本發(fā)明涉及一種楊樹不定芽染色體加倍的方法，尤其涉及一種通過肉眼觀察離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷發(fā)育狀態(tài)來判斷芽原基剛開始分化的時期，進而施加秋水仙堿誘導體細胞染色體加倍選育四倍體的方法，屬于細胞工程組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：多倍體在許多表型特征上通常不同于二倍體，比如植物的生長，細胞的大小，葉片的大小(StebbinsGLChromosomalEvolutioninHigherPlants.London:EdwardArnold1971；RamseyJUnreducedgametesandneopolyploidsinnaturalpopulationsofAchilleaborealis(Asteraceae).Heredity2007，98(3):143-150；AllarioT,BrumosJ,Colmenero-FloresJM,etal.LargechangesinanatomyandphysiologybetweendiploidRangpurlime(Citruslimonia)anditsautotetraploidarenotassociatedwithlargechangesinleafgeneexpression.Journalofexperimentalbotany2011，62(8):2507-2519)。染色體加倍是創(chuàng)造林木新品種的重要育種策略。一些三倍體楊樹在生長、木材品質(zhì)、生物量生產(chǎn)等方面均具有優(yōu)勢(WeisgerberH,RauHM,GartnerEJ,BaumeisterG,KohnertH,KarnerL25yearsofforesttreebreedinginHessen.AllgemeineForstzeitschrift1980，26:665–712；ZhuZ.T.,LinH.B.,KangX.Y.StudiesonallotriploidbreedingofPopulustomentosaB301clones.ScientiaSilvaeSinicae1995，31:499–505；ZhangS.,QiL.,ChenC.,LiX.,SongW.,ChenR.,HanS..AreportoftriploidPopulusofthesectionAigeiros.SilvaeGenetica2004，53:69–75；ZhangS.G.,ChenC.B.,HanS.Y.,LiX.L.,RenJ.Z.,ZhouY.Q.,SongW.Q.,ChenR.Y.,QiL.W.；ChromosomenumbersofsomePopulustaxafromChina.ActaPhytotaxonomicaSinica2005，43:539–544)。最直接獲得三倍體楊樹的途徑是四倍體和二倍體雜交，所以誘導獲得豐富的四倍體是楊樹三倍體育種的必要前提之一。四倍體可以通過施加有絲分裂抑制劑誘導體細胞染色體加倍來獲得(CaiX,KangXYInvitrotetraploidinductionfromleafexplantsofPopuluspseudo-simoniiKitag.PlantCellRep2011，30:1771–1778)。種子，莖尖，葉片，愈傷都可以用來誘導體細胞染色體加倍(K,S,KaczmarekZ.ImpactofcolchicineapplicationduringcallusinductionandshootregenerationonmicropropagationandpolyploidisationratesintwoMiscanthusspecies.InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant2010，46(2):161-171；ZhangQ,LuoF,LiuL,GuoFInvitroinductionoftetraploidsincrapemyrtle(LagerstroemiaindicaL.).PlantCellTissueandOrganCulture2010，101(1):41-47；TavanM,MirjaliliMH,KarimzadehGInvitropolyploidyinduction:changesinmorphological,anatomicalandphytochemicalcharacteristicsofThymuspersicus(Lamiaceae).PlantCellTissueandOrganCulture2015，122(3):573-583；XuC,HuangZ,LiaoT,etal.InvitrotetraploidplantsregenerationfromleafexplantsofmultiplegenotypesinPopulus.PlantCellTissueandOrganCulture,2015，1-9)。但是一個難點在于：四倍體誘導過程中的染色體加倍是單細胞事件，而施加秋水仙堿處理由多細胞組成的不定芽時，獲得的往往是二倍體和四倍體組織混生的嵌合體。由于離體葉片培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽是單細胞起源，所以當離體葉片不定芽發(fā)生過程中有葉芽原基細胞形成時，施加理化處理使其染色體加倍，可以避免嵌合體的產(chǎn)生。在楊樹中，蔡肖等首先將無菌苗葉片垂直于主脈一側(cè)剪出兩道傷口，分別接種含1.78μMBA和1.08μMNAA的培養(yǎng)基中，分別預(yù)培養(yǎng)0、6和12天后,放在秋水仙堿濃度分別為25、50和75μM的液體培養(yǎng)基(不含瓊脂)中，然后處理24、48和72h。隨后轉(zhuǎn)到不含秋水仙堿的固體MS培養(yǎng)基(含1.78μMBA和1.08μMNAA的培養(yǎng)基)上，得到了離體葉片預(yù)培養(yǎng)6天后，在含75μM秋水仙堿濃度的液體培養(yǎng)基中處理3天可獲得最高的四倍體得率的結(jié)論。(CaiX,KangXYInvitrotetraploidinductionfromleafexplantsofPopuluspseudo-simoniiKitag.PlantCellRep2011，30:1771–1778),該研究僅是針對單個基因型的青楊進行四倍體加倍，對于多基因型四倍體誘導并不能給出一般性的指導與建議。由于木本植物含有的基因數(shù)目極其龐大，因此當母本與父本雜交之后，所得到的子代中，每個子代所含的基因都是不同的，而每一個子代所有的基因加在一起就是一個基因型。即雜交后所獲得的種子，每粒種子的基因型均不相同，每粒種子就是一個特定基因型的種子。基因型不同的植株在誘導過程中，其誘變效果各不相同，差異顯著?，F(xiàn)有誘導染色體加倍通常是以離體葉片培養(yǎng)時間來大概確定施加誘導劑的作用時間，但是由于不同基因型達到適宜誘導加倍時期所需的預(yù)培養(yǎng)時間是不同的，若僅通過預(yù)培養(yǎng)時間來確定何時施加誘導劑，會導致對多基因型進行四倍體誘導時，四倍體得率降低或產(chǎn)生大量的嵌合體，不利于高效率獲得多基因型四倍體。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有楊樹體細胞染色體加倍誘導技術(shù)所存在的不足，提供一種誘導楊樹不定芽染色體加倍的方法，提高楊樹四倍體誘導率，本發(fā)明方法根據(jù)離體培養(yǎng)葉片愈傷發(fā)育狀態(tài)即時判別誘導楊樹四倍體的適宜時期，誘導楊樹體細胞加倍，增強施加誘導劑的時效性，獲得楊樹四倍體的比率顯著提高，同時減少嵌合體的產(chǎn)生，對其他植物四倍體誘導等也具有重要借鑒意義。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種誘導楊樹不定芽染色體加倍的方法，包括對外植體進行愈傷組織的分化培養(yǎng)后再對愈傷組織進行秋水仙堿誘導培養(yǎng)。其中，所述外植體選擇楊樹無菌苗葉片。特別是，所述外植體是將無菌苗葉片垂直于葉片主脈進行剪切并且剪切斷主脈而成的葉片塊。尤其是，所述葉片塊的尺寸大小為(0.5±0.1)cm×(1±0.1)cm，優(yōu)選為0.5cm×1cm。特別是，所述剪切后的葉片塊沿著葉片主脈高度方向的長度為(0.5±0.1)cm；垂直于主脈方向的長度為(1±0.1)cm。尤其是，所述剪切后的葉片塊沿著葉片主脈成軸對稱結(jié)構(gòu)。其中，所述無菌苗為楊樹雜交子代無菌苗，母本是哲引3號楊(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)，父本為北京楊(Populus×beijingensis)。其中，所述愈傷組織的分化培養(yǎng)是將外植體接種于葉片分化再生培養(yǎng)基中，進行愈傷組織分化培養(yǎng)，形成愈傷組織，其中所述葉片分化再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖3％+瓊脂0.6％+6-BA0.4mg/L+NAA0.05mg/L。特別是，愈傷組織分化培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1500-2000lux，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗，優(yōu)選為培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為2000lux，光照周期為14小時光照/10小時黑暗。其中，所述愈傷組織的秋水仙堿誘導培養(yǎng)是將愈傷組織轉(zhuǎn)入到液體分化再生培養(yǎng)基中，進行愈傷組織的秋水仙堿誘導培養(yǎng)，愈傷組織體細胞染色體加倍，其中所述液體分化再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙堿30-40mg/L，優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙堿30mg/L。特別是，所述愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，黑暗下培養(yǎng)2-4天，優(yōu)選為2-3天，進一步優(yōu)選為3天。本發(fā)明另一技術(shù)方案為：一種誘導楊樹不定芽染色體加倍的方法，包括如下順序進行的步驟：1)將楊樹無菌苗葉片剪切成無菌葉片塊；2)將葉片塊接種到葉片分化再生培養(yǎng)基中，進行愈傷組織分化培養(yǎng)，形成愈傷組織，在愈傷組織分化培養(yǎng)過程中，采用顯微鏡或放大鏡觀察離體外植體切口處愈傷組織的發(fā)育狀態(tài)；3)在顯微鏡或放大鏡觀察離體葉片塊切口處愈傷組織發(fā)育到第Ⅱ階段時，將進行了愈傷組織分化培養(yǎng)后的離體葉片接種于液體分化再生培養(yǎng)基中，進行愈傷組織的秋水仙堿誘導培養(yǎng)，其中所述液體分化再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙堿30-40mg/L；4)將秋水仙堿誘導培養(yǎng)2-4天后，將離體葉片取出并接種于不定芽再生培養(yǎng)基中，不定芽從葉片愈傷在中再生；5)將不定芽接種于生根培養(yǎng)基中，進行誘導生根培養(yǎng)，獲得楊樹再生植株。其中，步驟1)中所述無菌葉片塊是將無菌苗葉片垂直于葉片主脈進行剪切，并且剪斷主脈而成。特別是，所述葉片塊的尺寸大小為(0.5±0.1)cm×(1±0.1)cm，優(yōu)選為0.5cm×1cm。尤其是，所述剪切后的葉片塊沿著葉片主脈高度方向的長度為(0.5±0.1)cm；垂直于主脈方向的長度為(1±0.1)cm。特別是，所述剪切后的葉片塊沿著葉片主脈成軸對稱結(jié)構(gòu)。其中，步驟2)中所述葉片分化再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.6％瓊脂+0.4mg/L6-BA+0.05mg/LNAA。特別是，所述愈傷組織分化培養(yǎng)在以下條件下進行：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1500-2000lux，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗，優(yōu)選為培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為2000lux，光照周期為14小時光照/10小時黑暗。特別是，步驟2)中采用體視顯微鏡觀察離體外植體切口處愈傷組織的發(fā)育狀態(tài)。其中，步驟3)中所述液體分化再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙堿30-40mg/L，優(yōu)選為MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙堿30mg/L。特別是，所述愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)在以下條件下進行：培養(yǎng)溫度為25±2℃，黑暗下培養(yǎng)2-4天，優(yōu)選為2-3天，進一步優(yōu)選為3天。其中，步驟3)中所述愈傷組織發(fā)育階段Ⅱ是離體葉片在葉片分化再生培養(yǎng)基中進行愈傷組織分化培養(yǎng)過程中，離體葉片切口處形成的愈傷組織寬度>0mm，且≤1mm的階段。特別是，所述愈傷組織的寬度為沿著離體培養(yǎng)葉片橫切面的方向測量的寬度。尤其是，采用不銹鋼數(shù)顯卡尺(0-150mm)測定離體葉片上的愈傷組織寬度。特別是，步驟3)中采用體視顯微鏡觀察離體外植體切口處愈傷組織的發(fā)育狀態(tài)。其中，步驟4)中所述不定芽再生培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。特別是，所述不定芽再生培養(yǎng)在以下條件下進行：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1500-2000lux，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗，優(yōu)選為培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為2000lux，光照周期為14小時光照/10小時黑暗。尤其是，不定芽再生培養(yǎng)時間為40±2天。特別是，還包括步驟4A)將在液體分化培養(yǎng)基中進行愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)后的離體葉片先用無菌水清洗至少3次，再用無菌濾紙吸干離體葉片切口處愈傷組織表面的無菌水后，再接種于不定芽的再生培養(yǎng)基中，進行不定芽再生培養(yǎng)。其中，步驟5)中所述生根培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L。特別是，所述不定芽生根培養(yǎng)在以下條件下進行：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為1500-2000lux，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗，優(yōu)選為培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強度為2000lux，光照周期為14小時光照/10小時黑暗。特別是，將大于1cm的不定芽接種于生根培養(yǎng)基中，進行所述的誘導生根培養(yǎng)。觀察離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷組織發(fā)育狀況；當離體培養(yǎng)葉片切口處剛形成可見的愈傷組織(用OlympusSZX12體視顯微鏡觀察)，即愈傷組織寬度≤1mm，且>0mm(用不銹鋼數(shù)顯卡尺(0-150mm)沿著離體培養(yǎng)葉片橫切面的方向測量愈傷組織寬度，為施加秋水仙堿溶液處理誘導體細胞染色體加倍的有效時期。所述愈傷組織誘導培養(yǎng)處理：在離體培養(yǎng)葉片切口愈傷組織剛剛形成，即愈傷組織寬度>0mm且≤1mm時，把葉片轉(zhuǎn)移到添加了秋水仙堿液體分化再生培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+秋水仙堿30-40mg/L)中，浸泡2-4天。(實驗處理均在25-27℃的無菌操作間進行)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點具體如下：1、本發(fā)明對離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷發(fā)育狀態(tài)用體式顯微鏡或放大鏡進行觀察，并根據(jù)離體培養(yǎng)葉片愈傷發(fā)育狀態(tài)來判別芽原基開始分化的時期，并即時對這個階段的葉片愈傷組織進行誘導分化培養(yǎng)處理；楊樹四倍體植株的誘導效率高，幾乎不產(chǎn)生嵌合體。2、本發(fā)明通過對離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷組織的觀察，在離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷狀態(tài)是剛有透明的愈傷組織形成，且愈傷組織寬度小于1mm時，進行愈傷組織誘導分化培養(yǎng)，可顯著提高楊樹四倍體的誘導率。3、本發(fā)明克服了現(xiàn)有誘變加倍以外植體離體培養(yǎng)時間來確定施加誘導劑進行誘導分化的技術(shù)缺陷，根據(jù)體式顯微鏡或放大鏡的觀察，以離體培養(yǎng)過程中愈傷組織發(fā)育狀態(tài)為技術(shù)指標，指導施加誘導劑進行愈傷組織誘導分化培養(yǎng)的合適時機，不僅顯著提高楊樹四倍體的誘導率，而且還增強了施加誘導劑的時效性，同時減少嵌合體的產(chǎn)生，并且可以節(jié)約誘導試劑。4、本發(fā)明通過外植體離體培養(yǎng)的愈傷組織形態(tài)的變化來判別不同基因型體細胞染色體加倍處理的合適時期，提高了染色體加倍誘導處理時機的精確性，實現(xiàn)體細胞染色體加倍有效處理時期即時判別，對處于最適宜秋水仙堿誘導時期的愈傷組織外植體進行培養(yǎng)，這為提高四倍體誘導效果奠定基礎(chǔ)。5、本發(fā)明方法可以即時判斷外植體愈傷組織染色體誘導加倍的精確時機，建立高效誘導染色體加倍尤其是楊樹四倍體選育方法。從而使楊樹四倍體加倍的效率不會受到培養(yǎng)環(huán)境或基因型的影響，為進行楊樹多基因型四倍體誘導奠定了重要的方法基礎(chǔ)。6、對于楊樹四倍體的方法，最新的方法是通過離體葉片定量的預(yù)培養(yǎng)時間來尋求最佳的誘導時間，但是通過在定量預(yù)培養(yǎng)時間進行誘導，有些基因型獲得四倍體得率低且伴隨有嵌合體的產(chǎn)生，有些基因型甚至沒有四倍體的產(chǎn)生。這種方法不僅費錢，費時而且效果也不理想。所以用離體葉片定量的預(yù)培養(yǎng)時間來指導楊樹四倍體的誘導顯然不能滿足多基因型的大群體四倍體育種；另外，根據(jù)預(yù)培養(yǎng)時間進行誘導培養(yǎng)四倍體容易受到外界環(huán)境的影響(如培養(yǎng)的溫度，光照，培養(yǎng)基的成分)，不同基因型的誘導效果差異非常顯著，而本發(fā)明方法避免了誘導過程中外界環(huán)境的變化和基因型不同帶來的影響，適用于楊樹所有基因型的誘導加倍，只要在外植體愈傷組織發(fā)育的第Ⅱ階段進行誘導處理，四倍體誘導率高，無嵌合體產(chǎn)生。本發(fā)明方法實際是一種誘導楊樹不定芽染色體加倍的方法，明確以離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷組織發(fā)育狀態(tài)為指示，當切口處愈傷組織剛剛形成，且愈傷組織寬度小于1mm時，轉(zhuǎn)入到添加了秋水仙堿的液體分化培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)處理，可顯著提高楊樹四倍體的誘導率，增強施加誘導劑的時效性，同時減少嵌合體的產(chǎn)生，并且可以節(jié)約誘導試劑等。本發(fā)明方法可以即時判別誘導楊樹四倍體的合適時期，并實時進行誘導加倍處理，屬于細胞工程組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法通過對離體培養(yǎng)葉片的愈傷發(fā)育狀態(tài)的觀察，從而即時判別施加秋水仙堿溶液處理離體培養(yǎng)葉片誘導楊樹四倍體適宜時期，即當離體培養(yǎng)葉片切口處開始有愈傷形成，且愈傷組織寬度小于1mm時，即芽原基細胞開始分化，細胞排列疏松的時期施加秋水仙堿可有效進行體細胞染色體加倍，獲得四倍體植株的效率高。附圖說明圖1為楊樹離體培養(yǎng)葉片切口處愈傷組織達到階段Ⅱ時顯微鏡觀察圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1一、試驗材料1、本發(fā)明以北京楊(Populus×beijingensis)×哲引3號楊(P.pseudo-simonii×P.nigra‘Zheyin3#’)的雜交子代無菌苗為例，隨機選取15個基因型(分別命名為G1,G2,G3,G4,G5，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，E9，E10)無菌苗葉片為外植體建立不定芽誘導技術(shù)體系。2、植物生長調(diào)節(jié)劑本發(fā)明中所使用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)采用α-萘乙酸(NAA)，6-芐氨基嘌呤(6-BA)、吲哚-3-丁酸(IBA)。3、培養(yǎng)基的配制：(1)“MS基本培養(yǎng)基”的組成或配制方法；表1MS培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，1962)上述MS培養(yǎng)基母液配好后，儲存于4℃冰箱待用。根據(jù)配置培養(yǎng)基的數(shù)量，稱量所需瓊脂和蔗糖，將其倒入欲配培養(yǎng)基體積3/4的無菌水中，順序加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有機成分母液，每加入一種都充分攪拌，最后加水定容至培養(yǎng)基最終體積，用pH計測試培養(yǎng)基酸堿度，用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl將pH值調(diào)整至5.8-6.2。(2)葉片分化再生培養(yǎng)基(即固體MS分化培養(yǎng)基)：MS基本培養(yǎng)基添加NAA0.05mg/L、6-BA0.4mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，培養(yǎng)基在121℃下恒溫滅菌15分鐘。(3)液體分化再生培養(yǎng)基(即液體MS分化培養(yǎng)基)：MS基本培養(yǎng)基添加NAA0.05mg/L、6-BA0.4mg/L蔗糖30g/L、秋水仙堿30-40mg/L，調(diào)節(jié)pH值5.8-6.2。培養(yǎng)基在121℃下恒溫滅菌15分鐘。(4)不定芽再生培養(yǎng)基(固體MS再生培養(yǎng)基)：MS基本培養(yǎng)基添加NAA0.05mg/L、6-BA0.4mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，培養(yǎng)基在121℃下恒溫滅菌15分鐘。(5)生根培養(yǎng)基：1/2MS基本培養(yǎng)基添加IBA0.5mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，培養(yǎng)基在121℃下恒溫滅菌15分鐘。實施例2外植體愈傷組織觀察1、愈傷組織分化培養(yǎng)分別將5個基因型(G1,G2,G3,G4,G5)無菌苗葉片垂直于主脈剪切、并剪斷通過主脈，剪切后的葉片塊沿著主脈高度方向的長度為0.5cm，垂直于主脈方向的長度為1.0cm，且形成的葉片塊基本沿著葉片主脈成軸對稱結(jié)構(gòu)；將剪成0.5cm×1.0cm的葉片塊，接著將剪切后的葉片方塊分別平鋪到裝有50mL的固體MS分化培養(yǎng)基(3％蔗糖，0.6％瓊脂，0.4mg/L6-BA，0.05mg/LNAA)的培養(yǎng)皿(直徑為9cm)中，進行愈傷組織的分化培養(yǎng)；其中，分化培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。通常：為了使秋水仙堿溶液更好的浸入葉片，需要將葉片剪成尺寸為(0.5±0.1)cm×(1±0.1)cm的葉片塊，即葉片塊沿著主脈高度方向的長度為(0.5±0.1)cm；垂直于主脈方向的長度為(1±0.1)；通常優(yōu)選為0.5cm×1cm的塊狀；并且剪切成的葉片塊沿著葉片主脈基本成軸對稱結(jié)構(gòu)。每個處理分3個皿，共接種15個外植體，重復(fù)3次。2、愈傷組織的顯微鏡觀察在愈傷組織分化培養(yǎng)過程中將不同基因型的離體培養(yǎng)葉片塊分別置于體視顯微鏡(OlympusSZX12)下觀察，記錄五個基因型的離體培養(yǎng)葉片切口處的愈傷組織發(fā)育狀態(tài)以及離體培養(yǎng)葉片切口發(fā)育到不同階段所需要培養(yǎng)的時間。其中：離體培養(yǎng)葉片切口愈傷的形態(tài)以及對應(yīng)的細胞學發(fā)育特征如表2；離體培養(yǎng)葉片切口狀態(tài)發(fā)育到不同階段的時間如表3。離體培養(yǎng)葉片切口處的愈傷組織發(fā)育進程劃分為5個階段，分別為：階段Ⅰ：沒有愈傷形成；階段Ⅱ：切口邊緣出現(xiàn)少量的愈傷組織；階段Ⅲ：愈傷快速生長的階段，大量的愈傷組織形成；階段Ⅳ：愈傷組織緩慢生長，有微小的顆粒出現(xiàn)，階段V：愈傷組織的顏色變?yōu)榛疑谏厦嬗胁欢ㄑ啃纬?。?離體培養(yǎng)葉片切口愈傷的形態(tài)以及對應(yīng)的細胞學發(fā)育特點本發(fā)明將離體葉片切口處從沒有愈傷到開始形成愈傷組織再到再生出不定芽的這一過程，按愈傷組織的發(fā)育狀態(tài)劃分成五個階段并對這五個階段進行細胞學觀察，這能夠準備對五個階段進行準確的判別，如表2。表3五個基因型的離體培養(yǎng)葉片切口狀態(tài)發(fā)育到不同階段的時間(天)記錄基因型階段Ⅰ(天)階段Ⅱ(天)階段Ⅲ(天)階段Ⅳ(天)階段Ⅴ(天)E1-G10-23-3.54.5-68-1013.5-15E1-G20-45-5.56-710.5-1216-19E1-G30-55.5-6.56.5-89-1120-23E1-G40-78-99-10.513-15.526-28E1-G50-33.5-45.5-78-915-183、愈傷組織固定、石蠟制片及顯微鏡觀察對5個基因型離體葉片的每個階段的葉片愈傷組織的形態(tài)學特征用體視顯微鏡(OlympusSZX12)來拍攝記錄，并將分別處于如表1所述的5個發(fā)育階段的離體葉片分別置于4℃的FAA固定液(5mL38％甲醛+5mL冰醋酸+90mL50％乙醇)中固定24h；接著按常規(guī)石蠟制片，切片厚8um，切片用鐵礬-蘇木精染色；然后將各個階段的愈傷組織切片均在OlympusBX-51顯微鏡下觀察并拍攝。從五個階段的愈傷組織切片中，可以觀察到芽原基形成及發(fā)育的過程。表明離體培養(yǎng)葉片切口愈傷組織的發(fā)育狀態(tài)與芽原基的發(fā)育進程存在密切的關(guān)系(表1)。采用本領(lǐng)域人員所習知或熟悉的技術(shù)進行所的常規(guī)石蠟切片。離體葉片固定，石蠟切片等方法或技術(shù)均為本領(lǐng)域人員所習知或熟悉的常規(guī)技術(shù)。采用FAA固定的目的和作用：迅速殺死離體培養(yǎng)葉片切口處的愈傷組織，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)盡可能保持在接近生活時的狀態(tài)，能顯示其原來的細微結(jié)構(gòu)。本發(fā)明對愈傷組織進行FAA固定處理：及對離體培養(yǎng)葉片切口處的5個不同發(fā)育階段的愈傷組織進行固定后，能分析不同愈傷形態(tài)對應(yīng)的細胞學發(fā)育特點，明確了離體葉片施加秋水仙堿處理誘導體細胞染色體加倍的有效時期以及這個時期的具體細胞學特征。實施例3外植體愈傷組織誘導1、愈傷組織培養(yǎng)分別將5個基因型(G1,G2,G3,G4,G5)無菌苗葉片垂直于主脈剪切并且剪斷主脈，剪切后的葉片塊沿著主脈高度方向的長度為0.5cm，垂直于主脈方向的長度為1.0cm，且形成的葉片塊基本沿著葉片主脈成軸對稱結(jié)構(gòu)；將葉片剪成0.5cm×1.0cm的葉片塊，接著將剪切后的葉片塊平鋪到裝有50mL的葉片分化再生培養(yǎng)基(即固體MS分化培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，0.6％瓊脂，0.4mg/L6-BA，0.05mg/LNAA)的培養(yǎng)皿(直徑為9cm)中，進行愈傷組織的分化培養(yǎng)；其中，分化培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。每個處理分3個皿，共接種15個外植體，重復(fù)3次。2、愈傷組織秋水仙堿誘導處理在愈傷組織分化培養(yǎng)過程中將5種不同基因型的離體培養(yǎng)葉片塊分別置于體視顯微鏡(OlympusSZX12)下觀察(即每個基因型有3個培養(yǎng)皿，每個皿放5片離體葉片塊，在預(yù)培養(yǎng)的過程中，將密封好的培養(yǎng)皿放置在體式顯微鏡觀察臺上觀察離體葉片塊切口處愈傷發(fā)育狀態(tài))，并用不銹鋼數(shù)顯卡尺(0-150mm)沿著離體培養(yǎng)葉片橫切面的方向進行測量愈傷組織的寬度，將5種基因型離體葉片的分別處于5種愈傷組織發(fā)育狀態(tài)的離體培養(yǎng)葉片分別置于液體分化再生培養(yǎng)基(即液體MS分化培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升，秋水仙堿30mg/L)中，進行秋水仙堿處理，即進行愈傷組織的秋水仙堿誘導培養(yǎng)，即將5個基因型的分別處于5種愈傷組織發(fā)育狀態(tài)的離體培養(yǎng)葉片分別浸泡于添加了30mg/L秋水仙堿的液體MS分化培養(yǎng)基(3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，在黑暗條件下浸泡3天，進行愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)，其中愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，黑暗處理3天。3、不定芽再生培養(yǎng)將誘導培養(yǎng)后的離體葉片從液體分化再生培養(yǎng)基中取出，先用無菌水清洗外植體3次，再用無菌濾紙吸干外植體表面的液體；接著將其轉(zhuǎn)入不含秋水仙堿的固體MS再生培養(yǎng)基(即不定芽再生培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，0.6％瓊脂，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，進行不定芽的再生培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。經(jīng)過40±2天培養(yǎng)后，不定芽從葉片愈傷中再生。每個處理分3個皿，共接種15個外植體，重復(fù)3次。4、生根培養(yǎng)選取單個大于1厘米的不定芽芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％瓊脂+IBA0.5mg/L)中，進行誘導生根培養(yǎng)，誘導生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。誘導生根培養(yǎng)30天之后，獲得楊樹再生植株。5、倍性分析、染色體倍數(shù)確認采用流式細胞儀分析再生植株的倍性，然后用根尖壓片顯微鏡觀察確定染色體的數(shù)目，具體操作步驟如下：5-1)流式細胞儀分析再生植株倍性5-1A)將誘導生根培養(yǎng)獲得的再生植株在無菌操作臺里剪取長度大于1cm的組培苗頂端，只留頂端兩片葉子其余全部剪掉后，接種于新的生根培養(yǎng)基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％瓊脂+IBA0.5mg/L)中再次誘導生根。再生植株剩余部分剪成大于1cm的帶單芽莖段，接種于葉片分化再生培養(yǎng)基中，繼續(xù)分化形成的不定芽，將第4次繼代苗培養(yǎng)到30天時，剪取頂端的第2、3片幼嫩葉作為檢測材料，葉片被鋒利的刀片垂直切割成2mm×2mm小塊后，加入1mL裂解液(45mMMgCl2·6H2O，20mMMOPS,30mM檸檬酸鈉，0.1％TritonX-100；pH7.0)，用40um孔徑的塑料濾網(wǎng)過濾，向收集到的濾液中加入80uL濃度為5ug/mL的DAPI溶液后使用流式細胞儀【Ploidyanalyser(Patec)】進行檢測。5-1B)以二倍體雜種子代苗上的幼葉作為調(diào)節(jié)流式細胞儀的標樣，即將二倍體雜種子代苗上的幼葉垂直切割成2mm×2mm小塊后加入裂解液，過濾，向濾液中加入5ug/mL的DAPI溶液，然后使用流式細胞儀進行檢測，通過調(diào)節(jié)上樣電壓和光電倍增管靈敏度調(diào)節(jié)標樣出峰的位置，峰值設(shè)為50。再生植株用流式細胞儀上樣檢測后，若峰值為50，則為二倍體；峰值為100，則為四倍體；若為雙峰，峰值分別為50，100，則為嵌合體；5-2)根尖壓片法計數(shù)根尖細胞染色體數(shù)目5-2A)將分析植株倍性后的二倍體雜種子代苗的根尖在質(zhì)量分數(shù)0.2％的秋水仙素溶液中處理3h，接著用蒸餾水洗3次后置于卡諾固定液于4℃下(無水乙醇：醋酸＝3:1)固定24h，然后取出根尖置于1N鹽酸溶液中，于60℃下解離10min后用蒸餾水中清洗10min；最后用解剖刀切取根尖0.5mm左右的分生區(qū)組織，用鑷子夾取放置在干凈的載玻片上，滴入改良苯酚染色，并使根尖細胞在載玻片上充分的散開后用OlympusBX51顯微鏡觀察并拍照，記錄根尖細胞染色體數(shù)量。5-2B)將步驟5-1A)中分析植株倍性為四倍體后的再生植株的葉片接種于生根培養(yǎng)基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％瓊脂+IBA0.5mg/L)中，繼續(xù)培養(yǎng)，取7-10天的根尖，將其在質(zhì)量分數(shù)0.2％的秋水仙素溶液中處理3h，接著用蒸餾水洗3次后置于卡諾固定液于4℃下(無水乙醇：醋酸＝3:1)固定24h，然后取出根尖置于1N鹽酸溶液中，于60℃下解離10min后用蒸餾水中清洗10min；最后用解剖刀切取根尖0.5mm左右的分生區(qū)組織，用鑷子夾取放置在干凈的載玻片上，滴入改良苯酚染色，并使根尖細胞在載玻片上充分的散開后用OlympusBX51顯微鏡觀察并拍照，記錄根尖細胞染色體數(shù)量。顯微鏡觀察根尖染色體數(shù)目與流式細胞儀倍性分析完全一致，根尖壓片法計數(shù)染色體數(shù)目為2n＝4x＝76。四倍體及嵌合體的數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果如表4。表4不同切口愈傷發(fā)育階段施加秋水仙堿對五種基因型雜種子代的四倍體和嵌合體誘導率注明：五種基因型的楊樹雜種子代在愈傷發(fā)育階段I，Ⅳ，Ⅴ施加秋水仙堿時四倍體以及嵌合體得率均為0。從表4的實驗結(jié)果可知：施加秋水仙堿處理的最佳時期為愈傷發(fā)育階段Ⅱ(愈傷組織的寬度≤1mm，且>0mm)，即切口處分化為一團活躍分裂的細胞，細胞排列疏松，細胞核清晰可見的時期。當離體培養(yǎng)葉片切口處開始形成可見的少量愈傷組織(愈傷組織的寬度≤1mm，且>0mm時，如圖1)，即芽原基細胞開始分化，細胞排列疏松，細胞核清晰可見的時期為最佳處理時期，也就是在愈傷組織發(fā)育到第Ⅱ階段時，將葉片浸泡在施加30-40mg/L的秋水仙堿的液體分化培養(yǎng)基中，浸泡2-4天，可取的較好的四倍體誘導效果。關(guān)于愈傷組織寬度：用不銹鋼數(shù)顯卡尺(0-150mm)沿著離體培養(yǎng)葉片橫切面的方向測量愈傷組織寬度，當愈傷組織的寬度≤1mm，且>0mm時，是施加秋水仙堿溶誘導體細胞染色體加倍的有效時期。在進行離體培養(yǎng)葉片體細胞染色體加倍時，需要考慮染色體加倍的處理時機。由于基因型不同也是產(chǎn)生愈傷發(fā)育狀態(tài)不同步性的重要原因，不同基因型的青楊雜種子代無菌苗獲得的染色體加倍最佳處理條件并不相同。本發(fā)明中在5個基因型的青楊雜種離體培養(yǎng)葉片愈傷組織發(fā)育狀態(tài)與四倍體誘導效果關(guān)系研究中，發(fā)現(xiàn)無論是何種基因型，當離體培養(yǎng)葉片愈傷狀態(tài)發(fā)育至階段II時，即切口開始有愈傷形成，且愈傷組織寬度小于1mm時，最適合對離體培養(yǎng)葉片進行體細胞染色體加倍誘導四倍體。愈傷組織發(fā)育狀態(tài)過早或過晚于該時期進行染色體加倍處理，均難以獲得較好的四倍體誘導效果，甚至難以獲得四倍體。本發(fā)明方法確定了楊樹四倍體誘導時期的即時判別，誘導楊樹不定芽染色體加倍，有效解決以往體細胞染色體加倍容易產(chǎn)生混倍體的問題，提高四倍體誘導效率和效果，而且可以降低染色體加倍處理的工作量，對于楊樹乃至類似植物多倍體育種具有重要的參考價值。實施例4外植體愈傷組織誘導除了步驟2)愈傷組織秋水仙堿誘導處理步驟中，5個基因型的分別處于5種愈傷組織發(fā)育狀態(tài)的離體培養(yǎng)葉片分別浸泡于添加了40mg/L秋水仙堿的液體MS分化培養(yǎng)基(3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，在黑暗條件下浸泡2天，進行愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)，即將5種基因型離體葉片的分別處于5種愈傷組織發(fā)育狀態(tài)的離體培養(yǎng)葉片分別置于液體分化再生培養(yǎng)基(即液體MS分化培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升，秋水仙堿40mg/L)中，進行秋水仙堿處理，即進行愈傷組織的秋水仙堿誘導培養(yǎng)2天之外，其余與實施例3相同。采用流式細胞儀分析再生植株的倍性；采用根尖壓片法確認再生植株根尖細胞染色體數(shù)目，二者分析結(jié)果完全一致，四倍體及嵌合體的數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果如表5。表5不同切口愈傷發(fā)育階段施加秋水仙堿對五種基因型雜種子代的四倍體和嵌合體誘導率注明：五種基因型的楊樹雜種子代在愈傷發(fā)育階段I，Ⅳ，Ⅴ施加秋水仙堿時四倍體以及嵌合體得率均為0。表5的實驗結(jié)果與表4的實驗結(jié)果相一致。施加秋水仙堿處理的最佳時期為愈傷發(fā)育階段Ⅱ(愈傷組織的寬度≤1mm，且>0mm)，即切口處分化為一團活躍分裂的細胞，細胞排列疏松，細胞核清晰可見的時期。當離體培養(yǎng)葉片切口處開始形成可見的少量愈傷組織(愈傷組織的寬度≤1mm，且>0mm時，如圖1)，即芽原基細胞開始分化，細胞排列疏松，細胞核清晰可見的時期為最佳處理時期，也就是在愈傷組織發(fā)育到第Ⅱ階段時，將葉片浸泡在施加30-40mg/L的秋水仙堿的液體分化培養(yǎng)基中，浸泡2-4天，可取的較好的四倍體誘導效果。實施例5外植體愈傷組織誘導1、愈傷組織培養(yǎng)分別將10個基因型(E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10)無菌苗葉片垂直于主脈剪切并且剪斷主脈，剪切后的葉片塊沿著主脈高度方向的長度為0.5cm，垂直于主脈方向的長度為1.0cm，且形成的葉片塊基本沿著葉片主脈成軸對稱結(jié)構(gòu)；將葉片剪成尺寸約為0.5cm×1.0cm的葉片塊后，將剪切后的葉片塊分別平鋪到裝有50mL的固體MS分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，0.6％瓊脂，0.4mg/LBA，0.05mg/LNAA)的培養(yǎng)皿(直徑為9cm)中，進行愈傷組織的分化培養(yǎng)；其中，分化培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。每個處理分3個皿，共接種15個外植體，重復(fù)3次。2、愈傷組織的秋水仙堿誘導處理在體視顯微鏡觀察指導下，顯微鏡下觀察到10個基因型外植體的葉片切口處愈傷組織發(fā)育至階段II時(即離體培養(yǎng)葉片橫切面方向愈傷組織寬度>0mm，且≤1mm時)，將葉片上愈傷組織發(fā)育至階段II時的離體培養(yǎng)葉片分別接種至液體分化再生培養(yǎng)基(即液體MS分化培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升，秋水仙堿30mg/L)中，即將離體培養(yǎng)葉片浸泡于添加了30mg/L秋水仙堿的愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基(即液體MS分化培養(yǎng)基)中，進行愈傷組織的秋水仙堿誘導培養(yǎng)，其中誘導培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，黑暗處理3天。本發(fā)明愈傷組織秋水仙堿誘導培養(yǎng)時間除了黑暗條件下浸泡3天之外，浸泡2-4天也適用于本發(fā)明。3、不定芽再生培養(yǎng)取出秋水仙堿誘導培養(yǎng)3天后的離體葉片，先用無菌水清洗外植體3次，再用無菌濾紙吸干離體葉片愈傷組織表面的液體；然后將其轉(zhuǎn)入不含秋水仙堿的固體MS再生培養(yǎng)基(即不定芽再生培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基，3％蔗糖，0.6％瓊脂，BA0.4毫克/升,NAA0.05毫克/升)中，也就是將吸干表面液體的外植體接種與不定芽再生培養(yǎng)基中，進行不定芽的再生培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。經(jīng)過40±2天培養(yǎng)后，不定芽從葉片愈傷中再生。4、生根培養(yǎng)選取單個大于1厘米的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+3％蔗糖，0.6％瓊脂+IBA0.5mg/L)中，進行誘導生根培養(yǎng)，誘導生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照為2000lx，光照周期為14h光/10h暗。誘導生根培養(yǎng)30天之后，獲得楊樹再生植株。5、倍性分析、染色體倍數(shù)確認參照實施例3步驟5中的操作步驟、操作條件，采用流式細胞儀分析再生植株的倍性，然后采用顯微鏡下根尖壓片法來確定染色體的數(shù)目。對四倍體及嵌合體的數(shù)量進行統(tǒng)計，四倍體植株的根尖染色體數(shù)目與流式細胞儀倍性分析的四倍體再生植株完全一致，實驗結(jié)果如表4。表4十個基因型楊樹雜種子代在離體葉片切口處愈傷發(fā)育至第二階段施加秋水仙堿誘導處理的結(jié)果由表4的統(tǒng)計結(jié)果可知：10個基因型雜交子代的葉片在階段Ⅱ施加秋水仙堿處理，再生植株四倍體誘導率高，均獲得了四倍體且沒有嵌合體的產(chǎn)生。當前第1頁1 2 3