本發(fā)明涉及植物組培技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種澳洲堅(jiān)果組培擴(kuò)繁方法。

背景技術(shù)：

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia & Macadamia Tetraphylla）是山龍眼科（Proteaceae）常綠喬木，起源于澳大利亞東部的熱帶雨林中，目前的栽培品種主要是澳洲堅(jiān)果屬（Macadamia F.Muell）的光殼種（M.integrifolia）和粗殼種（M.tetraphylla）及二者的雜交種。澳洲堅(jiān)果果仁脂肪含量超過70％，單不飽和脂肪酸含量極高，棕櫚油酸的含量也異常豐富，且?guī)缀醪缓懝檀?。澳洲?jiān)果引入中國栽培僅有30 多年， 是一種新興果樹。目前在云南、廣東、廣西、貴州等熱區(qū)省均有種植，但云南是中國澳洲堅(jiān)果的主產(chǎn)區(qū)，其種植面積及產(chǎn)量均占全國90％以上。

澳洲堅(jiān)果一般采用實(shí)生繁殖，但實(shí)生樹可能要8~12年才能有收獲。此外，由于澳洲堅(jiān)果多采用開放式授粉，因此也造成異花授粉得到的果實(shí)的品質(zhì)難以預(yù)測。而在苗圃、果園生產(chǎn)上通常采用嫁接，偶見扦插。但在扦插繁殖中，根系系統(tǒng)需要較長的時(shí)間才可形成，同時(shí)扦插繁殖的樹種需要進(jìn)行輔助管理，如修剪、整形等。因此制約了澳洲堅(jiān)果的大面積推廣。

組織培養(yǎng)繁殖已應(yīng)用于許多林木、木本果樹和觀賞性作物的快速繁殖。同時(shí)，由于采用組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖可產(chǎn)生無污染的植物，可有效降低植物疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，因此，組織培養(yǎng)也提高了種質(zhì)交換的安全性。因此，開展澳洲堅(jiān)果組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，建立一套適合于澳洲堅(jiān)果的組織培養(yǎng)體系，對(duì)加快澳洲堅(jiān)果的良種繁育進(jìn)程具有重要意義。

目前對(duì)澳洲堅(jiān)果快速繁育的研究，多數(shù)基于砧木的嫁接技術(shù)，例如專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510322271.3，名稱為澳洲堅(jiān)果高效繁育方法的專利，公開了一種基于嫁接的快速繁育方法，采用生長激素為“每 10 克赤霉素 920 和吲哚乙酸的混合物兌 5 千克水溶解后，加入 10 毫升甲基托布津制成藥水”對(duì)接穗進(jìn)行浸泡。

專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510868889.X，名稱為澳洲堅(jiān)果的組織培養(yǎng)快速繁殖方法的專利，公開了一種澳洲堅(jiān)果的組培方法，雖公開了一種澳洲堅(jiān)果的組培方法，但其實(shí)施步驟B培養(yǎng)時(shí)間20-24天，步驟C分步驟培養(yǎng)20-24天后，每天光照18h培養(yǎng)直至生根，其公開的效果生長周期長，且生根率僅達(dá)到85.9%，增殖系數(shù)也不甚理想，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求；其次，權(quán)利要求1中所述的糞肥提取液成分復(fù)雜，有些成分難以獲得，難以應(yīng)用推廣；另外，該專利中構(gòu)建的特定培養(yǎng)床，實(shí)施時(shí)都會(huì)增加工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)的成本投入。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有的澳洲堅(jiān)果組培方法效果不佳的問題，本發(fā)明提出一種澳洲堅(jiān)果組培擴(kuò)繁方法。

本發(fā)明的澳洲堅(jiān)果組培擴(kuò)繁方法，其特征在于通過以下步驟實(shí)施：

（1）外植體的選擇與消毒：選取澳洲堅(jiān)果的當(dāng)年生嫩莖，去除葉柄和葉片，洗凈后用1%的潔爾滅消毒液浸泡5-10分鐘，沖洗1-2小時(shí)，剪成1-2cm長含1-2個(gè)葉腋的莖段，用75%乙醇潤后消毒，用0.1%升汞浸泡5-8分鐘，無菌蒸餾水沖洗5-8次，吸干外植體表面的殘留水分；

（2）啟動(dòng)培養(yǎng)：將莖段兩端分別切去2-4mm，葉腋朝上置于啟動(dòng)培養(yǎng)基上；所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基的配方為：1/2MS + 6-BA 0.5-2mg/L + IBA 0.5-1mg/L，30g/L蔗糖，4.6g/L瓊脂，pH為5.7-6.0；啟動(dòng)培養(yǎng)晝溫(25±3)℃、光照8-10h/天、光照度為2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間為4周；

（3）增殖培養(yǎng)：將莖段置于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2MS + GA 0.5-1.0mg/L，30g/L蔗糖，4.6g/L瓊脂，pH為5.7-6.0，增殖培養(yǎng)晝溫25±3℃、光照8-10h/天、光照度為2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間為3周；

（4）生根培養(yǎng)：將莖段置于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)基以1/4MS為基本培養(yǎng)基，添加1-5mg/L IBA，5-10g/L蔗糖，2g/L瓊脂，0.5% PEG, pH為5.7-6.0；生根培養(yǎng)晝溫(25±3)℃、光照8-10h/天、光照度為2000Lux，培養(yǎng)時(shí)間為培養(yǎng)3周。

采用本發(fā)明的擴(kuò)繁方法，啟動(dòng)培養(yǎng)階段腋芽生長快，增殖培養(yǎng)階段增殖系數(shù)高達(dá)6.7，生根培養(yǎng)階段生根率高達(dá)99%，明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明的澳洲堅(jiān)果組培擴(kuò)繁方法，通過生物技術(shù)對(duì)澳洲堅(jiān)果進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，建立一套完整的澳洲堅(jiān)果組織培養(yǎng)體系，大量提供無菌種苗，同時(shí)提高澳洲堅(jiān)果種苗質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，滿足了生產(chǎn)上的需要；本發(fā)明選用了1/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時(shí)添加IBA和PEG，只需3周時(shí)間即可獲得生根苗，且生根率可達(dá)99%。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：實(shí)施時(shí)間為2016年，澳洲堅(jiān)果的組培擴(kuò)繁在西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室和格林溫室進(jìn)行。該方法通過以下步驟實(shí)施：

（1）外植體的選擇與消毒：于2016年5月選取優(yōu)良澳洲堅(jiān)果單株，選取澳洲堅(jiān)果的當(dāng)年生嫩莖，去除葉柄和葉片，用肥皂水洗凈，再用1%的潔爾滅消毒液浸泡5分鐘，在線狀自來水下沖洗2小時(shí)，剪成2cm長含1-2個(gè)葉腋的莖段，放于滅過菌的外植體缸內(nèi)，移至超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒之前用75%乙醇潤洗一次，用0.1%升汞浸泡5分鐘，無菌蒸餾水沖洗5-8次，放于滅過菌的墊有濾紙的接種盤內(nèi)，使濾紙能夠吸干外植體表面的殘留水分。

（2）啟動(dòng)培養(yǎng)：將莖段兩端分別切去2-4mm，平放在啟動(dòng)培養(yǎng)基上，葉腋朝上，啟動(dòng)培養(yǎng)基的配方為：1/2MS + 6-BA 2mg/L + IBA 1mg/L，30g/L蔗糖，4.6g/L瓊脂，pH為5.7。置于晝培養(yǎng)環(huán)境為：培養(yǎng)溫度(25±3)℃、光照8~10h/天、光照度為2000Lux培養(yǎng)4周后，葉腋處長出腋芽。

（3）增殖培養(yǎng)：待腋芽發(fā)出時(shí)，將外植體轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2MS + GA 0.5mg/L，30g/L蔗糖，4.6g/L瓊脂，pH為5.7。置于晝溫25±3℃、光照8-10h/天、光照度為2000Lux培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)3周后，腋芽長出1-2cm高腋芽，增殖系數(shù)6.7。

（4）生根培養(yǎng)：以1/4MS為基本培養(yǎng)基，添加5mg/L IBA，5g/L蔗糖，2g/L瓊脂，0.5% PEG, pH為5.7。 置于晝培養(yǎng)環(huán)境為：培養(yǎng)溫度(25±3)℃、光照8-10h/天、光照度為2000Lux培養(yǎng)3周后，可見生根，生根率為99%。

為體現(xiàn)本方法的組培效果，對(duì)照實(shí)驗(yàn)引入不同生根培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方，對(duì)照組1未添加5mg/L IBA，對(duì)照組2未添加0.5% PEG，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：