本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種烏菜游離小孢子培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

游離小孢子培養(yǎng)是在花藥培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新興技術(shù)，是植物細(xì)胞工程領(lǐng)域最活躍的研究課題之一。通過游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可獲得單倍體、雙單倍體，單倍體及雙單倍體在作物育種上極為珍貴。常規(guī)育種獲得一個(gè)遺傳穩(wěn)定的自交系一般需要5-8年的時(shí)間，而利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)只需要1-2年，故在許多作物中均開展了游離小孢子的研究工作。

烏菜是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個(gè)變種，其游離小孢子培養(yǎng)存在難誘導(dǎo)出胚狀體和胚狀體誘導(dǎo)率非常低的問題，而與烏菜親緣關(guān)系較近的大白菜在游離小孢子培養(yǎng)中易誘導(dǎo)出胚狀體且誘導(dǎo)率普遍較高。目前研究中多有報(bào)道，基因型是決定游離小孢子培養(yǎng)能否誘導(dǎo)出胚和誘導(dǎo)率高低的關(guān)鍵因素，為提高烏菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率，現(xiàn)提供一種方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種烏菜游離小孢子培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種烏菜游離小孢子培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟：

(2)將萌動的雜交種子F1低溫春化后播種于穴盤，待3-4片真葉時(shí)，移栽至大田中，初花至盛花期，取適宜大小的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，得再生植株。

所述步驟(2)中游離小孢子培養(yǎng)步驟為：

取材：以F1作為材料，在初花至盛花期，于晴天上午8:00-10:00選取健壯無病蟲害植株上的花蕾，置于載玻片上，滴2滴蘇木精染液，用鑷子和解剖針破碎花蕾，去除萼片、花藥等組織，蓋上蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察單核靠邊期小孢子，確定小孢子處于單核靠邊期比例較高時(shí)花蕾的大小，以此大小為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取材。

消毒：將選取的花蕾放入25mL無菌小燒杯中，首先用70％的酒精7-10mL消毒30s，其次用2.5％的NaClO溶液約10mL消毒5min，然后用無菌水沖洗3次；

小孢子純化：消毒后，于上述小燒杯中加入蔗糖質(zhì)量濃度為130g/L的B5無菌液體培養(yǎng)基(pH5.8、116℃高溫高壓滅菌30min)約8mL，用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，350目濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15mL旋蓋離心管中，轉(zhuǎn)速1000rpm離心3min，棄上清，重復(fù)2次，最后加入蔗糖質(zhì)量濃度為130g/L的NLN無菌液體培養(yǎng)基(NLN-13，pH5.8，0.22μm孔徑的無菌濾膜過濾滅菌)，使小孢子密度達(dá)到1×10⁵-2×10⁵個(gè)/mL(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，即獲得小孢子懸浮液。

培養(yǎng)：將小孢子懸浮液分裝于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，每皿約3.5mL，用Parafilm封口膜密封后，立即置于33℃黑條件下暗培養(yǎng)24h；然后，轉(zhuǎn)入25℃黑暗條件下培養(yǎng)，有肉眼可見的胚出現(xiàn)時(shí)，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)速60rpm的搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)至形成子葉型胚狀體；平均每個(gè)花蕾誘導(dǎo)出12.53個(gè)胚；

所述步驟(2)中再生植株成苗步驟為：

植株再生：暗培養(yǎng)20d左右形成子葉型胚狀體，挑選子葉型胚轉(zhuǎn)接入添加30g/L蔗糖、8g/L瓊脂，pH5.8、116℃高溫高壓滅菌30min的MS無菌固體培養(yǎng)基中，在25℃、光照14h/d條件下培養(yǎng)，形成再生植株；

再生植株生根：將胚狀體萌發(fā)形成的幼苗接種到添加30g/L蔗糖、6g/L瓊脂、1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA，pH5.8、116℃高溫高壓滅菌30min的MS無菌固體培養(yǎng)基中，在25℃、光照14h/d條件下培養(yǎng)，獲得完整植株。擴(kuò)繁、馴化移栽至田間。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將烏菜與游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率較高的大白菜材料進(jìn)行雜交，為烏菜引入大白菜的遺傳物質(zhì)，有效改善了烏菜供體植株基因型，提高烏菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率，拓寬烏菜育種遺傳基礎(chǔ)，提高烏菜育種效率。

附圖說明

為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

圖1為本發(fā)明小孢子膨大示意圖；

圖2為本發(fā)明子葉型胚狀(A、B)示意圖；

圖3為本發(fā)明胚狀體再生植株示意圖；

圖4為本發(fā)明再生植株擴(kuò)繁示意圖；

圖5為本發(fā)明再生植株田間移栽示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所做的任何變更或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一種烏菜游離小孢子培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟：

(1)選擇游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率較高的大白菜材料，與待培養(yǎng)的烏菜材料進(jìn)行雜交，得雜交種子F1，為烏菜引入大白菜的遺傳物質(zhì)，拓寬烏菜遺傳基礎(chǔ)；

(2)將萌動的雜交種子F1播種于穴盤，待3-4片真葉時(shí)，移栽于大田中，初花至盛花期，取適宜大小的花蕾按常規(guī)方法進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，得再生植株；

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)步驟：

(1)取材：以烏菜和大白菜的雜交一代F1作為材料，在初花至盛花期，于晴天上午8:00-10:00選取健壯無病蟲害的植株上的花蕾，置于載玻片上，滴2滴蘇木精染液，用鑷子和解剖針破碎花蕾，去除萼片、花藥等組織，蓋上蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察單核靠邊期小孢子，確定小孢子處于單核靠邊期比例較多時(shí)花蕾的大小，以此大小為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取材。

(2)消毒：將選取的花蕾放入25ml無菌小燒杯中，首先用70％的酒精7-10ml消毒30s，其次用2.5％的NaClO溶液約10ml消毒5min，然后用無菌水沖洗3次；

(3)小孢子純化：消毒后，于上述小燒杯中加入蔗糖質(zhì)量濃度為130g/L的B5無菌液體培養(yǎng)基約8ml，用玻璃棒輕輕擠壓使小孢子游離出來，350目濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15mL旋蓋離心管中，轉(zhuǎn)速1000rpm離心3min，棄上清，重復(fù)2次，最后加入蔗糖質(zhì)量濃度為130g/L的NLN(NLN-13，0.22μm孔徑的無菌濾膜過濾滅菌，pH5.8)液體無菌培養(yǎng)基，使小孢子密度達(dá)到1×10⁵-2×10⁵個(gè)/mL(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，即獲得小孢子懸浮液。

(4)培養(yǎng)：將小孢子懸浮液分裝于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，每皿3.5ml，用Parafilm封口膜封口，立即置于33℃黑暗培養(yǎng)24h；然后，轉(zhuǎn)入25℃黑暗條件下培養(yǎng)(圖1)，12d有肉眼可見的胚出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)速60rpm的搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)至形成子葉型胚狀體(圖2)；平均每個(gè)花蕾誘導(dǎo)出6-8個(gè)胚，最高達(dá)12.53個(gè)；

(5)植株再生：胚狀體生長20d左右，挑選子葉型胚轉(zhuǎn)接入添加30g/L蔗糖、8g/L瓊脂、pH為5.8、116℃高溫高壓滅菌30min的MS培養(yǎng)基中，在25℃光照14h/d條件下培養(yǎng)，形成再生植株；未直接成苗而形成愈傷組織的胚狀體轉(zhuǎn)接到添加1mg/L6-BA的上述培養(yǎng)基上，使其繼續(xù)發(fā)育成苗(圖3)。

(6)再生植株生根：將胚狀體萌發(fā)形成的小苗接種到添加30g/L蔗糖、6g/L瓊脂、1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、pH為5.8、116℃高溫高壓滅菌30min的MS生根培養(yǎng)基中，在25℃、光照14h/d條件下培養(yǎng)，獲得完整植株，擴(kuò)繁、馴化移栽至田間(圖4、圖5)。

本發(fā)明材料選用烏菜與大白菜的雜交一代F1進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，相比于直接進(jìn)行烏菜游離小孢子培養(yǎng)，F(xiàn)1引入了大白菜的遺傳物質(zhì)，提高烏菜游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率，解決了胚誘導(dǎo)頻率低的技術(shù)問題，拓寬烏菜育種遺傳基礎(chǔ)，提高烏菜育種效率。

以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。