本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種海倫兜蘭原球莖的低溫保存培養(yǎng)基及低溫保存繁殖方法。

背景技術(shù)：
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海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)又稱巧花兜蘭，分布于我國廣西西部和越南北部，生長在灌木叢生的石灰?guī)r山地巖壁縫隙中，分布范圍狹窄，是一種十分珍稀的兜蘭屬植物；同時，由于其生境的破壞和人工采挖，其野生植物數(shù)量已極為稀少，被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)列入附錄I而禁止交易，被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄中列為極危物種(CR)亟待保護，在中國也已被中國國家林業(yè)局列為極小種群野生植物需要重點保護。原球莖離體低溫保護是海倫兜蘭種質(zhì)資源保護的最有效的方法之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種保存成本低、操作簡單、植物材料復(fù)蘇快、生活力高的海倫兜蘭原球莖的低溫保存培養(yǎng)基及低溫保存繁殖方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種海倫兜蘭原球莖的低溫保存培養(yǎng)基，其特征在于，每升培養(yǎng)基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5-10克、瓊脂7～8克，其余為1/8MS培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種海倫兜蘭原球莖低溫保存繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)原球莖的獲得：選擇生長健壯的海倫兜蘭母株進行異株人工授粉，將授粉后120～180天的蒴果進行消毒處理，切開果實，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25～30℃，光照度100～200勒克斯，光照時間12～16小時/天，胚萌發(fā)形成原球莖，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁50～100毫升、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、瓊脂6～7克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；

(2)原球莖離體低溫保存：將原球莖轉(zhuǎn)移至低溫保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度15～20℃，光照度50～100勒克斯，光照時間10～12小時/天，所述的低溫保存培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5-10克、瓊脂7～8克，其余為1/8MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；

(3)原球莖的恢復(fù)生長：將低溫保存的原球莖轉(zhuǎn)移至恢復(fù)生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25～30℃，光照度100～200勒克斯，光照時間12～16小時/天，原球莖分化出小苗，所述的恢復(fù)生長培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1.0～2.0克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、瓊脂6～7克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 5.8～6.0；

(4)生根壯苗培養(yǎng)：將小苗接種到壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25～30℃，光照度1600～2000勒克斯，光照時間12～16小時/天，獲得完整植株，所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有花寶1號1～2克、花寶2號1～2克、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉勻漿50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、瓊脂6～7克，余量為水，pH 5.8～6.0。

步驟(1)所述的消毒處理具體為：將授粉后120～180天的蒴果用體積分數(shù)75％的酒精浸泡60秒后，用質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞溶液消毒20分鐘，無菌水沖洗4～5次。

步驟(1)～步驟(3)所述的光照的光源為LED光源，所述的LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，步驟(4)所述的光照的光源為日光燈。

MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，其成分和配制方法參看文獻(譚文澄、戴策剛主編.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù).北京：中國林業(yè)出版社，1991.)；1/4MS培養(yǎng)基是指將MS培養(yǎng)基中大量元素用量為原來的1/4，其余成份不變；1/8MS培養(yǎng)基是指將MS培養(yǎng)基中大量元素用量為原來的1/8，其余成份不變。所述的1/4MS培養(yǎng)基和1/8MS培養(yǎng)基均為液體培養(yǎng)基，不含有瓊脂。

本發(fā)明的海倫兜蘭原球莖低溫保存繁殖方法，由無菌播種獲得原球莖、采用獨特的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行原球莖離體低溫保存、原球莖的恢復(fù)生長及生根壯苗四個步驟完成。本發(fā)明的方法具有保存成本低、操作簡單、植物材料復(fù)蘇快、生活力高等優(yōu)點，在需要進行種苗的大規(guī)模生產(chǎn)時，能在短期內(nèi)獲得大量的試管苗，對于解決快繁生產(chǎn)急用及種質(zhì)資源的保存也均具有極其重要的價值。在目前，國內(nèi)外還沒有海倫兜蘭原球莖離體低溫保存繁殖方法的報道。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

(1)原球莖的獲得

在溫室中選擇生長健壯的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)母株進行異株人工授粉，然后選擇授粉后120天的果實中和胚為外植體進行無菌播種。播種時，將授粉后120天的蒴果用體積分數(shù)75％的酒精浸泡60秒后，用質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水漂洗5次后切開果實，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照度100勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間16小時/天，60天胚萌發(fā)形成原球莖，萌發(fā)率30％，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁50毫升、活性炭1.0克、蔗糖20克、瓊脂6克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 5.8；其配制方法是將50毫升椰子汁、1.0克活性炭、20克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/4MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/4MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(2)原球莖離體低溫保存

將萌發(fā)獲得的原球莖轉(zhuǎn)移至低溫保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度15℃，光照度50勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間12小時/天，12個月少量原球莖發(fā)育成小苗，不會死亡。如需繼續(xù)保存可將保存的原球莖轉(zhuǎn)移至新的低溫保存培養(yǎng)基中繼續(xù)保存。所述的低溫保存培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁50毫升、活性炭2.0克、蔗糖5克、瓊脂7克，其余為1/8MS培養(yǎng)基，pH 5.8；其配制方法是將50毫升椰子汁、2.0克活性炭、5克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/8MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/8MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(3)原球莖恢復(fù)生長

將低溫保存的原球莖轉(zhuǎn)移至恢復(fù)生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25℃，光照度100勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間16小時/天，3個月能分化出小苗，所述的恢復(fù)生長培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有萘乙酸1.0毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1.0克、活性炭1.0克、蔗糖20克、瓊脂6克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 5.8；其配制方法是將1.0毫克萘乙酸、100毫升椰子汁、1.0克蛋白胨、1.0克活性炭、20克蔗糖和6克瓊脂，加到少量1/4MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/4MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(4)生根壯苗培養(yǎng)

將1-2cm的小苗接種到壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25℃，光照度1600勒克斯(lux)，光源為日光燈，光照時間16小時/天，3個月能形成株高3厘米高的完整植株。采用標準蘭花培養(yǎng)瓶，每瓶25株。所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升含有花寶1號1克、花寶2號1克、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分(鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5毫克、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1毫克、煙酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、香蕉勻漿50克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖20克、瓊脂6克，余量為水，pH 5.8，其配制方法是將1克花寶1號、1克花寶2號、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分(鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5毫克、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1毫克、煙酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、1.0毫克萘乙酸、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、50克香蕉勻漿、1.0克活性炭、20克蔗糖和6克瓊脂，加入到適量的水中，然后用水補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

實施例2：

(1)原球莖的獲得

在溫室中選擇生長健壯的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)母株進行異株人工授粉，然后選擇授粉后150天的果實中和胚為外植體進行無菌播種。播種時，將授粉后150天的蒴果用體積分數(shù)75％的酒精浸泡60秒后，用質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水漂洗5次后切開果實，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度27℃，光照度150勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間14小時/天，40天胚萌發(fā)形成原球莖，萌發(fā)率50％，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁75毫升、活性炭1.5克、蔗糖25克、瓊脂6.5克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 5.9；其配制方法是將75毫升椰子汁、1.5克活性炭、25克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/4MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/4MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(2)原球莖離體低溫保存

將萌發(fā)獲得的原球莖轉(zhuǎn)移至低溫保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度18℃，光照度75勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間11小時/天，11個月少量原球莖發(fā)育成小苗，不會死亡。如需繼續(xù)保存可將保存的原球莖轉(zhuǎn)移至新的低溫保存培養(yǎng)基中繼續(xù)保存。所述的低溫保存培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁75毫升、活性炭2.5克、蔗糖7.5克、瓊脂7.5克，其余為1/8MS培養(yǎng)基，pH 5.9；其配制方法是將75毫升椰子汁、2.5克活性炭、7.5克蔗糖和7.5克瓊脂，加到少量1/8MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/8MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(3)原球莖恢復(fù)生長

將低溫保存的原球莖轉(zhuǎn)移至恢復(fù)生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度27℃，光照度150勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間14小時/天，2.5個月能分化出小苗，所述的恢復(fù)生長培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有萘乙酸1.5毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、活性炭1.5克、蔗糖25克、瓊脂6.5克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 5.9；其配制方法是將1.5毫克萘乙酸、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、1.5克活性炭、25克蔗糖和6.5克瓊脂，加到少量1/4MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/4MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(4)生根壯苗培養(yǎng)

將1-2cm的小苗接種到壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度27℃，光照度1800勒克斯(lux)，光源為日光燈，光照時間14小時/天，2.5個月能形成株高4厘米高的完整植株。采用標準蘭花培養(yǎng)瓶，每瓶25株。

所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升含有花寶1號1.5克、花寶2號1.5克、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分(鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5毫克、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1毫克、煙酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、萘乙酸(NAA)1.5毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、香蕉勻漿75克、活性炭(AC)1.5克、蔗糖25克、瓊脂6.5克，余量為水，pH5.9，其配制方法是將1.5克花寶1號、1.5克花寶2號、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分(鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5毫克、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1毫克、煙酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、1.5毫克萘乙酸、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、75克香蕉勻漿、1.5克活性炭、25克蔗糖和6.5克瓊脂，加入到適量的水中，然后用水補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

實施例3：

(1)原球莖的獲得

在溫室中選擇生長健壯的海倫兜蘭(Paphiopedilum helenae Aver.)母株進行異株人工授粉，然后選擇授粉后180天的果實中和胚為外植體進行無菌播種。播種時，將授粉后180天的蒴果用體積分數(shù)75％的酒精浸泡60秒后，用質(zhì)量分數(shù)0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘，無菌水漂洗5次后切開果實，將粉末狀種子接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，光照度200勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間12小時/天，40天胚萌發(fā)形成原球莖，萌發(fā)率45％，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁100毫升、活性炭2.0克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 6.0；其配制方法是將100毫升椰子汁、2.0克活性炭、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/4MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/4MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(2)原球莖離體低溫保存

將萌發(fā)獲得的原球莖轉(zhuǎn)移至低溫保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度20℃，光照度100勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間10小時/天，10個月少量原球莖發(fā)育成小苗，不會死亡。如需繼續(xù)保存可將保存的原球莖轉(zhuǎn)移至新的低溫保存培養(yǎng)基中繼續(xù)保存。所述的低溫保存培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有椰子汁100毫升、活性炭3.0克、蔗糖10克、瓊脂8克，其余為1/8MS培養(yǎng)基，pH 6.0；其配制方法是將100毫升椰子汁、3.0克活性炭、10克蔗糖和8克瓊脂，加到少量1/8MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/8MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(3)原球莖恢復(fù)生長

將低溫保存的原球莖轉(zhuǎn)移至恢復(fù)生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30℃，光照度200勒克斯(lux)，光源為LED光源，LED光源中紅光和藍光的比例為8:1，光照時間12小時/天，2個月能分化出小苗，所述的恢復(fù)生長培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有萘乙酸2.0毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2.0克、活性炭2.0克、蔗糖30克、瓊脂7克，其余為1/4MS培養(yǎng)基，pH 6.0；其配制方法是將2.0毫克萘乙酸、200毫升椰子汁、2.0克蛋白胨、2.0克活性炭、30克蔗糖和7克瓊脂，加到少量1/4MS培養(yǎng)基(液體)中，然后用1/4MS培養(yǎng)基(液體)補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。

(4)生根壯苗培養(yǎng)

將1-2cm的小苗接種到壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光源為日光燈，光照時間12小時/天，2個月能形成株高5厘米高的完整植株。采用標準蘭花培養(yǎng)瓶，每瓶25株。

所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升培養(yǎng)基含有花寶1號2克、花寶2號2克、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分(鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5毫克、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1毫克、煙酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、萘乙酸(NAA)2.0毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、香蕉勻漿150克、活性炭(AC)2.0克、蔗糖30克、瓊脂7克，余量為水，pH6.0，其配制方法是將2克花寶1號、2克花寶2號、MS培養(yǎng)基的維生素和肌醇成分(鹽酸吡哆醇(維生素B6)0.5毫克、鹽酸硫胺素(維生素B1)0.1毫克、煙酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、2.0毫克萘乙酸、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、150克香蕉勻漿、2.0克活性炭、30克蔗糖和7克瓊脂，加入到適量的水中，然后用水補齊至1L，混合均勻，滅菌備用。