本發(fā)明涉及一種快速培育灘涂圍墾土壤自然生物膜的方法及應用，尤其是涉及沿海灘涂重度鹽分土壤表面原位、快速、大面積培養(yǎng)土壤自然生物膜的材料和方法，通過制備自然生物膜懸浮液，灘涂土壤原位接種富集自然生物膜，并覆膜加速擴大化培育土壤自然生物膜，從而有效控制灘涂圍墾土壤返鹽，提升土壤養(yǎng)分含量，為后期作物生長提供適宜生長環(huán)境，屬于鹽土生物改良技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國沿海灘涂分布廣、面積大，是巨大的潛在土地后備資源，極具拓展?jié)摿ΑｋS著城市化的快速推進，灘涂圍墾（marshy reclamation）成為我國沿海地區(qū)緩解耕地減少、保持耕地總量動態(tài)平衡的戰(zhàn)略選擇。建國以來，我國實施了一系列圍填海工程，經(jīng)歷了50年代末期、70年代末期和90年代末期三次圍墾高潮，其中江蘇沿海灘涂開發(fā)戰(zhàn)略規(guī)劃到2020年，圍填18萬hm²海域灘涂，其中農(nóng)業(yè)用地要占到總圍填面積的60%。 而沿海新圍墾土壤鹽分濃度較高，且質(zhì)地多數(shù)為泥沙性質(zhì)，理化性質(zhì)較為一致，養(yǎng)分含量低。因此，如何有效改良灘涂新圍墾土壤，從而增加可利用耕地，對保障國家糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。

目前，沿海灘涂圍墾后，種植水稻已成為沿海地區(qū)提高糧食總產(chǎn)量和改良鹽堿土壤的重要手段之一。水稻種植可以利用大量淡水灌溉，加快土壤的水鹽運動，達到快速淋洗土壤鹽分，減少土壤蒸發(fā)，有效抑制土壤返鹽，增加入滲淋鹽，從而達到改良灘涂土壤的目的。然而，沿海新圍墾灘涂土壤多數(shù)為泥沙，理化性質(zhì)較為一致，養(yǎng)分固持能力差。因此，在灘涂圍墾區(qū)域種植水稻過程中，過量施肥、超量施肥的現(xiàn)象普遍存在。大量施入化肥不僅增加了生產(chǎn)成本，而且過量的氮磷養(yǎng)分通過農(nóng)田地表徑流、農(nóng)田排水和地下滲透進入附近水體，是引起鄰近河流、湖泊等水體營養(yǎng)化的主要原因之一。

新近研究發(fā)現(xiàn)，自然生物膜廣泛存在于稻田系統(tǒng)中，是一種生物和非生物物質(zhì)共同組成的膜狀聚合體，一般由藻類、細菌、真菌及小型原生動物及少量土壤組成。自然生物膜是在一定的水體環(huán)境條件下產(chǎn)生的微生物聚集體，主要由光合自養(yǎng)型生物主導，一般呈現(xiàn)綠色，普遍存在于河流、湖泊、濕地環(huán)境中的巖石、表層沉積物表面上，并由地球上不同種類的微生物組成。以往研究多集中于水體中的自然生物膜，對土壤表層生物膜的研究較匱乏。土壤自然生物膜可以看作一種先鋒“物種”，能夠在2%高鹽濃度的土壤表層存活生長，并在表層形成一層膜狀隔離層，有效抑制鹽分向表層土壤的運移，從而為其他物種如植物的生存和繁殖提供適宜土壤環(huán)境。研究表明，自然生物膜是水土界面養(yǎng)分和鹽分運移、轉(zhuǎn)化及傳輸?shù)谋亟?jīng)之地，自然生物膜具有顯著的固氮作用，對磷也具有較強的親和力，其磷含量是周圍水體和植物中磷含量的幾百至幾千倍，可以將氮磷等養(yǎng)分固持在生物膜體內(nèi)。例如，自然生物膜可以通過吸收、截留、共沉降、吸附等方式有效的將水體中磷元素固定，并且可以釋放堿性磷酸酶轉(zhuǎn)化水體中有機磷，進而達到吸收利用有機磷的效果。研究發(fā)現(xiàn)，自然生物膜含磷量高達1-10 mg g^-1（DW，干重），是其他水生植物含磷量的幾千倍。在全球磷礦資源短缺，磷元素價格逐年飆升的背景下，對土壤生物膜進行優(yōu)化利用，提高磷肥利用率。同時，通過人工干預手段將生物膜翻耕入土，可以有效增加土壤有機質(zhì)、磷等養(yǎng)分，達到有效改良灘涂圍墾土壤性質(zhì)，為我國灘涂農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供重要保障。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

沿海新圍墾灘涂土壤鹽分高、養(yǎng)分低，本發(fā)明的目的為改良沿海灘涂新圍墾土壤理化性質(zhì)，一方面為沿海灘涂新圍墾土壤改良技術(shù)提供新途徑，設計一種高效、廉價、易實現(xiàn)、環(huán)境友好的灘涂土壤自然生物膜的富集及其擴大化生長方法；另一方面為沿海灘涂圍墾開發(fā)及灘涂生態(tài)功能提升提供技術(shù)支持和理論參考，合理資源化利用土壤自然生物膜資源，從而有效控制表層土壤鹽分含量，增加土壤養(yǎng)分含量，提升灘涂新圍墾土壤肥力。

為達到上述目的，本方法是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種快速培育沿海灘涂圍墾土壤自然生物膜的方法，步驟如下：

（1）灘涂圍墾土壤自然生物膜的快速富集；

（2）灘涂圍墾土壤自然生物膜接種液或懸浮液的制備；

（3）灘涂圍墾土壤的平整及配套設施的設計；

（4）灘涂圍墾土壤自然生物膜的原位培育及擴大化培養(yǎng)；

（5）灘涂圍墾土壤自然生物膜的后期管理與資源化處置。

進一步的，步驟（1）灘涂圍墾土壤自然生物膜的富集包括原位富集和異位富集方法，兩種富集方法相輔相成。在灘涂土壤表面無自然生物膜的情況下，采用異位富集辦法，室內(nèi)富集灘涂土壤自然生物膜；在灘涂土壤表層具有自然生物膜的情況下，利用原位富集方法，直接在野外進行土壤自然生物膜的富集。具體為：

在灘涂圍墾土壤表面無自然生物膜的情況下，適宜采用異位富集辦法，首先采取定量灘涂表層土壤（0-5 cm），按水土比2.5:1將土壤與水充分混勻后靜止，然后將土壤溶液導入透明玻璃缸內(nèi)（玻璃缸大小根據(jù)土壤懸浮液而定），將自然生物膜富集材料（腐熟秸稈）放入玻璃缸中進行灘涂土壤土著微生物的富集形成生物膜聚合體，玻璃缸放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，控制光照時間14/10h，光照強度大于或等于12000 lux，溫度30-35℃。為滿足自然生物膜生長所需營養(yǎng)，定期加入適量培養(yǎng)液，具體配方如下：

表1土壤生物膜培養(yǎng)液配方

注：其他包括微量元素溶液、VB₁₂溶液、硫胺素溶液、和生物素溶液。微量元素溶液母液配方為： Na₂EDTA·2H₂O 4.36 g、FeCl₃·6H₂O 3.15 g、CuSO₄·5H₂O 2.5 g、ZnSO₄·7H₂O 22 g、CoCl₂·6H₂O 10 g、MnCl₂·4H₂O 180 g、Na₃VO₄ 18 g、Na₂MoO₄ ·2H₂O 6.3 g、蒸餾水1 L；VB₁₂溶液母液、硫胺素溶液母液和生物素溶液母液分別為27 mg VB₁₂、67 mg硫胺素和2400 mg生物素分別溶于200 mL HEPES緩沖液（2.4 g/200 mL dH₂O, pH7.8）中。

在野外灘涂土壤已經(jīng)具有一定自然生物膜的情況下，利用原位富集方法，直接將土壤自然生物膜采集，進行土壤自然生物膜的快速富集。在田塊附近，挖一個1 m³的水塘，用塑料膜覆上。光源是自養(yǎng)微生物生長繁殖必不可少的影響因子，因此選擇在陽光充裕、溫度適中（25℃以上）的條件下，將自然生物膜富集材料放入塘內(nèi)進行自然生物膜的快速富集。

進一步的，所述的自然生物膜富集材料為腐熟的農(nóng)業(yè)固廢，農(nóng)業(yè)固廢主要包括作物秸稈、作物果實殼，優(yōu)選作物秸稈；農(nóng)業(yè)固廢的腐熟過程為：取預處理好的固廢放入密閉玻璃箱內(nèi)，加入蒸餾水，加入腐熟劑，保持箱內(nèi)濕度為80%以上，在大于30℃條件下腐熟7-15天，然后將腐熟的農(nóng)業(yè)固廢放在室外自然烘干1-2周，備用。腐熟后的秸稈更有利于微生物吸收利用，且表面粗糙度增加，能夠促進土壤自然生物膜的富集及生長。

進一步的，步驟（2）灘涂土壤自然生物膜接種液或懸浮液的制備是將步驟（1）富集的生物膜聚合體加入蒸餾水中，充分攪拌混勻，制備成自然生物膜接種液或者懸浮液，以備接種所用。生物膜聚合體與蒸餾水的比例為1:10。具體的，按照每平米土壤約需5 g土壤自然生物膜（鮮重）原樣進行配置。優(yōu)選的，土壤生物膜懸浮液的具體制備方法如下：在進水渠內(nèi)，圍起一塊封閉空間（根據(jù)生物量和水量而定），用塑料膜覆上，加入富集好的土壤生物膜和水，水與生物膜質(zhì)量比為10:1，用木棒或其他工具將水與生物膜充分攪拌均勻，制備成土壤生物膜懸浮液，備用。進一步的，步驟（3）灘涂圍墾土壤的平整是利用機械化工具（挖掘機等）將圍墾土地進行翻耕和推平等工程化操作，利用旋耕機旋平土壤，要求土壤的高低差不能高于5cm，田間不能有低洼、凸起等。圍墾土壤周圍的配套設施主要包括統(tǒng)一化管理的進水和排水渠道，進水渠寬大于100 cm，排水渠大于200 cm，長度根據(jù)田塊面積而定，圍墾田塊面積適宜在3-5畝之間，每塊田設置一個進水排水管道，用直徑40-50 cm的PVC管制成L形管，田埂高度在60 cm以上，田間每隔200 cm設置一個排水溝，溝深10 cm，寬20 cm，如附圖1所示。

進一步的，步驟（4）所述的灘涂土壤自然生物膜的原位培育及擴大化培養(yǎng)，是將制備好的自然生物膜懸浮液均勻撒在土壤表層，在合適的野外環(huán)境條件下進行富集培養(yǎng)，要求光照充足，田間水深1-5 cm。為增加光照和溫度，避免高強度降雨對自然生物膜的影響，可在土壤上方50 cm處覆蓋一層透明塑料薄膜。待土壤生物膜富集成功后（土壤表面可見明顯綠色膜），進行土壤生物膜的擴大化培育，將有機肥和秸稈粉末充分混勻后撒入土壤表面，再加入適量無機肥。灘涂土壤自然生物膜擴大化培養(yǎng)需要的養(yǎng)分條件如下：有機肥15公斤/畝，秸稈粉末25公斤/畝以及氮磷鉀復合肥10公斤/畝。一般光線充足，溫度適宜的情況下，生物膜的擴大化培育需要時間為15-30 d，土壤表層即可形成一層厚度約為0.1 cm的生物膜，此時即可翻耕再次培育土壤生物膜。

本發(fā)明的目的之二是提供上述方法在改良沿海灘涂新圍墾土壤理化性質(zhì)方面的應用。

富集培養(yǎng)好的自然生物膜可以充當“生物肥料”，研究表明自然生物膜可以高效地將有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷，還可以通過吸附、吸收以及儲存磷元素，同時還能固定大氣中的氮元素，其本身也是多種微生物有機體，翻耕入土，可以有效增加土壤肥力。一般條件下，土壤生物膜生長周期短（約15 d），可以快速多次培肥。

本發(fā)明方法的有益效果在于：

（1）該方法具有較強的靈活性，可以依據(jù)灘涂圍墾規(guī)模的大小，配置相應面積的土壤生物膜，并可以反復培育，快速增加土壤有機質(zhì)，為灘涂土壤肥力的提升打下堅實基礎(chǔ)。同時，自然生物膜覆蓋后可以有效抑制土壤返鹽，即可以控制土壤表層鹽分含量，又增加土壤肥力。本方法為資源化自然生物資源，為充分合理利用微生物復合體提供了新的路徑，為我國灘涂開發(fā)及土壤改良提供有力的技術(shù)基礎(chǔ)。

（2）本方法采用的生物處理方法，有效地降低了其因不當利用造成的環(huán)境風險的可能，解決了傳統(tǒng)化學處理使用的化學試劑費用較高、操作不便、具有環(huán)境風險等缺陷，該操作方法簡單易行，環(huán)境友好，改善土壤效果突出。同時，將農(nóng)業(yè)秸稈作為生物膜富集材料投入土壤，通過改性農(nóng)業(yè)秸稈，使其表面的物化性質(zhì)更有利于微生物富集，從而實現(xiàn)高效大量培養(yǎng)灘涂土壤生物膜的同時，也為循環(huán)利用農(nóng)業(yè)固廢提供新的途徑。

（3）該方法具有較強的實用性，且成本低廉，可操作性強。其充分利用微生物的“先鋒”物種與高耐鹽特征，在土壤表面生長繁殖，從而達到改良灘涂土壤的目的。同時，土壤生物膜對低溫的耐性較強，只要光照充足就可以富集生長，因此可以在冬季作物停止生長時，對土壤進行生物膜生長培肥，提升地力。

附圖說明

圖1為圍墾土壤周圍的配套設施示意圖。其中：1.圍墾灘涂土壤，2.進水渠道，3.排水渠道，4.排水溝，5.進水口，6.排水口。

圖2為灘涂土壤上形成的自然生物膜形態(tài)，組成和結(jié)構(gòu)特征。

圖3為不同基質(zhì)下土壤生物膜生物量的變化。

圖4為土壤自然生物膜生長后，土壤表層有機質(zhì)含量的變化。

圖5為灘涂土壤自然生物膜富集后，土壤表層含鹽量（電導率）變化。

圖6為已經(jīng)具有一定自然生物膜的野外灘涂土壤。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實驗方案對本發(fā)明作具體的介紹。

實施例1

一種快速富集和擴大化培育土壤自然生物膜的技術(shù)，尤其是涉及沿海灘涂重度鹽分土壤表面原位、快速、大面積培養(yǎng)土壤自然生物膜的方法和材料，通過制備自然生物膜懸浮液，灘涂土壤原位接種富集自然生物膜，并覆膜加速擴大化培育土壤自然生物膜，從而有效控制灘涂圍墾土壤返鹽，提升土壤養(yǎng)分含量，為后期作物生長提高適宜生長環(huán)境。為驗證該方法的可行性，設立以下實驗，具體步驟為：

（1）典型沿海灘涂土壤的采集：在江蘇鹽城市射陽縣灘涂圍墾地區(qū)，采集500公斤0-20 cm灘涂土壤，土壤鹽分含量在0.15%以上，將土壤運回實驗室陰干過篩，剔除雜質(zhì)，備用。

（2）土壤自然生物膜的富集：按水土比2.5:1將取回土壤與水充分混勻后靜止，然后將土壤溶液導入透明玻璃缸內(nèi)（長30 cm，寬40 cm，高30 cm），將自然生物膜富集材料（腐熟秸稈）放入玻璃缸中進行灘涂土壤土著微生物的富集。腐熟秸稈的制作是將定量農(nóng)業(yè)秸稈（水稻、小麥等）加入秸稈腐熟劑（2kg/畝，1000公斤秸稈，沃寶生物科技有限公司），保持箱內(nèi)濕度為80%以上，對其進行一定時間的腐熟（7-15 d）。玻璃缸放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，控制光照時間14/10h，光照強度大于或等于12000 lux，溫度30-35℃。

（3）土壤自然生物膜懸浮液的制備：按照每平米土壤約需5 g土壤自然生物膜（鮮重）原樣進行配置。水與生物膜質(zhì)量比為10:1，將水與生物膜充分攪拌均勻，制備成土壤生物膜懸浮液，備用。

（4）灘涂土壤自然生物膜的生長及其擴大化培育：將1Kg灘涂土壤裝入塑料盆（直徑20 cm，高10 cm），加水浸透，使土壤充分濕潤。然后，將制備好的土壤生物膜懸浮液均勻施加在土壤表層，加水保持水深1-2 cm。為研究不同基質(zhì)對土壤生物膜擴大化效果，設置四組處理：土壤基質(zhì)（LP），土壤+秸稈基質(zhì)（WP，3%），土壤+生物炭基質(zhì)（RP，3%）。為滿足土壤自然生物膜生長所需營養(yǎng)，定期加入適量營養(yǎng)液，營養(yǎng)液配方見表1。

（5）灘涂土壤及自然生物膜指標測定：待土壤生物膜生長成熟（約20 d），取適量土壤及生物膜進行以下指標測定：土壤表層電導率，土壤表層有機質(zhì)含量，土壤生物膜形態(tài)及其生物量。

圖2為富集材料上形成的灘涂自然生物膜形態(tài)，組成和結(jié)構(gòu)特征。由圖可以看出，本方法所富集的灘涂自然生物膜物種多樣性較高，包括藻類（圖2c-f，如綠球藻，Chlorococcum sp.，雙頭針桿藻Synedra ulna Kütz.等）、細菌（圖2g）、原生動物（圖2h-j）等，其中藻類是主導物種，這些光合藻類錯綜盤雜的交織在一起形成光合生物膜的基本結(jié)構(gòu)，為其他微生物提供了 “棲息地”。以上所述特征證明了光合生物膜是一個復雜的微生物聚合體，以藻類為基質(zhì)，各種微生物共同生存的一個微生態(tài)系統(tǒng)，這也為其有效改良灘涂土壤提供了有利的條件。

圖3為不同基質(zhì)下土壤生物膜生物量的變化，可以看出，純土壤基質(zhì)培養(yǎng)生物膜生物量可達到約120 g m^-2。與純土壤相比，施加秸稈有利于土壤生物膜的生長富集，達到約160 g m^-2。而施加生物炭則抑制土壤生物膜的生長富集，土壤生物膜生物量不到40 g m^-2。

圖4為土壤自然生物膜生長后，土壤表層有機質(zhì)含量的變化，可以看出土壤生物膜生長后，土壤有機質(zhì)含量增加，在土壤基質(zhì)、秸稈基質(zhì)、生物炭基質(zhì)處理下分別為6、10及32 g Kg^-1，對照為5 g Kg^-1。其中，生物炭施加處理有機質(zhì)增加幅度最大，這是因為生物炭本身就是一種有機質(zhì)，施加到土壤后導致土壤有機質(zhì)增加顯著。

圖5為灘涂土壤自然生物膜富集后，土壤表層含鹽量（電導率）變化，可以看出與對照相比，生長自然生物膜60 d后，土壤表層電導率在3 md/cm左右，顯著低于對照（6 md/cm左右）。這一定程度上說明了土壤生物膜的富集和覆蓋顯著控制了鹽分在土壤表層的積累。

實施例2

本實施例選取已經(jīng)具有一定自然生物膜的野外灘涂土壤如圖6，采用原位富集方法，直接在野外進行土壤自然生物膜的富集。

（1）灘涂土壤自然生物膜的原位富集：在田塊附近，挖一個1 m³的水塘，用塑料膜覆上。選擇在陽光充裕、溫度適中（25℃以上）的條件下，將腐熟秸稈放入塘內(nèi)進行自然生物膜的快速富集。

（2）灘涂土壤自然生物膜懸浮液的制備：在進水渠內(nèi)，圍起一塊封閉空間，用塑料膜覆上，加入富集好的土壤生物膜和水，水與生物膜質(zhì)量比為10:1，用木棒將水與生物膜充分攪拌均勻，制備成土壤生物膜懸浮液，備用。

（3）灘涂土壤的平整及配套設施的設計：灘涂圍墾土壤的平整是利用挖掘機將圍墾土地進行翻耕和推平等工程化操作，利用旋耕機旋平土壤，圍墾土壤周圍的配套設施主要包括統(tǒng)一化管理的進水和排水渠道，進水渠寬大于100 cm，排水渠大于200 cm，長度根據(jù)田塊面積而定，圍墾田塊面積適宜在3-5畝之間，每塊田設置一個進水排水管道，用直徑40-50 cm的PVC管制成L形管，田埂高度在60 cm以上，田間每隔200 cm設置一個排水溝，溝深10 cm，寬20 cm，如附圖1所示。

（4）灘涂土壤自然生物膜的原位培育及擴大化培養(yǎng)：是將制備好的自然生物膜懸浮液均勻撒在土壤表層，在野外環(huán)境條件下進行富集培養(yǎng)，要求光照充足，田間水深1-5 cm。為增加光照和溫度，避免高強度降雨對自然生物膜的影響，在土壤上方50 cm處覆蓋一層透明塑料薄膜。待土壤生物膜富集成功后（土壤表面可見明顯綠色膜），進行土壤生物膜的擴大化培育，將有機肥和秸稈粉末充分混勻后撒入土壤表面，再加入適量無機肥。灘涂土壤自然生物膜擴大化培養(yǎng)需要的養(yǎng)分條件如下：有機肥15公斤/畝，秸稈粉末25公斤/畝以及氮磷鉀復合肥10公斤/畝。一般光線充足，溫度適宜的情況下，生物膜的擴大化培育需要時間為15-30 d，土壤表層即可形成一層厚度約為0.1 cm的生物膜，此時即可翻耕再次培育土壤生物膜。

該方法具有較強的實用性，且成本低廉，可操作性強。其充分利用微生物的“先鋒”物種與高耐鹽特征，在土壤表面生長繁殖，從而達到改良灘涂土壤的目的。同時，土壤生物膜對低溫的耐性較強，只要光照充足就可以富集生長，因此可以在冬季作物停止生長時，對土壤進行生物膜生長培肥，提升地力。

上述實施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。