本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法。
背景技術(shù):
南非伯利恒之星(Ornithogalum Sauderside)是一種原產(chǎn)南非的多年生球根花卉,花卉市場上俗稱天鵝絨。因其花莖細長堅硬,花期持久,花瓣白色、造型高雅而被廣泛用于各種慶典、節(jié)日的花藝作品,倍受消費者的喜愛。自2007年由云南芊卉、聯(lián)合、采辰三家花卉企業(yè)引入少量種子及鱗莖試種獲得成功后,由于具有栽培簡單、成本低、見效快、效益顯著等優(yōu)點,近幾年來一直在云南省元江縣進行鱗莖的擴繁和切花種植。目前,云南斗南花卉市場12月到翌年5月份的南非伯利恒之星切花幾乎全為云南省元江縣生產(chǎn),單支切花售價高達3~6元,效益高達3萬元/畝。
南非伯利恒之星屬百合科植物,主要依靠種球進行擴大繁殖,其種球的生產(chǎn)方式有花后養(yǎng)球、小鱗莖繁殖、鱗片扦插、播種及組織培養(yǎng)等。目前,國內(nèi)南非伯利恒之星切花生產(chǎn)大多使用花后鱗莖分生種球進行擴繁,然而,因其種球在種植中極易腐爛,成活率低,僅為70%左右,且種子繁殖生產(chǎn)周期長,種子繁殖周期大多需要8個月左右,造成種球生產(chǎn)成本高,市場風(fēng)險大,嚴重影響了切花生產(chǎn)的效益。2014年李云生等對南非伯利恒之星鱗片扦插快繁技術(shù)進行研究,使繁殖系數(shù)有一定程度提高,達到了原先的3.5倍左右,但其繁殖周期相對較長,需要一年左右,且對鱗片的選擇及扦插管理的要求較嚴。
植物組織培養(yǎng)既是改良品種、培育新品種的一種手段,又是快速繁殖良種,以獲得大量優(yōu)質(zhì)苗木的一種有效方法。用該技術(shù)能夠解決很多用傳統(tǒng)方法難以解決的問題,更多、更好、更快地培育出各種農(nóng)業(yè)作物和園藝植物的新品種、新類型、新種質(zhì)和足量優(yōu)質(zhì)苗木。據(jù)此,能否建立一種植物組織培養(yǎng)技術(shù),用于大量繁殖南非伯利恒之星,解決其種球種植中易腐爛、種子繁殖周期長、繁殖系數(shù)較低的問題,成為云南省大面積開發(fā)種植南非伯利恒之星亟待解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的就是為了解決上述技術(shù)問題,而提供一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,解決其繁殖系數(shù)低、繁殖周期長,無法短時間內(nèi)獲得足量優(yōu)質(zhì)的南非伯利恒之星種苗的問題,為其種植戶提供足量優(yōu)質(zhì)的苗木,增加其生產(chǎn)效益,為云南省大規(guī)模推廣種植南非伯利恒之星奠定堅實基礎(chǔ)。
為了達到上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
1)滅菌處理:選取南非伯利恒之星健康、飽滿的鱗莖,挑選出內(nèi)部干凈、完整的鱗片,對鱗片進行滅菌處理;
2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)步驟1)處理過的鱗片切成2~3cm×3~4cm的小方塊,然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,光照條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)40~45天,獲得不定芽;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、激動素0.4~0.8mg/L、萘乙酸0.2~0.6mg/L、6-芐氨基腺嘌呤1.0~2.0mg/L、白砂糖20~30g/L和瓊脂5~7g/L;
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟2)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得不定芽離體后接種于增殖培養(yǎng)基上,光照條件下進行增殖培養(yǎng)45~50天;所述增殖培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.3~0.8mg/L、6-芐氨基腺嘌呤1.0~2.0mg/L、白砂糖30~35g/L和瓊脂5~7g/L;
4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟3)增殖培養(yǎng)所得高度為3.0~5.0cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中,光照條件下進行生根培養(yǎng)45~50天,獲得南非伯利恒之星種苗;所述生根培養(yǎng)基組成為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.5~1.0mg/L、吲哚乙酸0.2~0.8mg/L、白砂糖10~15g/L、瓊脂5~7g/L和活性炭0.5~1.0g/L。
本發(fā)明提供的南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,是以其鱗片為外植體,通過外殖體的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過程、不定芽的增殖過程和不定芽的生根過程,不定芽的增殖系數(shù)高達8倍以上,在短時間內(nèi)可獲得大量的南非伯利恒之星種苗,且種苗的生根率高達95%以上、移栽成活率高達97.5%,生產(chǎn)成本低,經(jīng)濟效益顯著。
本發(fā)明根據(jù)南非伯利恒之星不定芽生長的特性,制備出了適合其生長的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基,本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可促使外植體短時間內(nèi)誘導(dǎo)生出不定芽,不定芽在增殖培養(yǎng)基中經(jīng)離體增殖培養(yǎng)后,獲得了大量長勢極好、生長健壯的不定芽,不定芽生長整齊,抽生的葉片較長、葉片均為嫩綠色。
本發(fā)明還配制出了適合南非伯利恒之星不定芽生根的生根培養(yǎng)基,將增殖獲得的高度為3.0~5.0cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上,只需培養(yǎng)15~20天,大部分的不定芽基部均會出現(xiàn)愈傷,愈傷表面已有不定根生成,待繼續(xù)培養(yǎng)至45~50天左右時,不定芽上生成了較多量的不定根。
本發(fā)明選擇高度為3.0~5.0cm的不定芽進行生根培養(yǎng),是因為研究者發(fā)現(xiàn)只有在該高度范圍內(nèi)的不定芽誘導(dǎo)生根后得到的種苗質(zhì)量較好,移栽后容易成活,且生產(chǎn)成本低。而高度低于3.0cm的不定芽誘導(dǎo)得到的種苗質(zhì)量較差,不定根較短,細弱,移栽后成活率極低;高度大于5.0cm的不定芽誘導(dǎo)生根得到的種苗質(zhì)量較好,但培養(yǎng)出高于5.0cm的不定芽所需周期很長,不利于節(jié)約成本。
進一步的是,上述方法中所述步驟1)滅菌處理的操作為:將鱗片洗凈后再用質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇處理30秒以上,無菌水沖洗掉乙醇,再用質(zhì)量分數(shù)為0.1~0.15%的氯化汞水溶液滅菌處理10~20min,然后用無菌水沖洗5~6次。
鱗片的滅菌必須徹底,否則在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中很容易污染,嚴重影響不定芽的誘導(dǎo)。本發(fā)明的滅菌處理方法使得鱗片的滅菌完全,在誘導(dǎo)培養(yǎng)時鱗片上獲得的不定芽數(shù)量多。
進一步的是,所述步驟2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為26~27℃,該培養(yǎng)溫度下最適合外植體鱗片經(jīng)誘導(dǎo)后生出不定芽。
進一步的是,所述步驟2)中光照條件為:光照時長10h·d-1,光照強度800~1000lx,該光照條件能夠充分滿足誘導(dǎo)培養(yǎng)時的光照需求,適合不定芽的生成。
進一步的是,所述步驟3)中增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為26~27℃,該培養(yǎng)溫度范圍下最適合不定芽進行增殖。
進一步的是,所述步驟3)中光照條件為:光照時長10h·d-1,光照強度800~1000lx,選取的光照條件能夠滿足不定芽增殖時的能量需求,適合不定芽進行大量增殖。
進一步的是,所述步驟4)中生根培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為26~27℃,所選溫度下不定芽的生根狀況達到最佳。
進一步的是,所述步驟4)中光照條件為:光照時長10h·d-1,光照強度500~800lx,該光照條件適合對不定芽進行生根培養(yǎng),能夠生成大量新根。
進一步的是,所述步驟4)中還包括對高度為3.0~5.0cm的不定芽進行切除葉片和莖后,再接種至增殖培養(yǎng)基上,其目的是可以常年進行培苗,通過不斷增殖和生根,從而獲得大量的可再生循環(huán)的伯利恒之星種苗,且不會影響種苗的質(zhì)量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果在于:
(1)提供了一種南非伯利恒之星的離體培養(yǎng)方法,以鱗片為外植體,通過組織培養(yǎng)的方法,可在130~145天內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)的種苗,解決種球極易腐爛、繁殖周期長的問題;
(2)本方法整個培育過程可在人工化恒定環(huán)境中完成,不受季節(jié)和天氣的影響,可常年培育種苗;
(3)本發(fā)明的培養(yǎng)方法繁殖系數(shù)高達8.32倍、生根率高達95%以上,種苗移栽成活率高達97.5%,且生產(chǎn)成本低,經(jīng)濟效益顯著,可大面積推廣種植。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例1中獲得的不定芽示意圖;
圖2為本發(fā)明實施例1中獲得的南非伯利恒之星種苗示意圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白,以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行具體描述,有必要指出的是,以下實施例僅僅用于對本發(fā)明進行解釋和說明,并不用于限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整,仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
1)鱗片的預(yù)處理:于晴天到云南省南非伯利恒之星種苗基地采回其鱗莖,選取健康、飽滿的鱗莖,剖去表面腐爛干枯的鱗片,挑選出內(nèi)部干凈、完整的鱗片,將鱗片放入滴加1滴洗滌劑的水中浸泡3min,用清水沖洗10min,再用純凈水沖洗2次,再轉(zhuǎn)入超凈工作臺上用質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇處理30秒,無菌水沖洗掉乙醇,再用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的氯化汞水溶液滅菌處理20min,滅菌過程中可用鑷子反復(fù)攪動鱗片,使其徹底滅菌,然后用無菌水沖洗5次;
2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)步驟1)處理過的鱗片切成2cm×3cm的小方塊,然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,光照條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)40天,培養(yǎng)溫度為26℃,光照時長10h·d-1,光照強度800lx,獲得不定芽(如圖1所示);所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、激動素0.4mg/L、萘乙酸0.2mg/L、6-芐氨基腺嘌呤1.0mg/L、白砂糖20g/L和瓊脂5g/L;
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟2)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得不定芽離體后接種于增殖培養(yǎng)基上,光照條件下進行增殖培養(yǎng)45天,培養(yǎng)溫度為26℃,光照時長10h·d-1,光照強度800lx;所述增殖培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.3mg/L、6-芐氨基腺嘌呤1.0mg/L、白砂糖30g/L和瓊脂5g/L;
4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟3)增殖培養(yǎng)所得高度為3.0cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中,光照條件下進行生根培養(yǎng)45天,培養(yǎng)溫度為26℃,光照時長10h·d-1,光照強度500lx,獲得南非伯利恒之星種苗(如圖2所示);所述生根培養(yǎng)基組成為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.5mg/L、吲哚乙酸0.2mg/L、白砂糖10g/L、瓊脂5g/L和活性炭0.5g/L。
實驗過程中統(tǒng)計步驟3)中的不定芽增殖數(shù)量,并觀察增殖芽的生長情況,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)45天后,不定芽增殖系數(shù)達到8.32倍,不定芽生長整齊,抽生的葉片較長、嫩綠,長勢很好。
進一步統(tǒng)計步驟4)中不定芽的生根情況,發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)45天后,生根率達95%,且不定根粗壯,平均不定根數(shù)為4條。
將步驟4)所得種苗進行煉苗15天后將其移栽,待移栽苗成活后統(tǒng)計其成活率為96%,無變異植株出現(xiàn)。
實施例2
一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
1)鱗片的預(yù)處理:選取南非伯利恒之星健康、飽滿的鱗莖,挑選出內(nèi)部干凈、完整的鱗片,將鱗片洗凈后用質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇處理45秒,無菌水沖洗掉乙醇,再用質(zhì)量分數(shù)為0.15%的氯化汞水溶液滅菌處理10min,然后用無菌水沖洗6次;
2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)步驟1)處理過的鱗片切成2cm×4cm的小方塊,然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,光照條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)45天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度1000lx,獲得不定芽;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、激動素0.8mg/L、萘乙酸0.6mg/L、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖30g/L和瓊脂7g/L;
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟2)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得不定芽離體后接種于增殖培養(yǎng)基上,光照條件下進行增殖培養(yǎng)50天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度1000lx;所述增殖培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.8mg/L、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖35g/L和瓊脂7g/L;
4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟3)增殖培養(yǎng)所得高度為5.0cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中,光照條件下進行生根培養(yǎng)50天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度800lx,獲得南非伯利恒之星種苗;所述生根培養(yǎng)基組成為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸1.0mg/L、吲哚乙酸0.8mg/L、白砂糖15g/L、瓊脂7g/L和活性炭1.0g/L。
實驗過程中統(tǒng)計步驟3)中的不定芽增殖數(shù)量,并觀察增殖芽的生長情況,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)50天后,不定芽增殖系數(shù)達到8.36倍,不定芽生長整齊,抽生的葉片較長、嫩綠,長勢很好。
進一步統(tǒng)計步驟4)中不定芽的生根情況,發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)50天后,生根率達96%,且不定根粗壯,平均不定根數(shù)為5條。
將步驟4)所得種苗進行煉苗15天后將其移栽,待移栽苗成活后統(tǒng)計其成活率為96.3%,無變異植株出現(xiàn)。
實施例3
一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
1)鱗片的預(yù)處理:選取南非伯利恒之星健康、飽滿的鱗莖,挑選出內(nèi)部干凈、完整的鱗片,將鱗片放入滴加2滴洗滌劑的水中浸泡4min,用清水洗凈后再用質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇處理60秒,無菌水沖洗掉乙醇,再用質(zhì)量分數(shù)為0.15%的氯化汞水溶液滅菌處理15min,然后用無菌水沖洗6次;
2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)步驟1)處理過的鱗片切成3cm×4cm的小方塊,然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,光照條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)42天,培養(yǎng)溫度為26℃,光照時長10h·d-1,光照強度900lx,獲得不定芽;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、激動素0.6mg/L、萘乙酸0.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤1.4mg/L、白砂糖25g/L和瓊脂6g/L;
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟2)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得不定芽離體后接種于增殖培養(yǎng)基上,光照條件下進行增殖培養(yǎng)48天,培養(yǎng)溫度為26℃,光照時長10h·d-1,光照強度900lx;所述增殖培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤1.5mg/L和白砂糖32g/L、瓊脂6g/L;
4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟3)增殖培養(yǎng)所得高度為4.0cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中,光照條件下進行生根培養(yǎng)46天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度700lx,獲得南非伯利恒之星種苗;所述生根培養(yǎng)基組成為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.8mg/L、吲哚乙酸0.6mg/L、白砂糖12g/L、瓊脂6g/L和活性炭0.8g/L。
實驗過程中統(tǒng)計步驟3)中的不定芽增殖數(shù)量,并觀察增殖芽的生長情況,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)48天后,不定芽增殖系數(shù)達到8.27倍,不定芽生長整齊,抽生的葉片較長、嫩綠,長勢很好。
進一步統(tǒng)計步驟4)中不定芽的生根情況,發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)46天后,生根率達96.1%,且不定根粗壯,平均不定根數(shù)為4條。
將步驟4)所得種苗進行煉苗20天后將其移栽,待移栽苗成活后統(tǒng)計其成活率為97.1%,無變異植株出現(xiàn)。
實施例4
一種南非伯利恒之星離體培養(yǎng)方法,包括以下步驟:
1)鱗片的預(yù)處理:選取南非伯利恒之星健康、飽滿的鱗莖,挑選出內(nèi)部干凈、完整的鱗片,將鱗片洗凈后再用質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇處理30秒,無菌水沖洗掉乙醇,再用質(zhì)量分數(shù)為0.12%的氯化汞水溶液滅菌處理15min,然后用無菌水沖洗5次;
2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將經(jīng)步驟1)處理過的鱗片切成3cm×3cm的小方塊,然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,光照條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)40天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度1000lx,獲得不定芽;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、激動素0.5mg/L、萘乙酸0.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖20g/L和瓊脂5g/L;
3)增殖培養(yǎng):將經(jīng)步驟2)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得不定芽離體后接種于增殖培養(yǎng)基上,光照條件下進行增殖培養(yǎng)45天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度1000lx;所述增殖培養(yǎng)基組成為:MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.6mg/L、6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L、白砂糖30g/L和瓊脂6g/L;
4)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟3)增殖培養(yǎng)所得高度為3.0~5.0cm的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中,光照條件下進行生根培養(yǎng)45天,培養(yǎng)溫度為27℃,光照時長10h·d-1,光照強度800lx,獲得南非伯利恒之星種苗;所述生根培養(yǎng)基組成為:1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸0.6mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L、白砂糖10g/L、瓊脂7g/L和活性炭1.0g/L;其中將一部分高度為3.0~5.0cm范圍內(nèi)的不定芽進行切除葉片和莖后,再接種至增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。
實驗過程中統(tǒng)計步驟3)中的不定芽增殖數(shù)量,并觀察增殖芽的生長情況,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)45天后,不定芽增殖系數(shù)達到8.28倍,不定芽生長整齊,抽生的葉片較長、嫩綠,長勢很好。
進一步統(tǒng)計步驟4)中不定芽的生根情況,發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)45天后,生根率達95.3%,且不定根粗壯,平均不定根數(shù)為5條。
將步驟4)所得種苗進行煉苗20天后將其移栽,待移栽苗成活后統(tǒng)計其成活率為97.5%,無變異植株出現(xiàn)。
對比實施例1
參照實施例1的方法,除步驟1)中不經(jīng)氯化汞滅菌之外,其余步驟與實施例1一致,統(tǒng)計步驟3)中的不定芽增殖數(shù)量,并觀察增殖芽的生長情況,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)45天后,不定芽增殖系數(shù)為4.01倍,不定芽生長不整齊,抽生的葉片較短、發(fā)白,長勢較差。
進一步統(tǒng)計步驟4)中不定芽的生根情況,發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)45天后,生根率為80%左右,且不定根較細小,平均不定根數(shù)為2條。
將步驟4)所得種苗進行煉苗15天后將其移栽,待移栽苗成活后統(tǒng)計其成活率為78%,有變異植株出現(xiàn)。
對比實施例2
參照實施例2的方法,除步驟3)增殖培養(yǎng)基中萘乙酸濃度為1.2mg/L,步驟3)生根培養(yǎng)基中不添加活性炭之外,其余步驟與實施例2一致,統(tǒng)計步驟3)中的不定芽增殖數(shù)量,并觀察增殖芽的生長情況,發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)50天后,不定芽增殖系數(shù)僅為3.63倍,不定芽生長不整齊,抽生的葉片較短、發(fā)黃,長勢較差。
進一步統(tǒng)計步驟4)中不定芽的生根情況,發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)50天后,生根率為76%,且不定根較舅小,平均不定根數(shù)為2條。
將步驟4)所得種苗進行煉苗15天后將其移栽,待移栽苗成活后統(tǒng)計其成活率為76.7%,有變異植株出現(xiàn)。