本發(fā)明涉及植物組培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穿心蓮多倍體誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)：

穿心蓮為爵床科植物穿心蓮(andrographispaniculata(burm.f.)nees)的干燥地上部分，臨床用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、口舌生瘡等，其化學(xué)成分主要是穿心蓮內(nèi)酯類和黃酮類化合物。穿心蓮內(nèi)酯類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗感染、抗癌、抗腫瘤等作用，也是多種名優(yōu)中成藥產(chǎn)品(穿心蓮片、消炎利膽片等)的原料藥材。商品藥材主產(chǎn)廣東、福建，行銷全國(guó)。

穿心蓮植物主要以植物的營(yíng)養(yǎng)器官為收獲對(duì)象供藥用，為此非常適宜采用多倍體誘導(dǎo)的方法來(lái)提高產(chǎn)量和質(zhì)量。因?yàn)橹参锶旧w經(jīng)過(guò)加倍后，均表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)器官“巨大性”特征，也能很好地滿足以植物營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)為收獲對(duì)象的藥材生產(chǎn)要求，提高藥材產(chǎn)量。另外，由于植物細(xì)胞染色體加倍后，染色體上基因調(diào)控有效化學(xué)成分含量也較正常二倍體明顯增高，所以對(duì)穿心蓮藥用植物進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)對(duì)于提高有效成分的產(chǎn)量十分有利。

多倍體植物在形態(tài)特征、生理生化特性及產(chǎn)量、品質(zhì)等方面都有所變化，其中有一些優(yōu)良特性是二倍體所沒有的，因而被廣泛應(yīng)用于植物育種工作中。多倍體誘導(dǎo)方法早期研究主要采用原位誘導(dǎo)法，即把供試植物的種子、正在生長(zhǎng)的幼苗、莖尖等在非離體條件下用不同濃度的誘變劑處理，從而誘導(dǎo)染色體加倍。處理的方法有浸泡法、注射法、涂抹法及包埋法等。盡管這些方法都能獲得多倍體，但往往存在嵌合體幾率高的現(xiàn)象。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，離體培養(yǎng)加倍法開始盛行，從已有報(bào)道來(lái)看，該方法的主要途徑有兩條：一是在組織培養(yǎng)過(guò)程中，用秋水仙素水溶液直接處理培養(yǎng)材料；二是用含有秋水仙素的固體培養(yǎng)基將材料培養(yǎng)一段時(shí)間，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，再由變異細(xì)胞分化出完整植株。離體加倍培養(yǎng)法由于試驗(yàn)條件易于控制，變異植株受環(huán)境影響造成的回復(fù)突變現(xiàn)象減少，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)，在多倍體誘導(dǎo)中普遍采用。

然而，多倍體誘導(dǎo)中還存在一些亟待解決的問題：首先，秋水仙素雖然是目前使用最多，最為有效的化學(xué)誘導(dǎo)劑，但其價(jià)格較貴且有劇毒，對(duì)植物來(lái)說(shuō)它是人為增加的環(huán)境脅迫因素，在一定條件下可以使植物細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境發(fā)生改變，促使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ros無(wú)法正常消除而使細(xì)胞凋零。其次，經(jīng)誘變處理后并不是所有分生細(xì)胞的染色體數(shù)都同樣的加倍，有可能是某些細(xì)胞加倍了，而有的細(xì)胞沒加倍而導(dǎo)致出現(xiàn)嵌合體，嵌合體現(xiàn)象給多倍體育種帶來(lái)困難，使得真正同一倍性水平的多倍體頻率過(guò)低。

多倍體誘導(dǎo)中，誘導(dǎo)材料的選擇主要有：愈傷組織，不定芽，叢生芽，莖尖，種子，子葉和葉片，根部等。其中叢生芽是由植物器官和愈傷組織發(fā)育出來(lái)的群體叢生芽苗，大多是多細(xì)胞形成，雙極性，結(jié)構(gòu)完整，可直接形成小植株，成苗率高，是植物多倍體育苗較佳的材料。目前國(guó)內(nèi)沒有以穿心蓮叢生芽誘導(dǎo)多倍體育苗的相關(guān)報(bào)道。為此，以穿心蓮叢生芽為材料，通過(guò)改善誘導(dǎo)條件，降低秋水仙素的誘導(dǎo)濃度，減輕其對(duì)細(xì)胞的毒害作用，提高成活率，同時(shí)降低嵌合體發(fā)生率，為改良穿心蓮的遺傳育種工作提供實(shí)踐指導(dǎo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明通過(guò)選取特定的誘導(dǎo)材料、改進(jìn)誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，建立了一種誘導(dǎo)率高、嵌合體發(fā)生率低的穿心蓮多倍體的誘導(dǎo)方法。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種穿心蓮多倍體誘導(dǎo)方法，其包括以下步驟：

(1)無(wú)菌苗的培養(yǎng)：將普通穿心蓮二倍體種子用0.1％升汞消毒一次，浸泡3min；消毒后的種子用無(wú)菌蒸餾水沖洗4～5次；沖洗完的種子在無(wú)菌水中浸泡24h備用；將種子接種于初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天，獲得無(wú)菌苗；

(2)叢生芽的誘導(dǎo)：在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌苗的帶腋芽莖轉(zhuǎn)接到叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～45天，獲得叢生芽；

(3)秋水仙素和二甲基亞砜的處理：在無(wú)菌條件下，剪取0.5～1cm長(zhǎng)的叢生芽莖尖浸泡于含有100～2000mg·l^-1的秋水仙素和1％二甲基亞砜的溶液中，黑暗條件下振蕩12～72h；

(4)恢復(fù)培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將秋水仙素和二甲基亞砜處理后的叢生芽莖尖用無(wú)菌水洗干凈，接種于不添加任何激素的ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～14天后，再接種于叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～30天，獲得多倍體叢生芽；

(5)增殖培養(yǎng)：將多倍體叢生芽接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)20～25天；

(6)多倍體鑒定：取增殖培養(yǎng)后叢生芽的莖尖進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，在一個(gè)根尖上同時(shí)觀察到5個(gè)以上分裂相染色體數(shù)目加倍，即可確證該變異株系為多倍體；

(7)生根培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將鑒定為多倍體的株系從基部切下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15～25天，獲得生根苗；

(8)煉苗：取出生根苗，轉(zhuǎn)接到裝有蛭石、砂子和泥土的盆中，在室內(nèi)煉苗培養(yǎng)28～40天；

(9)移苗：煉苗后，將盆苗移到室外，遮上有70～85％遮陽(yáng)率的陰棚，培養(yǎng)8～12天后，移去陰棚，進(jìn)行栽培管理，即可。

優(yōu)選地，上述步驟(1)的初代培養(yǎng)基為：ms基本培養(yǎng)基+30～32g·l^-1蔗糖+2.0～3.0g·l^-1瓊脂。

優(yōu)選地，上述步驟(2)的叢生芽培養(yǎng)基為：ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5～1.0mg·l^-16-ba+30～32g·l^-1蔗糖+6.0～7.0g·l^-1瓊脂。

優(yōu)選地，上述步驟(5)的增殖培養(yǎng)基為：ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5～1.0mg·l^-1kt+0.1～0.3mg·l^-1naa+30～32g·l^-1蔗糖+6.0～7.0g·l^-1瓊脂。

優(yōu)選地，上述步驟(7)的生根培養(yǎng)基為：1/2ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.8～1.0mg·l^-1iba+30～32g·l^-1蔗糖+6.0～7.0g·l^-1瓊脂。

優(yōu)選地，上述步驟(1)無(wú)菌苗的培養(yǎng)條件為：溫度26～30℃、光照強(qiáng)度1000～1200lx、光照周期8～10h光照/14～16h黑暗。

步驟(2)叢生芽培養(yǎng)條件、步驟(5)增殖培養(yǎng)條件、步驟(7)生根培養(yǎng)條件、步驟(8)煉苗培養(yǎng)條件為：溫度25～28℃、光照強(qiáng)度1000～1200lx、光照周期10～12h光照/12～14h黑暗。

優(yōu)選地，上述步驟(8)中蛭石、砂子和泥土的體積比為1:(1～1.5):1。

本發(fā)明采用秋水仙素與二甲基亞砜為誘導(dǎo)劑，所述的二甲基亞砜通過(guò)提高分生組織的穿透力促進(jìn)秋水仙素快速浸透到植物組織中，提高誘導(dǎo)率，緩解因浸透不均勻產(chǎn)生嵌合體的現(xiàn)象，而且能降低秋水仙素的誘導(dǎo)濃度，減輕其對(duì)細(xì)胞的毒害作用，提高成活率。

本發(fā)明以不同的穿心蓮誘導(dǎo)材料，考察不同的誘導(dǎo)處理方法對(duì)多倍體產(chǎn)生的誘導(dǎo)率、成活率、嵌合體發(fā)生的影響。具體為采用棉花球莖尖覆蓋法分別對(duì)穿心蓮幼苗莖尖，成熟植株莖尖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，采用浸漬法后再生繁殖對(duì)穿心蓮愈傷組織和穿心蓮叢生芽進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟植株莖尖產(chǎn)生多倍體的誘導(dǎo)率最低，僅為6.45％，愈傷組織產(chǎn)生多倍體植株的存活率最低，僅為10.26％，其次為幼苗莖尖產(chǎn)生多倍體的誘導(dǎo)率為11.11％，植株的成活率為36.59％，而以叢生芽作為誘導(dǎo)材料，采用浸漬法后恢復(fù)及再生繁殖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，其誘導(dǎo)率和植株的成活率最高，分別為62.86％和79.05％，且嵌合體發(fā)生率最低，為2株嵌合體/檢測(cè)11株。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：

(1)本發(fā)明首次以穿心蓮腋芽組織再生的叢生芽為誘導(dǎo)材料，利用秋水仙素和二甲基亞砜浸漬法將叢生芽的莖尖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，再將誘導(dǎo)后的莖尖再分化得多倍體植株。本發(fā)明的誘導(dǎo)材料結(jié)合所采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，顯著提高了穿心蓮多倍體的誘導(dǎo)率，高達(dá)62.86％，成活率79.05％，以及降低了嵌合體的發(fā)生率。

(2)本發(fā)明獲得的穿心蓮四倍體葉面積、莖等都較二倍體巨大，有利于提高穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的產(chǎn)量，促進(jìn)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯品質(zhì)的改善，實(shí)現(xiàn)穿心蓮優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的，滿足人們對(duì)穿心蓮藥材及其相關(guān)產(chǎn)品的需求。

附圖說(shuō)明

圖1為穿心蓮二倍體和四倍體生長(zhǎng)圖，a:幼苗期穿心蓮二倍體(左)和穿心蓮四倍體(右)，b:成熟期穿心蓮四倍體(左)和穿心蓮二倍體(右)。

圖2為穿心蓮二倍體和四倍體植株氣孔圖，a:穿心蓮二倍體植株氣孔圖，b:穿心蓮四倍體植株氣孔圖。

圖3為穿心蓮二倍體和四倍體植株染色體圖，a:穿心蓮二倍體植株染色體圖(2n＝2x＝48)，b:穿心蓮四倍體植株染色體圖(2n＝4x＝96)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1穿心蓮多倍體的誘導(dǎo)

(1)無(wú)菌苗的培養(yǎng)：將普通穿心蓮二倍體種子用0.1％升汞消毒一次，浸泡3min；消毒后的種子用無(wú)菌蒸餾水沖洗4次；沖洗完的種子在無(wú)菌水中浸泡24h備用；將種子接種于ms+30g·l^-1蔗糖+2.5g·l^-1瓊脂的初代培養(yǎng)基中，在溫度28℃、光照強(qiáng)度1200lx、光照周期10h光照/14h黑暗的條件下培養(yǎng)25天，獲得無(wú)菌苗；

(2)叢生芽的誘導(dǎo)：在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌苗的帶腋芽莖轉(zhuǎn)接到ms+0.8mg·l^-16-ba+30g·l^-1蔗糖+6.5g·l^-1瓊脂的叢生芽培養(yǎng)基中，在溫度28℃、光照強(qiáng)度1200lx、光照周期12h光照/12h黑暗的條件下培養(yǎng)40天，獲得叢生芽；

(3)秋水仙素和二甲基亞砜的處理：在無(wú)菌條件下，剪取0.8cm長(zhǎng)的叢生芽莖尖浸泡于含有2000mg·l^-1的秋水仙素和1％二甲基亞砜的溶液中，黑暗條件下振蕩72h；

(4)恢復(fù)培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將秋水仙素和二甲基亞砜處理后的叢生芽莖尖用無(wú)菌水洗干凈，接種于不添加任何激素的ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，再接種于叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，獲得多倍體叢生芽；

(5)增殖培養(yǎng)：將多倍體叢生芽接種到ms+0.8mg·l^-1kt+0.2mg·l^-1naa+30g·l^-1蔗糖+6.5g·l^-1瓊脂的增殖培養(yǎng)基中，在溫度28℃、光照強(qiáng)度1200lx、光照周期12h光照/12h黑暗的條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)25天；

(6)多倍體鑒定：取增殖培養(yǎng)后叢生芽的莖尖進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，在一個(gè)根尖上同時(shí)觀察到5個(gè)以上分裂相染色體數(shù)目加倍，即可確證該變異株系為多倍體；

(7)生根培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將鑒定為多倍體的株系從基部切下，轉(zhuǎn)接到1/2ms+0.8mg·l^-1iba+30g·l^-1蔗糖+6.5g·l^-1瓊脂的生根培養(yǎng)基中，在溫度28℃、光照強(qiáng)度1200lx、光照周期12h光照/12h黑暗條件下培養(yǎng)20天，獲得生根苗；

(8)煉苗：取出生根苗，轉(zhuǎn)接到裝有體積比為1:1.5:1的蛭石、砂子和泥土的盆中，在室內(nèi)溫度28℃、光照強(qiáng)度1200lx、光照周期12h光照/12h黑暗的條件下煉苗培養(yǎng)35天；

(9)移苗：煉苗后，將盆苗移到室外，遮上有85％遮陽(yáng)率的陰棚，培養(yǎng)10天后，移去陰棚，進(jìn)行栽培管理，即可。

實(shí)施例2不同穿心蓮誘導(dǎo)材料的多倍體誘導(dǎo)效果比較

分別以棉花球莖尖覆蓋法對(duì)穿心蓮幼苗莖尖和成熟植株莖尖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，以浸漬法后再生繁殖對(duì)穿心蓮愈傷組織和穿心蓮叢生芽進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)進(jìn)行比較，從多倍體的誘導(dǎo)率、多倍體植株的存活率、嵌合體發(fā)生率三方面評(píng)價(jià)不同誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)不同穿心蓮材料產(chǎn)生多倍體的效果。

其中，棉花球莖尖覆蓋法具體為：在本研究前期已經(jīng)成功建立了穿心蓮再生體系的基礎(chǔ)上獲得無(wú)菌苗。將長(zhǎng)勢(shì)均勻的無(wú)菌苗煉苗后移栽到培養(yǎng)盤內(nèi)，分成5組，每組3棵。以含1％dmso的質(zhì)量濃度為0.1％的秋水仙素進(jìn)行處理。用脫脂棉蘸不同濃度藥液置于幼苗頂端，保持棉花濕潤(rùn)，處理36h。然后去掉藥棉，清水沖洗頂端3次。置于光下培養(yǎng)，30d后鑒定。

用棉花球莖尖覆蓋法誘導(dǎo)穿心蓮成熟植株莖尖產(chǎn)生多倍體的方法參考上述的步驟。

浸漬法后再生繁殖法具體為：把穿心蓮組織培養(yǎng)材料叢生芽置于不同濃度秋水仙素中浸泡12～72h，材料經(jīng)浸泡后用無(wú)菌水沖洗干凈，轉(zhuǎn)接到相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)生長(zhǎng)狀況不斷更換培養(yǎng)基，30d后觀察統(tǒng)計(jì)。轉(zhuǎn)接到1/2ms+1.0mg·l^-1iba+30g·l^-1蔗糖+6.5g·l^-1瓊脂的生根培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)至10cm左右時(shí)，煉苗、移栽30d后統(tǒng)計(jì)其變異率。

用浸漬法后再生繁殖法誘導(dǎo)穿心蓮愈傷組織產(chǎn)生多倍體的方法參考上述的步驟。

結(jié)果見下表所示。

表1不同穿心蓮誘導(dǎo)材料的多倍體誘導(dǎo)效果比較

結(jié)果顯示，成熟植株莖尖產(chǎn)生多倍體的誘導(dǎo)率最低，僅為6.45％，愈傷組織產(chǎn)生多倍體植株的存活率最低，僅為10.26％，其次為幼苗莖尖產(chǎn)生多倍體的誘導(dǎo)率為11.11％，植株的成活率為36.59％，而以叢生芽作為誘導(dǎo)材料，采用浸漬法后恢復(fù)及再生繁殖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，其誘導(dǎo)率和植株的成活率最高，分別為62.86％和79.05％，且嵌合體發(fā)生率最低，為2株嵌合體/檢測(cè)11株。表明采用本發(fā)明提供的穿心蓮誘導(dǎo)方法對(duì)叢生芽進(jìn)行多倍體，具有較佳的效果，誘導(dǎo)率最佳，多倍體植株成活率最高，且嵌合體發(fā)生率最低。

實(shí)施例3穿心蓮氣孔特征鑒定

取生長(zhǎng)6個(gè)月的普通植株5棵與每組處理變異苗每株隨機(jī)選取4片有代表性的葉撕取下表皮，測(cè)量保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度、葉綠體數(shù)。每片葉測(cè)量20個(gè)氣孔，計(jì)算平均值，統(tǒng)計(jì)氣孔密，結(jié)果見圖2和表2。

表2穿心蓮二倍體與四倍體氣孔器特征比較

注：與穿心蓮二倍體相應(yīng)的指標(biāo)比較，^*p<0.05，^**p<0.01。

由表2和圖2可知，與二倍體比較，四倍體的氣孔長(zhǎng)度和氣孔寬度均顯著大于二倍體(p<0.01或p<0.05)；四倍體的氣孔密度顯著小于二倍體(p<0.05)，表明本發(fā)明提供的多倍體誘導(dǎo)方法使穿心蓮的品種得到改良。

實(shí)施例4莖尖染色體鑒定方法

將穿心蓮莖尖以0.10％秋水仙素預(yù)處理2h，卡諾氏液固定24h，1.0mol/l鹽酸60℃下解離8min，蒸餾水后低滲15min，卡寶品紅染色25min，所得穿心蓮莖尖染色體制片效果較好，顯微鏡視野內(nèi)觀察到染色體較分散、著絲點(diǎn)較清晰的中期細(xì)胞，見圖3。

由圖3可知，穿心蓮二倍體植株染色體數(shù)目為2n＝2x＝48，經(jīng)誘導(dǎo)加倍后的四倍體植株染色體數(shù)目為原來(lái)二倍體植株的2倍，即2n＝4x＝96。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。