本發(fā)明屬動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)綜合領(lǐng)域，具體涉及小鼠精子凍存液的配制。
背景技術(shù)：
：小鼠是目前使用數(shù)量最多、最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，大量的小鼠疾病模型需要保種和品系重建。但保存活體和代代相傳的辦法不僅消耗大量的人力、物力和財(cái)力，還有可能由于基因污染和基因飄移的原因?qū)е履Ｐ蛠G失，為此，采用精子凍存的方法進(jìn)行保種是人們青睞的保種技術(shù)。而精子凍存成功與否的衡量依賴(lài)于精子復(fù)蘇后體外受精情況。傳統(tǒng)的小鼠精子凍存方法由日本科學(xué)家Nakagata發(fā)明，凍存液由18％的棉籽糖和3％的脫脂奶粉組成，用于遠(yuǎn)交系小鼠能夠得到較好的凍存效果，但用于近交系，往往不能達(dá)到預(yù)期的效果，復(fù)蘇成活率和體外受精率較低，而大多遺傳工程小鼠模型的制作背景為C57BL/6近交系，使得遺傳工程小鼠種質(zhì)資源保存和品系重建技術(shù)遭遇瓶頸。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提出了一種小鼠精子凍存液(GMSCPA)，所述小鼠精子凍存液能夠優(yōu)化精子的能量代謝，增強(qiáng)免疫功能和抗氧化功能，從而能夠保護(hù)精子、保證其活力。本發(fā)明的小鼠精子凍存液包括：18％(w/v)的棉籽糖，3％(w/v)的脫脂奶粉，50‐150mM谷氨酰胺，其余為水。優(yōu)選地，所述小鼠精子凍存液包括：18％(w/v)的棉籽糖，3％(w/v)的脫脂奶粉，100mM谷氨酰胺，其余為水。其中，所述水為雙蒸水。谷氨酰胺是一種非必須氨基酸，由于是消化道粘膜上皮細(xì)胞代謝的必須營(yíng)養(yǎng)素，而成為重要的藥理營(yíng)養(yǎng)素，在維持胃腸道結(jié)構(gòu)的完整性方法起著非常重要的作用，特別是在感染和外傷的情況下，補(bǔ)充谷氨酰胺具有強(qiáng)烈的抗炎作用，廣泛用于消化道炎癥反應(yīng)的研究和輔助治療。在本發(fā)明中，由于谷氨酰胺的抗氧化作用，使得精子的體外受精率得到提高。一般來(lái)說(shuō)，維持動(dòng)物細(xì)胞的活力，添加還原型谷胱甘肽為比較直接的辦法，但發(fā)明者認(rèn)為，小鼠精子凍存液中添加一定劑量的谷氨酰胺應(yīng)該比直接添加谷胱甘肽更能使得谷胱甘肽的濃度維持動(dòng)態(tài)恒定水平，有利于精子活力的維持直到完成受精過(guò)程。傳統(tǒng)的小鼠精子凍存方法由日本科學(xué)家Nakagata發(fā)明，凍存液由18％的棉籽糖和3％的脫脂奶粉組成。用于遠(yuǎn)交系小鼠能夠得到較好的凍存效果，但用于近交系，往往不能達(dá)到預(yù)期的效果。小鼠精子凍存質(zhì)量評(píng)價(jià)的最有效方式為復(fù)蘇后的體外受精率。Nakagata發(fā)明的小鼠精子凍存液用于近交系C57BL/6小鼠，往往復(fù)蘇后體外受精率較低，不能達(dá)到預(yù)期的效果。由于近交系或以近交系為背景的基因工程小鼠生命力較弱，其精子活力相對(duì)較差，本發(fā)明的精子凍存液可以提供適量的谷氨酰胺，用于優(yōu)化精子的能量代謝，增強(qiáng)免疫功能和抗氧化功能，從而達(dá)到在精卵結(jié)合的整個(gè)過(guò)程中，精子都能夠保持其直線運(yùn)動(dòng)的精力和活力，完成與卵子的結(jié)合過(guò)程，并能夠繼續(xù)發(fā)育。本發(fā)明還提出了將所述小鼠精子凍存液的制備方法，包括低溫高速離心和除菌過(guò)濾等；具體包括：溶劑需使用雙蒸水，溶質(zhì)完全溶解后，進(jìn)行超速離心，4℃條件下12000-14000rpm，離心60-80min，過(guò)濾除菌，分裝備用即為所述小鼠精子凍存液。本發(fā)明還提出了將所述小鼠精子凍存液用于凍存小鼠精子中的應(yīng)用。用于小鼠模型資源的保存，品系重建、微生物學(xué)凈化，快速繁殖等方面。本發(fā)明還提出了凍存小鼠精子的方法，包括無(wú)菌取出剛剛死亡的小鼠附睪，在附睪上均勻鑿洞，置于CPA溶液中，使得精子全部從附睪中游出到CPA溶液中，在制備過(guò)程中，若小鼠年紀(jì)較大或因病理情況精子活力較弱，可采取擠壓附睪的方法，將附睪中的精子驅(qū)趕出來(lái)進(jìn)行凍存。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述凍存小鼠精子的方法包括：將剛剛死亡的小鼠附睪中的精子釋放入CPA液體中，37℃恒溫放置10min，使精子從附睪中完全游出，用麥管收集含有精子的CPA液，熱封口后，將麥管在液氮蒸汽中預(yù)冷3-5min，浸入液氮中長(zhǎng)期保存。其中，所述熱封口為利用酒精燈的外焰進(jìn)行。。本發(fā)明的有益效果在于：由于生物醫(yī)學(xué)研究的需要，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要制備或從國(guó)外進(jìn)口基因修飾小鼠，但制備或進(jìn)口的小鼠由于技術(shù)難度大、價(jià)格高，得到小鼠的數(shù)量有限，但用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的小鼠需要達(dá)到具有一定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)量才能進(jìn)行，由于自然繁殖的周期長(zhǎng)，采用精子凍存，多次實(shí)施體外受精的方法可以很快得到足夠數(shù)量的小鼠用于實(shí)驗(yàn)；科研工作結(jié)束后，這些小鼠往往會(huì)被采取安樂(lè)死，使得資源消失，采取精子凍存的方式，可以保存資源；同時(shí)，小鼠在生殖器外傷或?yàn)l臨死亡的情況下，也可以采取精子凍存的方式保存該資源；保存凍存的精子，還可以進(jìn)行反復(fù)多次的體外受精操作完成小鼠的微生物學(xué)凈化。本發(fā)明的小鼠精子凍存液(GMSCPA)能夠大大提高小鼠體外受精率，受精率達(dá)到70％以上；在一些具體的實(shí)施例中達(dá)到80-90％％。附圖說(shuō)明圖1為發(fā)明者所在實(shí)驗(yàn)室利用本方法保存小鼠精子的儲(chǔ)存液氮罐。圖2為液氮罐中凍精麥管放置情況。具體實(shí)施方式結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專(zhuān)門(mén)提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。以雙蒸水為基礎(chǔ)液，配制含有18％(w/v)的棉籽糖和3％(w/v)的脫脂奶粉溶液，加入谷氨酰胺配成50-150mM的溶液，充分溶解混勻后，12000rpm離心，取上清液過(guò)0.22um的過(guò)濾器過(guò)濾后，1ml分裝標(biāo)記為小鼠精子凍存液(GMSCPA)，冷凍保存?zhèn)溆谩?shí)施例1-4分別為含有不同濃度的谷氨酰胺的精子凍存液，分別標(biāo)記為A、B、C、D組，其中A組(對(duì)照組)的谷氨酰胺的濃度為零，為Nakagata發(fā)明的傳統(tǒng)小鼠精子凍存液，配制比例如下：表1不同組分的小鼠精子凍存液組分實(shí)施例1(A)實(shí)施例2(B)實(shí)施例3(C)實(shí)施例4(D)棉籽糖18％(w/v)18％(w/v)18％(w/v)18％(w/v)脫脂奶粉3％(w/v)3％(w/v)3％(w/v)3％(w/v)谷氨酰胺0mM50mM100mM150mM精子凍存：取12-14周齡的近交系小鼠C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌取出附睪尾，在附睪尾上用眼科剪剪碎，浸入1ml平衡至37℃的精子凍存液中，讓精子充分游出。5-7min后，分裝入250ul的麥管中，每管裝50-80ul，熱封口。在液氮蒸汽中放置3-5min預(yù)冷后，投入液氮中保存。精子復(fù)蘇：從液氮中取出精子凍存麥管，在空氣中搖動(dòng)15-30秒，投入37℃水浴中完全解凍30-60秒后，剪掉麥管封口，將精子吹入1ml體外受精液中，2500-3000rpm離心3-5min后，棄去上清，保留50ul液體，將精子吹散，檢查精子活動(dòng)力。直線運(yùn)動(dòng)、曲線運(yùn)動(dòng)或頭尾搖擺均為成活。表1應(yīng)用不同小鼠精子凍存液的復(fù)蘇成活率組別實(shí)施例1(A)實(shí)施例2(B)實(shí)施例3(C)實(shí)施例4(D)成活率50％50％70％65％每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)的次數(shù)為：A組重復(fù)10-20次；B組重復(fù)3次；C組重復(fù)200-300次，本實(shí)驗(yàn)室保存、復(fù)蘇的小鼠300多個(gè)品系均為利用C組凍存液實(shí)施；D組重復(fù)3次；其中，表1中為測(cè)定多次的平均值。卵子的獲得：取5-6周與雄鼠同品系的SPF級(jí)雌鼠，實(shí)驗(yàn)前3天注射PMSG(孕媽血清激素)30-50IU，48小時(shí)后注射HCG(人絨毛膜促性腺激素)25-40IU，14-16小時(shí)后，頸椎脫臼處死，打開(kāi)腹腔，分離輸卵管，體視顯微鏡下找到膨大部，釋放卵團(tuán)，將卵團(tuán)挑入100ul-200ul預(yù)熱的37℃體外受精液中，并洗滌2-3次，用礦物油覆蓋。置于37℃，二氧化碳5％的培養(yǎng)箱中。受精過(guò)程：取復(fù)蘇后的精子液10ul置于卵團(tuán)液中，置于37℃，二氧化碳5％的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，完成受精過(guò)程。受精卵的挑選：6-7小時(shí)后，將受精液滴置于顯微鏡下挑選，選得分散的卵子，移入礦物油覆蓋的100ul預(yù)熱至37℃的KSOM培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)20-22小時(shí)后，挑選發(fā)育至2-4細(xì)胞期胚胎進(jìn)行移植，并計(jì)算受精率。表2不同小鼠精子凍存液復(fù)蘇精子后的體外受精率實(shí)驗(yàn)組實(shí)施例1(A)實(shí)施例2(B)實(shí)施例3(C)實(shí)施例4(D)體外受精率5％30％75％50％每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)的次數(shù)為：A組重復(fù)10-20次；B組重復(fù)3次；C組重復(fù)200-300次，本實(shí)驗(yàn)室保存、復(fù)蘇的小鼠300多個(gè)品系均為利用C組凍存液實(shí)施；D組重復(fù)3次；其中，表2中為測(cè)定多次的平均值。由以上結(jié)果可知，使用傳統(tǒng)的小鼠精子凍存液用于近交系小鼠或基因工程小鼠精子凍存，盡管其復(fù)蘇成活率與B組相同，但復(fù)蘇后的體外受精率較低，往往不能獲得足夠數(shù)量的胚胎用于胚胎轉(zhuǎn)移，給近交系小鼠的保種工作帶來(lái)一定的困難，在小鼠精子凍存液中添加一定量的谷氨酰胺，對(duì)精子凍存和復(fù)蘇過(guò)程中能量的補(bǔ)充和還原精子凍存復(fù)蘇過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧，解除ROS對(duì)精子的毒害作用具有積極的意義，有利于精子活力的保持，得到較高的體外受精率，小鼠精子凍存的終極目的是為了保持資源，在需要的時(shí)候能夠復(fù)蘇進(jìn)行體外受精，為此，體外受精率是衡量精子凍存成功與否的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，小鼠精子凍存液中谷氨酰胺的添加量在100mM左右的受精效果最佳。本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3