本發(fā)明涉及玻璃化凍存技術(shù)，尤其涉及一種黃體生成素干預(yù)下的卵巢玻璃化凍存方法。

背景技術(shù)：

離體的卵巢組織的體外培養(yǎng)及凍存可為由卵巢組織獲得雌性生殖干細(xì)胞及各級(jí)卵泡提供便利條件,使這些技術(shù)的開展不受時(shí)間及地點(diǎn)的限制。同時(shí)，離體的卵巢組織便于研究卵細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制，結(jié)合體外受精或者孤雌激活技術(shù)獲取大量胚胎干細(xì)胞用于科研，還助于建立卵子庫，為女性提供生殖保險(xiǎn)。

當(dāng)前離體卵巢組織主要是離體后直接培養(yǎng)，然后研究使用，但是由于野外條件限制或者培養(yǎng)條件不佳，不能為離體卵巢組織提供最佳的保存環(huán)境時(shí)，離體卵巢組織細(xì)胞就會(huì)凋亡，導(dǎo)致很多珍貴的離體卵巢組織材料不能得到很好的保存，就眼睜睜的看著珍稀的卵巢組織離體材料無可挽回的消失殆盡，如果能采取凍存方式保留離體卵巢組織，然后在合適條件下解凍，是保存、轉(zhuǎn)移一些珍貴卵巢組織的最佳方法。

離體卵巢組織經(jīng)過合適的方法凍存后，是可以保留卵巢生殖功能與內(nèi)分泌功能的，但是，當(dāng)前卵巢凍存解凍技術(shù)存在一個(gè)問題難題是，目前還沒有一種廉價(jià)、穩(wěn)定和安全的凍存解凍方法。卵巢中存在處于不同發(fā)育階段的各級(jí)卵泡，包括原始卵泡，初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡和竇卵泡，直接將卵巢組織凍存，然后解凍，并在體外培養(yǎng)，只有少數(shù)卵泡發(fā)育到排卵前卵泡，其他大部分卵泡會(huì)停止發(fā)育，形成閉鎖卵泡，這導(dǎo)致卵巢中的大部分卵泡在凍存過程中死亡，保留凍存卵巢生殖功能與內(nèi)分泌功能的效果。

現(xiàn)在有使用褪黑素、血管內(nèi)皮生長因子，促紅細(xì)胞生成素等藥物對(duì)卵巢進(jìn)行干預(yù)的凍存方法，以提高凍存后卵巢內(nèi)卵泡的存活率，但多數(shù)是聯(lián)合使用，成本高昂。因此，需要更為簡潔而有效的干預(yù)方法來確保凍存卵巢內(nèi)存活卵泡的數(shù)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種天然的卵巢靶向保護(hù)性物質(zhì)--黃體生成素干預(yù)下的卵巢玻璃化凍存方法，黃體生成素（luteinizing hormone，LH）是一個(gè)調(diào)控卵泡發(fā)育的重要激素，在卵巢激素的合成和排卵過程中發(fā)揮重要的作用，在卵巢凍存解凍的過程中，使用LH進(jìn)行干預(yù)，可以提高凍存后卵巢的存活率，較大程度的保留其生殖功能與內(nèi)分泌功能。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種黃體生成素干預(yù)下的卵巢玻璃化凍存方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；所述培養(yǎng)液包括黃體生成素；

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

室溫下，將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液包括包括黃體生成素；

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢室溫下轉(zhuǎn)移至含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡，得到凍存液滲透平衡后的離體卵巢；所述玻璃化凍存液包括黃體生成素；

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

最優(yōu)的，所述黃體生成素濃度為0.15 IU/ml、0.30 IU/ml或者0.60 IU/ml。

最優(yōu)的，所述離體卵巢是1mm×1mm×2mm大??；所述離體卵巢預(yù)培養(yǎng)步驟中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間為60分鐘、120分鐘或240分鐘。

最優(yōu)的，所述離體卵巢預(yù)滲透平衡步驟中，離體卵巢在含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透時(shí)間為8分鐘；所述離體卵巢滲透平衡步驟中，離體卵巢在含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡時(shí)間為3.5分鐘。

最優(yōu)的，所述培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素而成；

所述預(yù)滲透平衡液是按照12%牛血清白蛋白10ml、滲透性低溫保護(hù)劑乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加黃體生成素而成；

所述玻璃化凍存液是按照滲透性低溫保護(hù)劑乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、非滲透性保護(hù)劑蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加黃體生成素而成；

所述基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法，包括以下步驟：

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中，得到再次解凍的卵巢；所述解凍液中包括黃體生成素；

凍存卵巢的解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中，得到解凍的卵巢；所述解凍液中包括黃體生成素；

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；所述培養(yǎng)液包括黃體生成素；

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，得到解凍后培養(yǎng)的卵巢；所述培養(yǎng)液包括黃體生成素。

最優(yōu)的，所述黃體生成素濃度為0.15 IU/ml、0.30 IU/ml或者0.60 IU/ml。

最優(yōu)的，所述離體卵巢是1mm×1mm×2mm大?。凰鰞龃媛殉渤醮谓鈨霾襟E中，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘；所述凍存卵巢再次解凍步驟中，放置于37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘；所述凍存卵巢的解凍步驟中，放置于37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘；所述凍存保護(hù)劑的洗脫步驟中，在培養(yǎng)液中洗脫10分鐘以洗脫去蔗糖。

最優(yōu)的，所述解凍卵巢的后培養(yǎng)步驟中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間為120分鐘、240分鐘或者480分鐘。

最優(yōu)的，所述含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素而成；

所述含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素而成；

所述含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素而成；

所述培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素而成；

所述基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種天然的卵巢靶向保護(hù)性物質(zhì)--黃體生成素干預(yù)下的卵巢玻璃化凍存方法和黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法；黃體生成素是卵巢調(diào)控卵泡發(fā)育的重要激素，屬于內(nèi)源性激素，有效期長且靶向有針對(duì)性，黃體生成素干預(yù)后的卵巢經(jīng)過玻璃化凍存、解凍后有顯著高于對(duì)照的卵泡存活率，使經(jīng)過凍存解凍過程后的卵巢顯示更佳的生殖功能與內(nèi)分泌功能，對(duì)于凍存卵巢技術(shù)有很大的意義。

附圖說明

附圖1是LH干預(yù)對(duì)小鼠卵巢Survivin表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)結(jié)果。圖中標(biāo)尺為100μm，“→”示卵泡，“↑”示黃體。）

附圖2是三組卵巢形態(tài)學(xué)結(jié)果。其中“*”示卵泡。

附圖3是三組卵巢中正常卵泡的比例。其中a：與對(duì)照組比較，b：與凍存組比較，P<0.05。

附圖4是三組卵巢VEGF的表達(dá)。*示卵泡。

附圖5是三組卵巢VEGF的Western-blot結(jié)果。其中a：與對(duì)照組比較，b：與凍存組比較，P<0.05。

附圖6是三組卵巢Cx37的表達(dá)。*示卵泡。

附圖7是三組卵巢Cx37的Western-blot結(jié)果。其中a：與對(duì)照組比較，b：與凍存組比較，P<0.05。

附圖8是三組卵巢Cx43的表達(dá)。*示卵泡。

附圖9是三組卵巢Cx43的Western-blot結(jié)果。其中a：與對(duì)照組比較，b：與凍存組比較，P<0.05。

具體實(shí)施方式

接下來具體描述一下黃體生成素干預(yù)下的卵巢玻璃化凍存方法，需要注意的是凍存和解凍的個(gè)過程，要嚴(yán)格掌握時(shí)間，確保時(shí)間的準(zhǔn)確。黃體生成素采用逐級(jí)稀釋法進(jìn)行配置，確保濃度的準(zhǔn)確。因?yàn)檎麄€(gè)凍存過程需要滲透完全，所以本發(fā)明使用的是成年小鼠的卵巢，也就是本方法適用于成年小鼠卵巢大小的整個(gè)卵巢，即離體卵巢是1mm×1mm×2mm大小，或者更小的卵巢，如果凍存較大的卵巢，可以選擇將卵巢皮質(zhì)切割成小片后凍存。

實(shí)施例1：

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化凍存方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)240分鐘，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

室溫下，將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透8分鐘，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢室溫下轉(zhuǎn)移至含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡3.5分鐘，得到凍存液滲透平衡后的離體卵巢；玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法，包括以下步驟：

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到初次解凍的卵巢；含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到再次解凍的卵巢；含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢的解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到解凍的卵巢；含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫10分鐘，以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)480分鐘，得到解凍后培養(yǎng)后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.60 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

實(shí)施例2：

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化凍存方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)240分鐘，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

室溫下，將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透8分鐘，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢室溫下轉(zhuǎn)移至含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡3.5分鐘，得到凍存液滲透平衡后的離體卵巢；玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法，包括以下步驟：

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到初次解凍的卵巢；含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到再次解凍的卵巢；含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢的解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到解凍的卵巢；含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫10分鐘，以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)480分鐘，得到解凍后培養(yǎng)后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

實(shí)施例3：

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化凍存方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)240分鐘，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

室溫下，將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透8分鐘，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢室溫下轉(zhuǎn)移至含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡3.5分鐘，得到凍存液滲透平衡后的離體卵巢；玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法，包括以下步驟：

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到初次解凍的卵巢；含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到再次解凍的卵巢；含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢的解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到解凍的卵巢；含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫10分鐘，以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)480分鐘，得到解凍后培養(yǎng)后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

實(shí)施例4：

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化凍存方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120分鐘，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

室溫下，將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透8分鐘，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢室溫下轉(zhuǎn)移至含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡3.5分鐘，得到凍存液滲透平衡后的離體卵巢；玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法，包括以下步驟：

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到初次解凍的卵巢；含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到再次解凍的卵巢；含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢的解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到解凍的卵巢；含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫10分鐘，以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)240分鐘，得到解凍后培養(yǎng)后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.30 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

實(shí)施例5：

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化凍存方法，包括以下步驟：

離體卵巢預(yù)培養(yǎng)：

將離體卵巢浸泡在培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60分鐘，得到預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢預(yù)滲透平衡：

室溫下，將預(yù)培養(yǎng)后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至含滲透性低溫保護(hù)劑的預(yù)滲透平衡液中滲透8分鐘，得到預(yù)滲透平衡后的離體卵巢；所述預(yù)滲透平衡液的是按照12%牛血清白蛋白10ml、乙二醇8.36ml與基礎(chǔ)液31.64ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢滲透平衡：

將預(yù)滲透平衡后的離體卵巢室溫下轉(zhuǎn)移至含高濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化凍存液中繼續(xù)滲透平衡3.5分鐘，得到凍存液滲透平衡后的離體卵巢；玻璃化凍存液是按照乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、蔗糖8.56 g與基礎(chǔ)液24.7ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

離體卵巢凍存：

將凍存液滲透平衡后的離體卵巢轉(zhuǎn)移至液氮中放置至少24小時(shí)。

黃體生成素干預(yù)下的成年小鼠卵巢玻璃化解凍方法，包括以下步驟：

凍存卵巢初次解凍：

將凍存的卵巢從液氮中取出，放置于37℃預(yù)熱的含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到初次解凍的卵巢；含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢再次解凍：

將初次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.25 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到再次解凍的卵巢；含0.25 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加等體積的基礎(chǔ)液稀釋，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存卵巢的解凍：

將再次解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至37℃預(yù)熱的含0.125 mol/L蔗糖的解凍液中10分鐘，得到解凍的卵巢；含0.125 mol/L蔗糖的解凍液是將含0.5 mol/L蔗糖的解凍液加兩倍體積的基礎(chǔ)液稀釋而成，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成，含0.5 mol/L蔗糖的解凍液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml與基礎(chǔ)液40ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

凍存保護(hù)劑的洗脫：

將解凍的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中洗脫10分鐘，以洗脫去蔗糖，得到洗脫后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

解凍卵巢的后培養(yǎng)：

將洗脫后的卵巢轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO₂條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120分鐘，得到解凍后培養(yǎng)后的卵巢；培養(yǎng)液是按照12%牛血清白蛋白5ml與基礎(chǔ)液45ml的比例混合，再添加黃體生成素至0.15 IU/ml而成；其中基礎(chǔ)液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸鏈霉素0.1 g、4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亞砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接著使用5.6% NaHCO3 溶液調(diào)整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。

上述實(shí)施例均是經(jīng)過了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，卵巢玻璃化凍存、解凍后卵巢中卵泡的存活率顯著高于沒有黃體生成素干預(yù)的凍存、解凍后卵巢中卵泡的存活率，以下是部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)一：LH干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的確定

Survivin（存活因子）是反應(yīng)卵巢內(nèi)細(xì)胞和卵泡存活的良好指標(biāo)，該指標(biāo)的升高，提示卵巢內(nèi)細(xì)胞和卵泡情況良好。因此，本技術(shù)選用該指標(biāo)，判斷LH干預(yù)的最佳濃度和時(shí)間。本部分實(shí)驗(yàn)使用C57小鼠的卵巢為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分LH三個(gè)濃度，即黃體生成素濃度為0.15 IU/ml、0.30 IU/ml、0.60 IU/ml這三個(gè)濃度；以及四個(gè)時(shí)間長度對(duì)卵巢進(jìn)行干預(yù)，即離體卵巢預(yù)培養(yǎng)步驟的時(shí)間和解凍卵巢的后培養(yǎng)步驟的時(shí)間之和為3個(gè)小時(shí)、6個(gè)小時(shí)、12個(gè)小時(shí)或24個(gè)小時(shí)；以LH0.00IU濃度組為空白對(duì)照，干預(yù)后的卵巢常規(guī)脫水，石蠟包埋，行5μm石蠟切片，使用免疫組織化學(xué)法觀察LH干預(yù)對(duì)Survivin因子表達(dá)的影響，確定最佳的LH干預(yù)濃度和時(shí)間。結(jié)果見圖1和表1。

以上的結(jié)果顯示，LH濃度在0.15IU、干預(yù)時(shí)間為3小時(shí)，LH濃度在0.30IU、干預(yù)時(shí)間為6小時(shí)，LH濃度在0.15IU、干預(yù)時(shí)間為12小時(shí)，LH濃度在0.30IU、干預(yù)時(shí)間為12小時(shí)，LH濃度在0.60IU、干預(yù)時(shí)間為12小時(shí)，這五組試驗(yàn)結(jié)果顯示Survivin表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照；并且在LH濃度在0.30IU，干預(yù)時(shí)間為6小時(shí)和12小時(shí)時(shí)，Survivin表達(dá)水平最高。按照達(dá)到預(yù)定效果，選用最短時(shí)間和最小用藥劑量的原則，本技術(shù)確定LH最佳的干預(yù)濃度和時(shí)間為0.30IU和6小時(shí)。

在卵泡發(fā)育的過程中，涉及多個(gè)分子的正常表達(dá)，包括VEGF，Cx37，Cx43。其中VEGF是血管生成的誘導(dǎo)因子，可以促進(jìn)卵巢內(nèi)的血管生成和血流的貫通。Cx37，Cx43是卵巢細(xì)胞間縫隙連接蛋白的重要組成分子， Cx37在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間表達(dá)，而Cx43在顆粒細(xì)胞之間表達(dá)。這兩個(gè)分子在兩種細(xì)胞之間的物質(zhì)和信息的交流中發(fā)揮重要作用，是反應(yīng)卵泡發(fā)育的重要指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)二：LH對(duì)凍存卵巢卵泡比例的影響。

在卵巢中存在處于不同發(fā)育階段的各級(jí)卵泡，包括原始卵泡，初級(jí)卵泡，次級(jí)卵泡和竇卵泡，直接將卵巢組織凍存，然后解凍，并在體外培養(yǎng)，只有少數(shù)卵泡發(fā)育到排卵前卵泡，其他大部分卵泡會(huì)停止發(fā)育，形成閉鎖卵泡，這導(dǎo)致卵巢中的大部分卵泡在凍存過程中死亡，無法達(dá)到凍存卵巢并保留其生殖功能與內(nèi)分泌功能的效果。因此，對(duì)各級(jí)卵泡以及閉鎖卵泡數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，是評(píng)價(jià)凍存后卵巢中的卵泡發(fā)育情況的最基本，最為直觀的方法。使用C57小鼠的卵巢為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為三組：①對(duì)照組：無藥物干預(yù)，不凍存；②凍存對(duì)照組：無藥物干預(yù)，玻璃化凍存；③ LH干預(yù)凍存組：使用LH干預(yù)，玻璃化凍存。解凍的卵巢常規(guī)脫水，石蠟包埋，行5μm連續(xù)切片。每10張蠟片挑取一張進(jìn)行HE染色。顯微鏡下依據(jù)卵泡的形態(tài)，判斷卵泡的分級(jí)并計(jì)數(shù)（原始卵泡，初級(jí)卵泡，竇前卵泡和竇卵泡，同時(shí)判斷正常卵泡和閉鎖卵泡）。HE染色卵巢組織學(xué)結(jié)果見圖2，正常卵泡比例見圖3。以上結(jié)果可以看出，LH干預(yù)組卵巢形態(tài)完成，正常卵泡的比例明顯高于其他組；這說明，LH干預(yù)對(duì)卵泡具有保護(hù)作用，使多數(shù)的卵泡保持正常的組織學(xué)形態(tài)。

實(shí)驗(yàn)三：LH對(duì)凍存卵巢VEGF表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF在卵巢中的定位，Western-blot法檢測VEGF在卵巢中的表達(dá)。結(jié)果見圖4和圖5，可見，LH干預(yù)后，卵巢中VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果說明，LH干預(yù)，可促進(jìn)卵巢VEGF的表達(dá)，提示LH具有促進(jìn)血管生成的作用，增強(qiáng)了卵巢抵抗凍存和損傷的能力。

實(shí)驗(yàn)四：LH對(duì)凍存卵巢Cx37表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)方法檢測Cx37在卵巢中的定位，Western-blot法檢測Cx37在卵巢中的表達(dá)。結(jié)果見圖6和圖7，可見，LH干預(yù)后，卵巢中Cx37的表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果說明，LH干預(yù)，可促進(jìn)卵巢Cx37的表達(dá)，由于Cx37主要表達(dá)在卵泡顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間，因此，增強(qiáng)的Cx37的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的物質(zhì)和信息的交流，有利于卵泡的發(fā)育和存活，增強(qiáng)了卵巢抵抗凍存和損傷的能力。

實(shí)驗(yàn)五：LH對(duì)凍存卵巢Cx43表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)方法檢測Cx43在卵巢中的定位，Western-blot法檢測Cx43在卵巢中的表達(dá)。結(jié)果見圖8和圖9，可見，LH干預(yù)后，卵巢中Cx37的表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果說明，LH干預(yù)，可促進(jìn)卵巢Cx43的表達(dá)，由于Cx43主要表達(dá)在卵泡顆粒細(xì)之間，因此，增強(qiáng)的Cx43的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞之間的物質(zhì)和信息的交流，有利于卵泡的發(fā)育和存活，增強(qiáng)了卵巢抵抗凍存和損傷的能力。

綜上所述，LH干預(yù)能使凍存卵巢中的多數(shù)卵泡保持正常的組織學(xué)形態(tài)，促進(jìn)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間，以及顆粒細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的物質(zhì)和信息的交流，這些作用，可以提高卵巢抵抗凍存和損傷的能力，使經(jīng)過凍存、解凍的卵巢保留其生殖功能與內(nèi)分泌功能，使得卵巢中的卵子依舊具有功能。因此，使用黃體生成素干預(yù)卵巢玻璃化凍存、解凍的方法，是保護(hù)和恢復(fù)凍存卵巢生殖功能與內(nèi)分泌功能的有效方法。

以下是本文中英文簡寫的全稱和解釋說明。

LH：luteinizing hormone，黃體生成素，具有促進(jìn)排卵，形成黃體的作用。

Survivin：生存因子，具有促進(jìn)細(xì)胞和組織生存的作用。

VEGF：vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮生長因子，可促進(jìn)血管生成。

Cx37：Connexin37，縫隙連接蛋白37，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的物質(zhì)和信息通道。

Cx43：Connexin43，縫隙連接蛋白43，顆粒細(xì)胞之間的物質(zhì)和信息通道。

Cryopreservation：凍存。