本發(fā)明屬于化學(xué)組合物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種優(yōu)化的抗氧化脫細(xì)胞保護(hù)液及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

21世紀(jì)是生物科學(xué)全新發(fā)展日新月異的世紀(jì)，作為過(guò)去10年生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域冉冉升起的一顆朝陽(yáng)——TERM(Tissue engineering & Regenerative Medicine組織工程及再生醫(yī)學(xué))備受世界矚目。在TERM的研究和應(yīng)用中，相關(guān)脫細(xì)胞的技術(shù)占據(jù)了舉足輕重的地位。脫細(xì)胞是指生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域?qū)⒓?xì)胞外間充質(zhì)與細(xì)胞分離的過(guò)程，分離所得的細(xì)胞外間充質(zhì)支架可用于人造器官和組織再生。采用物理、化學(xué)、酶處理及三者的混合方法是目前世界范圍內(nèi)所普遍使用的脫細(xì)胞方法，其目的都是為保證脫細(xì)胞組織的細(xì)胞機(jī)構(gòu)的完整性和生物特性不受破壞，使之成為免疫原性低，具備良好生物相容性的理想生物材料。但脫細(xì)胞采用的方法往往耗時(shí)長(zhǎng)，條件劇烈，在脫細(xì)胞過(guò)程中難免對(duì)所脫細(xì)胞組織造成較大破壞。因此開(kāi)發(fā)一種保護(hù)措施(如保護(hù)液)保護(hù)好相關(guān)組織在脫細(xì)胞過(guò)程中的組織結(jié)構(gòu)完整性將填補(bǔ)這方面的空白。

目前臨床上的組織移植修復(fù)多應(yīng)用人工合成的高分子材料，往往存在自我降解性能低下，組織相容性差的問(wèn)題，生物工程材料如脫細(xì)胞眼結(jié)膜、血管和肌腱/韌帶等在臨床應(yīng)用方面非常迫切。因此取得組織結(jié)構(gòu)完整、生物特性不受破壞的生物工程材料對(duì)于臨床的應(yīng)用亦具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的抗氧化脫細(xì)胞保護(hù)液的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明所述的組織保護(hù)液其成分為：

1、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基粉末5-10g/L，配制成維持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分的母液；

2、L-組氨酸鹽酸鹽2.87-3.83g/L，使晶體滲透壓維持在330-380mOsm/kgH2O之間；

3、硫酸軟骨素25-30g/L，羥丙基甲基纖維素2-8g/L，低分子右旋糖酐20-35g/L，來(lái)維持其液體的膠體滲透壓為310-350mOsm/kg H₂O之間。由于硫酸軟骨素、羥丙基甲基纖維素和低分子右旋糖苷的協(xié)同作用，可以減少保護(hù)液中的負(fù)電荷，同時(shí)保持一定的膠體滲透壓，使脫細(xì)胞過(guò)程中，所脫細(xì)胞組織的內(nèi)外壓平衡；

4、別嘌呤醇0.5-0.8g/L，能夠減少脫細(xì)胞組織在缺氧狀態(tài)時(shí)的抗氧化功能；

5、HEPES緩沖液20-25ml/L，用以調(diào)節(jié)pH值為7.2-8.0；

6、鹽酸地塞米松1-2mg/L，還原型谷胱苷肽1.5-3g/L，以穩(wěn)定脫細(xì)胞組織的溶酶體膜及生物膜，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的抵御能力，更好地保持組織細(xì)胞的形態(tài)和功能；

7、左氧氟沙星0.1-0.2g/L，作為新一代的氟喹諾酮，可以同時(shí)殺滅供體攜帶的革藍(lán)氏陽(yáng)性和陰性的病原菌。

本發(fā)明所述的脫細(xì)胞組織保護(hù)液為淡紅色液體。

附圖說(shuō)明

圖1全程添加保存保護(hù)液的脫細(xì)胞眼結(jié)膜切片DAPI染色

圖2全程添加滅菌注射用水的脫細(xì)胞眼結(jié)膜切片DAPI染色

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，這些實(shí)施例只用于進(jìn)一步詳述說(shuō)明本發(fā)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)做出非本質(zhì)的調(diào)整需本發(fā)明方授權(quán)。

本發(fā)明的實(shí)施例1

抗氧化脫細(xì)胞保護(hù)液的制備：

1、取DMEM粉末10g加入去離子水500ml，溶解后高壓滅菌；

2、取硫酸軟骨素25g加入去離子水275ml加熱溶解高壓滅菌，制成硫酸軟骨素溶液；低分子右旋糖苷20g加入注射用水100ml溶解高壓滅菌，制成低分子右旋糖苷溶液；L-組氨酸鹽酸鹽2.87g，加入注射用水100ml溶解高壓滅菌，制成L-組氨酸鹽酸鹽溶液；

3、取無(wú)菌容器加入DMEM培養(yǎng)液500ml，高壓滅菌硫酸軟骨素275ml，低分子右旋糖酐溶液100ml，L-組氨酸鹽酸鹽溶液100ml；加入別嘌呤醇0.5g，羥丙基甲基纖維素5g，還原型谷胱苷肽2g，地塞米松注射液2mg，左氧氟沙星注射液0.1g混勻；

4、Hepes緩沖液調(diào)節(jié)PH值至7.4；

5、調(diào)節(jié)晶體滲透壓為340mOsm/kgH₂O；

6、調(diào)節(jié)膠體滲透壓為350mOsm/kgH₂O。

本發(fā)明的實(shí)施例2

使用脫細(xì)胞保護(hù)液對(duì)豬肌腱組織脫細(xì)胞的效果及組織結(jié)構(gòu)觀察及檢測(cè)

新鮮豬宰后3小時(shí)內(nèi)取出肌腱組織，無(wú)菌處理，將肌腱腱膜切開(kāi)做出1cm×2cm的組織片，取5片密封在盛有10ml實(shí)施例1所配保存液的塑料袋中；另對(duì)照組為5枚組織片密封在盛有10ml BSS的塑料袋中。于600MP高靜壓條件下，處理8次，每次時(shí)間為3分鐘；再將韌帶取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸鈉+1000U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為25℃，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理2小時(shí)；取出脫細(xì)胞肌腱置于保護(hù)液中漂洗2小時(shí)。對(duì)照組的酶與去垢劑和最后的漂洗處理均在BSS中進(jìn)行。

對(duì)制備的脫細(xì)胞肌腱/韌帶的組織結(jié)構(gòu)帶行染色。取脫細(xì)胞后的肌腱兩組標(biāo)本給予石蠟包埋，切片(5μm)、HE染色觀察。觀察細(xì)胞核成分(蘇木素染色)，膠原排列形態(tài)(伊紅染色)，與正常肌腱作比較?？焖倮鋬銮衅?，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美國(guó))熒光染色，檢測(cè)脫細(xì)胞程度。結(jié)果：脫細(xì)胞肌腱的組織切片中無(wú)DAPI陽(yáng)性染色，表明無(wú)DNA殘留。使用本脫細(xì)胞保護(hù)液保護(hù)的肌腱組織結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞脫除干凈。而對(duì)照組，經(jīng)脫細(xì)胞后組織水腫明顯，組織纖維排列紊亂。

本發(fā)明的實(shí)施例3

使用脫細(xì)胞保護(hù)液對(duì)眼結(jié)膜組織脫細(xì)胞的效果和組織結(jié)構(gòu)觀察及檢測(cè)

新鮮豬宰后2小時(shí)內(nèi)取出眼結(jié)膜組織，盡可能去除結(jié)膜下的組織，無(wú)菌處理，將眼結(jié)膜組織切成0.5cm×1cm的組織片，其中眼結(jié)膜組織5片密封在盛有10ml實(shí)施例1所配保存液的塑料袋中；另對(duì)照組為眼結(jié)膜組織5片密封在盛有10ml BSS的塑料袋中。于300MP高靜壓條件下，處理3次，每次時(shí)間為1分鐘；再將眼結(jié)膜組織取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸鈉+1000U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為25℃，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理1小時(shí)；取出脫細(xì)胞眼結(jié)膜置于保護(hù)液中漂洗1小時(shí)。對(duì)照組的酶與去垢劑和最后的漂洗處理均在BSS中進(jìn)行。

對(duì)制備的脫細(xì)胞眼結(jié)膜的組織結(jié)構(gòu)帶行染色。取脫細(xì)胞后的眼結(jié)膜組織兩組標(biāo)本給予石蠟包埋，切片(5μm)、HE染色觀察。觀察細(xì)胞核成分(蘇木素染色)，膠原排列形態(tài)(伊紅染色)，與正常眼結(jié)膜組織作比較。快速冷凍切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美國(guó))熒光染色，檢測(cè)脫細(xì)胞程度。結(jié)果：脫眼結(jié)膜的組織切片中無(wú)DAPI陽(yáng)性染色，表明無(wú)DNA殘留。使用本脫細(xì)胞保護(hù)液保護(hù)的肌腱和韌帶組織結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞脫除干凈。而對(duì)照組，經(jīng)脫細(xì)胞后眼結(jié)膜上皮脫落，組織纖維排列紊亂。

本發(fā)明的實(shí)施例4

使用脫細(xì)胞保護(hù)液對(duì)血管組織脫細(xì)胞的效果和結(jié)構(gòu)觀察及檢測(cè)

新鮮豬宰后4小時(shí)內(nèi)取出心臟動(dòng)脈血管組織，無(wú)菌處理，將血管組織切開(kāi)，鋪平為1X1.5cm的組織片，血管組織5片密封在盛有10ml的實(shí)施例1所配保護(hù)液的塑料袋中；另對(duì)照組為血管組織5片密封在盛有10ml BSS的塑料袋中。于500MP高靜壓條件下，處理5次，每次時(shí)間為5分鐘；再將血管組織取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸鈉+1000U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為25℃，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理2小時(shí)；取出血管組織置于保護(hù)液中漂洗2小時(shí)。對(duì)照組的酶與去垢劑和最后的漂洗處理均在BSS中進(jìn)行。

對(duì)制備的脫細(xì)胞血管的組織結(jié)構(gòu)帶行染色。取脫細(xì)胞后的血管組織，兩組標(biāo)本給予石蠟包埋，切片(5μm)、HE染色觀察。觀察細(xì)胞核成分(蘇木素染色)，膠原排列形態(tài)(伊紅染色)，與正常血管組織作比較。快速冷凍切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美國(guó))熒光染色，檢測(cè)脫細(xì)胞程度。結(jié)果：脫細(xì)胞血管的組織切片中無(wú)DAPI陽(yáng)性染色，表明無(wú)DNA殘留。使用本細(xì)胞保護(hù)液保護(hù)的血管組織結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞脫除干凈。而對(duì)照組，經(jīng)脫細(xì)胞后原有的血管組織結(jié)構(gòu)受損，纖維斷裂，水腫明顯。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。