本發(fā)明涉及一種綿羊顆粒凍精的一體化裝置及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

精液的冷凍保存在現(xiàn)代畜牧業(yè)中起著十分重要作用。凍精的使用可最大限度提高優(yōu)良種畜的利用率，同時(shí)在品種改良，瀕危動(dòng)物保護(hù)上也具有極其重要意義。

從世界范圍看，綿羊精子冷凍技術(shù)研究進(jìn)展緩慢，主要在冷凍程序、稀釋液配方、和授精方法幾方面存在技術(shù)問(wèn)題，導(dǎo)致綿羊凍精的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用無(wú)法推廣。由于綿羊精液冷凍具有潛在的巨大商業(yè)價(jià)值和重要的現(xiàn)實(shí)意義，因此，凍精制作工藝的改進(jìn)創(chuàng)新具有研究的重要性和必要性，目前仍是動(dòng)物繁殖領(lǐng)域內(nèi)研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

凍精的制作主要有兩種方法：顆粒凍精和細(xì)管凍精。雖然細(xì)管凍精是目前產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的主流方法，技術(shù)也相對(duì)成熟，但綿羊凍精生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于高度市場(chǎng)化、產(chǎn)業(yè)化的牛凍精；綿羊凍精產(chǎn)業(yè)化程度低，這主要由市場(chǎng)、技術(shù)等因素所決定，市面上并不能或很難購(gòu)買到商品化綿羊細(xì)管凍精。目前，綿羊冷配仍多以自行冷凍的顆粒或細(xì)管凍精，以顆粒凍精為主。與細(xì)管凍精的制作相比較，顆粒凍精方法具有操作簡(jiǎn)單、冷凍時(shí)間短、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。但仍存在以下缺陷：1、無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的顆粒凍精制作與儲(chǔ)存裝置，基本都是就地取材；凍精儲(chǔ)存不科學(xué)，容易造成顆粒表面脫落。2、冷凍和保存需要單獨(dú)操作，無(wú)法對(duì)顆粒一對(duì)一信息標(biāo)記；3、凍精顆粒大小、形狀不規(guī)范，顆粒間凍精活力差異大，重復(fù)性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有制作綿羊顆粒凍精存在儲(chǔ)存不科學(xué)、信息標(biāo)記困難、顆粒不規(guī)則和易破損的問(wèn)題，而提供一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置及其應(yīng)用方法。

本發(fā)明一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置，它由冷凍氟板、冷凍支架、冷凍托架和保存提漏四部分組成；

所述冷凍氟板：邊長(zhǎng)5cm、厚度0.1cm的正方形，冷凍氟板的四角分別設(shè)置直徑0.2cm的穿孔，穿孔的中心距離邊距1cm，冷凍氟板的中央平均分布16個(gè)直徑為0.25cm的半球型冷凍槽；冷凍氟板厚度為0.1cm，底部設(shè)置高度0.1cm的底座；半球型冷凍槽與冷凍氟板邊間、半球型冷凍槽之間覆蓋單面膠紙；

冷凍支架：支架鐵芯高20cm，四根支架鐵芯分別從冷凍氟板的穿孔穿過(guò)；支架鐵芯最高點(diǎn)記為第0cm，在第18cm處焊接固定裝置；

冷凍托架：托架高8cm，邊長(zhǎng)4cm，四根托架的頂端分別設(shè)置支架插槽，底端設(shè)置微型腳托；

冷凍提漏：提漏高20cm，邊長(zhǎng)6cm，底部密封；提漏提手總長(zhǎng)度50cm，提漏提手的底部10cm的長(zhǎng)度用于焊接在提漏外側(cè)面中間位置，其余40cm長(zhǎng)度高出提漏，并在提漏提手的頂端設(shè)置掛鉤。

上述綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置的應(yīng)用方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、利用假陰道方法收集綿羊精液，然后用預(yù)熱至40℃的冷凍稀釋液進(jìn)行2倍的稀釋；

二、冷凍：將步驟一稀釋后的綿羊精液樣品裹8-10層紗布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡過(guò)程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷凍托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架鐵芯插入支架插槽；

在第一塊冷凍氟板的單面膠紙上標(biāo)記待冷凍精液信息，用鑷子夾著第一塊冷凍氟板穿過(guò)支架鐵芯固定于18cm處的固定裝置，此位置距離液氮面4cm，預(yù)冷3-5min后，用250μL移液器在每個(gè)半球型冷凍槽中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二塊冷凍氟板的單面膠紙上標(biāo)記待冷凍精液信息，置于第一塊冷凍氟板上；預(yù)冷3-5min后，用250μL移液器在每個(gè)半球型冷凍槽中滴入0.1mL平衡后的精液，重復(fù)操作至放入第5塊氟板后，添加液氮，重新校對(duì)液氮面與待滴定冷凍氟板高度至4cm，重復(fù)滴入精液疊加冷凍氟板的步驟至距離支架鐵芯頂端1cm處結(jié)束，液氮熏蒸5min，然后用大鑷子把帶有冷凍氟板的冷凍支架從冷凍托架中提出，放入裝滿液氮的冷凍提漏中，提漏掛置于裝滿液氮的罐口；

三、解凍：在液氮中提出冷凍提漏，上提冷凍支架，然后用鑷子捏取凍精顆粒，在空氣中停留20s，平行的浸入40℃解凍液中10s，搖動(dòng)至融化，完成解凍；

其中步驟一中冷凍稀釋液由94mL基礎(chǔ)稀釋液和6mL甘油組成；基礎(chǔ)稀釋液按體積比80:20由基礎(chǔ)液和卵黃組成，所述基礎(chǔ)液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成；

步驟三中解凍液按體積比80:20由基礎(chǔ)液和卵黃組成，所述基礎(chǔ)液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成。

本發(fā)明與傳統(tǒng)凍精顆粒冷凍裝置和方法相比，優(yōu)點(diǎn)如下：

1、本發(fā)明集冷凍與保存一體化，凍精制作步驟簡(jiǎn)化、規(guī)范，精液信息詳細(xì)。顆粒凍精制作的傳統(tǒng)方法通常是在鋁飯盒蓋子上滴定精液，普遍存在劑型規(guī)格不標(biāo)準(zhǔn)的缺陷，需要重新收集后存放于紗布袋，再放入液氮，無(wú)法標(biāo)記。本發(fā)明在精子冷凍完成后，無(wú)需重新收集，直接放入液氮，并且在冷凍氟板標(biāo)記精液詳細(xì)信息。凍精顆粒大小、形態(tài)規(guī)則。

2、顆粒凍精制作的傳統(tǒng)方法，在冷凍后將顆粒收集在紗布袋中，由于儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中，顆粒間碰撞和摩擦，表面脫落嚴(yán)重，剝落的細(xì)微顆粒和碎片，懸浮在液氮中，極易造成品種混雜的現(xiàn)象。本發(fā)明完全克服這一缺點(diǎn)，顆粒間無(wú)直接接觸。

3、本發(fā)明凍精顆粒容量大，裝置所采用材料均為普通金屬，成本低廉。按上述冷凍裝置規(guī)格，冷凍精液體積：144mL＝16(孔/氟板)×0.1(mL精液/孔)×90(片氟板/18cm)，每套冷凍支架可冷凍精液公羊只數(shù)：72只＝144mL÷2(冷凍前稀釋2倍)÷1mL(平均射精量1mL/只)。

4、本發(fā)明顯著降低冷凍保護(hù)劑毒性影響。目前，無(wú)論是細(xì)管凍精還是顆粒凍精，均采用6％-8％的甘油作為冷凍保護(hù)劑冷凍。本發(fā)明在冷凍前，采用0.1mL 6％甘油濃度的冷凍液稀釋，解凍時(shí)采用0.2mL無(wú)甘油解凍液再次稀釋，甘油終濃度為1.5％，有效降低了甘油的毒性危害。

5、由于市面液氮罐口徑大小不一，本裝置型號(hào)可根據(jù)液氮罐口徑靈活定制；另外，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，基層技術(shù)人員可迅速完全掌握，無(wú)需專門培訓(xùn)。

6、社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益：

本發(fā)明主要應(yīng)用于綿羊精液的超低溫冷凍保存。隨著養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，綿羊凍精在迅速擴(kuò)群、雜交改良上的應(yīng)用越來(lái)越重要，因此本發(fā)明具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)與此相同的裝置。

目前全國(guó)從事綿羊生產(chǎn)的公司和機(jī)構(gòu)，普遍存在擴(kuò)繁速度緩慢，品種改良困難的問(wèn)題，綿羊凍精無(wú)法推廣應(yīng)用是關(guān)鍵原因。近年來(lái)，綿羊精液冷凍方面的研究也沒(méi)有得到足夠的重視，通過(guò)改進(jìn)冷凍方案和冷凍裝置提高凍精品質(zhì)勢(shì)在必行。因此本發(fā)明具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益、良好的社會(huì)效益和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明對(duì)改善綿羊凍精品質(zhì)、推動(dòng)凍精產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義，可顯著提高優(yōu)良公畜的利用率、減少飼養(yǎng)量，尤其是在中小規(guī)模羊場(chǎng)、養(yǎng)殖散戶以及放牧模式下具有更大利用空間，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明中綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置中冷凍氟板的示意圖，其中1表示穿孔，2表示半球型冷凍槽，3表示底座，4表示單面膠紙；

圖2是本發(fā)明中綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置中冷凍氟板、冷凍支架與冷凍托架的示意圖，其中5表示支架鐵芯，6表示托架，7表示支架插槽，8表示微型腳托；

圖3是本發(fā)明中綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置中冷凍提漏的示意圖，其中9表示提漏，10表示提漏提手，11表示掛鉤。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。

具體實(shí)施方式一：結(jié)合圖1、2和3所示，本實(shí)施方式一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置，它由冷凍氟板、冷凍支架、冷凍托架和保存提漏四部分組成；

所述冷凍氟板：邊長(zhǎng)5cm、厚度0.1cm的正方形，冷凍氟板的四角分別設(shè)置直徑0.2cm的穿孔1，穿孔1的中心距離邊距1cm，冷凍氟板的中央平均分布16個(gè)直徑為0.25cm的半球型冷凍槽2；冷凍氟板厚度為0.1cm，底部設(shè)置高度0.1cm的底座3；半球型冷凍槽2與冷凍氟板邊間、半球型冷凍槽2之間覆蓋單面膠紙4；

冷凍支架：支架鐵芯5高20cm，四根支架鐵芯5分別從冷凍氟板的穿孔1穿過(guò)；支架鐵芯5最高點(diǎn)記為第0cm，在第18cm處焊接固定裝置；

冷凍托架：托架6高8cm，邊長(zhǎng)4cm，四根托架6的頂端分別設(shè)置支架插槽7，底端設(shè)置微型腳托8；

冷凍提漏：提漏9高20cm，邊長(zhǎng)6cm，底部密封；提漏提手10總長(zhǎng)度50cm，提漏提手10的底部10cm的長(zhǎng)度用于焊接在提漏9外側(cè)面中間位置，其余40cm長(zhǎng)度高出提漏9，并在提漏提手10的頂端設(shè)置掛鉤11。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述半球型冷凍槽2用于滴定待冷凍的精液。其它與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是，所述冷凍氟板的底座3用于是防止冷凍過(guò)程中相鄰的兩塊冷凍氟板大面積接觸而產(chǎn)生粘連。其它與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是，所述單面膠紙4用于記錄精液信息。其它與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是，所述掛鉤11用于固定在液氮罐口。其它與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是，所述固定裝置用于固定安裝冷凍氟板，冷凍氟板可依次疊加安裝。其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至六之一不同的是，所述支架插槽7用于支架鐵芯5的插拔。其它與具體實(shí)施方式一至六之一相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置的應(yīng)用方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、利用假陰道方法收集綿羊精液，然后用預(yù)熱至40℃的冷凍稀釋液進(jìn)行2倍的稀釋；

二、冷凍：將步驟一稀釋后的綿羊精液樣品裹8-10層紗布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡過(guò)程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷凍托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架鐵芯5插入支架插槽7；

在第一塊冷凍氟板的單面膠紙4上標(biāo)記待冷凍精液信息，用鑷子夾著第一塊冷凍氟板穿過(guò)支架鐵芯5固定于18cm處的固定裝置，此位置距離液氮面4cm，預(yù)冷3-5min后，用250μL移液器在每個(gè)半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二塊冷凍氟板的單面膠紙4上標(biāo)記待冷凍精液信息，置于第一塊冷凍氟板上；預(yù)冷3-5min后，用250μL移液器在每個(gè)半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液，重復(fù)操作至放入第5塊氟板后，添加液氮，重新校對(duì)液氮面與待滴定冷凍氟板高度至4cm，重復(fù)滴入精液疊加冷凍氟板的步驟至距離支架鐵芯5頂端1cm處結(jié)束，液氮熏蒸5min，然后用大鑷子把帶有冷凍氟板的冷凍支架從冷凍托架中提出，放入裝滿液氮的冷凍提漏中，提漏掛置于裝滿液氮的罐口；

三、解凍：在液氮中提出冷凍提漏，上提冷凍支架，然后用鑷子捏取凍精顆粒，在空氣中停留20s，平行的浸入40℃解凍液中10s，搖動(dòng)至融化，完成解凍；

其中步驟一中冷凍稀釋液由94mL基礎(chǔ)稀釋液和6mL甘油組成；基礎(chǔ)稀釋液按體積比80:20由基礎(chǔ)液和卵黃組成，所述基礎(chǔ)液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成；

步驟三中解凍液按體積比80:20由基礎(chǔ)液和卵黃組成，所述基礎(chǔ)液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成。

本實(shí)施方式步驟二中預(yù)冷3-5min后冷凍氟板的溫度達(dá)到-120℃—-130℃。

本實(shí)施方式中上提冷凍支架必須保證冷凍提漏中裝滿液氮。

本實(shí)施方式中平行的浸入是指凍精顆粒的上、下表面與解凍液面平行。

本實(shí)施方式中解凍完成后將冷凍氟板從冷凍支架取出，去除單面膠紙，清洗消毒，備于下次使用。

具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式八不同的是，步驟二中每一塊使用的冷凍氟板的單面膠紙4上均要標(biāo)記待冷凍精液信息；標(biāo)記待冷凍精液信息為公羊品種、公羊耳標(biāo)號(hào)和冷凍日期。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式八相同。

具體實(shí)施方式十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式八或九不同的是，步驟三解凍液中精子的終濃度為原精稀釋6倍。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式八或九相同。

采用以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

實(shí)施例：

結(jié)合圖1、2和3所示，本實(shí)施方式一種綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置，它由冷凍氟板、冷凍支架、冷凍托架和保存提漏四部分組成；

所述冷凍氟板：邊長(zhǎng)5cm、厚度0.1cm的正方形，冷凍氟板的四角分別設(shè)置直徑0.2cm的穿孔1，穿孔1的中心距離邊距1cm，冷凍氟板的中央平均分布16個(gè)直徑為0.25cm的半球型冷凍槽2；冷凍氟板厚度為0.1cm，底部設(shè)置高度0.1cm的底座3；半球型冷凍槽2與冷凍氟板邊間、半球型冷凍槽2之間覆蓋單面膠紙4；

冷凍支架：支架鐵芯5高20cm，四根支架鐵芯5分別從冷凍氟板的穿孔1穿過(guò)；支架鐵芯5最高點(diǎn)記為第0cm，在第18cm處焊接固定裝置；

冷凍托架：托架6高8cm，邊長(zhǎng)4cm，四根托架6的頂端分別設(shè)置支架插槽7，底端設(shè)置微型腳托8；

冷凍提漏：提漏9高20cm，邊長(zhǎng)6cm，底部密封；提漏提手10總長(zhǎng)度50cm，提漏提手10的底部10cm的長(zhǎng)度用于焊接在提漏9外側(cè)面中間位置，其余40cm長(zhǎng)度高出提漏9，并在提漏提手10的頂端設(shè)置掛鉤11。

綿羊顆粒凍精的制作-保存一體化裝置的應(yīng)用方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、利用假陰道方法收集綿羊精液，然后用預(yù)熱至40℃的冷凍稀釋液進(jìn)行2倍的稀釋；

二、冷凍：將步驟一稀釋后的綿羊精液樣品裹8層紗布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡過(guò)程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷凍托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架鐵芯5插入支架插槽7；

在第一塊冷凍氟板的單面膠紙4上標(biāo)記待冷凍精液信息，用鑷子夾著第一塊冷凍氟板穿過(guò)支架鐵芯5固定于18cm處的固定裝置，此位置距離液氮面4cm，預(yù)冷3min后，用250μL移液器在每個(gè)半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二塊冷凍氟板的單面膠紙4上標(biāo)記待冷凍精液信息，置于第一塊冷凍氟板上；預(yù)冷3-5min后，用250μL移液器在每個(gè)半球型冷凍槽2中滴入0.1mL平衡后的精液，重復(fù)操作至放入第5塊氟板后，添加液氮，重新校對(duì)液氮面與待滴定冷凍氟板高度至4cm，重復(fù)滴入精液疊加冷凍氟板的步驟至距離支架鐵芯5頂端1cm處結(jié)束，液氮熏蒸5min，然后用大鑷子把帶有冷凍氟板的冷凍支架從冷凍托架中提出，放入裝滿液氮的冷凍提漏中，提漏掛置于裝滿液氮的罐口；

三、解凍：在液氮中提出冷凍提漏，上提冷凍支架，然后用鑷子捏取凍精顆粒，在空氣中停留20s，平行的浸入40℃解凍液中10s，搖動(dòng)至融化，完成解凍；

其中步驟一中冷凍稀釋液由94mL基礎(chǔ)稀釋液和6mL甘油組成；基礎(chǔ)稀釋液按體積比80:20由基礎(chǔ)液和卵黃組成，所述基礎(chǔ)液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成；

步驟三中解凍液按體積比80:20由基礎(chǔ)液和卵黃組成，所述基礎(chǔ)液由3.2g葡萄糖、3.2g檸檬酸鈉、10IU青霉素和10IU鏈霉素溶于100mL超純水制成。

本實(shí)施例步驟二中預(yù)冷3min后冷凍氟板的溫度達(dá)到-120℃。

本實(shí)施例中上提冷凍支架必須保證冷凍提漏中裝滿液氮。

本實(shí)施例中平行的浸入是指凍精顆粒的上、下表面與解凍液面平行。

本實(shí)施例中解凍完成后將冷凍氟板從冷凍支架取出，去除單面膠紙，清洗消毒，備于下次使用。

本實(shí)施例中集冷凍與保存一體化，凍精制作步驟簡(jiǎn)化、規(guī)范，精液信息詳細(xì)。凍精顆粒大小、形態(tài)規(guī)則。顆粒間無(wú)直接接觸，不會(huì)造成品種混雜的現(xiàn)象。