能夠繁殖得到多少株芽（苗）。

表2：各處理及其分化生長情況

由表2可以看出，1mg/L濃度的6-BA最適合葉片分化，相比較而言0.1mg/L NAA優(yōu)于0.5mg/L和0.05mg/L NAA的組合。接種到含1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d的桔梗無菌苗葉片切塊的分化生長情況優(yōu)于其他組合，生長狀態(tài)良好，分化出大量叢生芽，其中玻璃化現(xiàn)象輕微且有少量根已分化，如圖1。其他生長調(diào)節(jié)劑組合下的分化情況均不太理想，以處理9為例，分化情況如圖3所示，僅有極少量叢生芽，且莖發(fā)育不夠健壯，均出現(xiàn)倒伏，雖有根分化，但增值系數(shù)相比較低。