本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使感染沃爾巴克菌(Wolbachia，wPip)白紋伊蚊雌蚊不育的方法。

背景技術(shù)：
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沃爾巴克菌(Wolbachia)是一種具有母性垂直遺傳的胞內(nèi)革蘭氏陰性共生菌，自然界約有40％的節(jié)肢動(dòng)物攜帶了該菌群。它們能夠調(diào)控宿主生殖功能，如誘導(dǎo)宿主發(fā)生胞質(zhì)不親和(Cytoplasmic incompatibility,CI)。CI是指受精子和卵子的細(xì)胞質(zhì)無(wú)法相容，導(dǎo)致胚胎不能正常發(fā)育，出現(xiàn)早期死亡。當(dāng)感染沃爾巴克菌雄蟲(chóng)與沒(méi)有感染或者感染不同類(lèi)型雌蟲(chóng)交配后，便會(huì)誘導(dǎo)CI。因此，一種基于該共生菌控制害蟲(chóng)和疾病媒介的策略，也叫胞質(zhì)不相容技術(shù)(Incompatible insect technique,IIT)，已被逐漸認(rèn)可。IIT是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的生物防控方法，主要通過(guò)大量釋放攜帶沃爾巴克雄性昆蟲(chóng)到野外中，與正常雌性昆蟲(chóng)交配，產(chǎn)生的后代無(wú)法孵育，降低甚至局部消滅目標(biāo)昆蟲(chóng)種群數(shù)量(也叫種群壓制策略)。在1967年，首次利用該技術(shù)成功地完全壓制住緬甸當(dāng)?shù)匾粋€(gè)村莊的庫(kù)蚊種群(絲蟲(chóng)病傳播媒介)。

胞質(zhì)不相容技術(shù)(IIT)主要包括昆蟲(chóng)大規(guī)模飼養(yǎng)，雌雄分離，運(yùn)輸，野外釋放和監(jiān)測(cè)等重要過(guò)程。其中雌雄分離對(duì)于IIT至關(guān)重要，不僅能夠減低昆蟲(chóng)飼養(yǎng)費(fèi)用，還可以提高野外種群壓制效率。而對(duì)于蚊蟲(chóng)IIT，意外釋放一定量攜帶新型沃爾巴克菌雌蚊到野外中可能會(huì)引起種群替換。目前常用的蚊蟲(chóng)雌雄分離方法包括建立雌雄分離株(Genetic Sex Strain,GSS)、毒性血餐和物理分離(最后需輔助人工剔除殘留的雌蚊)。首個(gè)蚊蟲(chóng)雌雄分離株在阿拉伯按蚊上成功構(gòu)建，然而由于該蚊株的不穩(wěn)定性以及對(duì)宿主的適合度影響較大，已經(jīng)放棄使用。第二種分離方法是在血餐中加入伊維菌素(Ivermectin)，雌蚊吸過(guò)血之后會(huì)死亡，雄蚊由于不吸血而存活下來(lái)，但該方法去雌效率低下，并且會(huì)延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間(必須等雌蚊到吸血時(shí)間，通常需3-4天)。而物理分離方法是依靠雌雄蛹的大小不同進(jìn)行分離，對(duì)于伊蚊屬(如白紋伊蚊，埃及伊蚊和波利尼西亞伊蚊)，該蚊種存在著雄性先成熟和雌雄個(gè)體大小差異的情況，通過(guò)控制飼養(yǎng)密度、幼蟲(chóng)飼料和分離時(shí)間，再通過(guò)一種叫Fay-Morlan的分離器調(diào)整間隙大小，可以將幼蟲(chóng)、雌、雄蛹分別分離出來(lái)，分離效率高達(dá)99％以上。對(duì)于蚊蟲(chóng)IIT技術(shù)，目前并沒(méi)有數(shù)據(jù)表明這1％雌蚊是否會(huì)影響種群壓制效果，甚至導(dǎo)致種群替換。因此剩余的1％雌蚊在釋放前需依靠人工去雌，但是這種方法效率低下，無(wú)法適用于大規(guī)模運(yùn)用。因此必須尋找一種快速讓雌蚊不育的方法，讓這1％的雌蚊即使到自然界中，也無(wú)法進(jìn)行繁殖生育，消除種群替換的潛在威脅。

對(duì)于白紋伊蚊，目前通過(guò)胚胎顯微注射已經(jīng)建立起一種新型沃爾巴克菌(wPip)感染蚊株，該株雄蚊與野生雌蚊交配時(shí)可以誘導(dǎo)完全CI，被認(rèn)為是用來(lái)控制野生白紋伊蚊種群的蚊種之一。由于目前并沒(méi)有白紋伊蚊的雌雄分離株，在野外釋放之前必須將通過(guò)分離器后殘留的雌蚊一只只挑選出來(lái)，消除種群替代的威脅，然而，人工去雌的效率低下，無(wú)法適用于大規(guī)模運(yùn)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種能大大提高生產(chǎn)效率，適于大規(guī)模運(yùn)用的使感染新型沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊不育的方法。

本發(fā)明的使感染新型沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊不育的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將白紋伊蚊雌蛹或含有白紋伊蚊雌蛹的白紋伊蚊雄蛹置于X射線下照射，使得白紋伊蚊雌蛹不育。

優(yōu)選，所述的白紋伊蚊雌蛹的蛹齡小于等于24小時(shí)，白紋伊蚊雌蛹數(shù)目或白紋伊蚊雌蛹和白紋伊蚊雄蛹總數(shù)目在一千個(gè)以?xún)?nèi)時(shí)，其X射線照射劑量大于等于28Gy，從而使白紋伊蚊雌蛹不育。

優(yōu)選，所述的白紋伊蚊雌蛹的蛹齡為4-40小時(shí)，白紋伊蚊雌蛹數(shù)目或白紋伊蚊雌蛹和白紋伊蚊雄蛹總數(shù)目在10～30萬(wàn)個(gè)時(shí)，其X射線照射劑量大于等于60Gy，從而使白紋伊蚊雌蛹不育。

一種使感染新型沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊不育的方法，其包括人工建立感染沃爾巴克菌白紋伊蚊蚊株、大規(guī)模飼養(yǎng)蚊蟲(chóng)、使用分離器初步分離蚊幼蟲(chóng)、雌蛹和雄蛹、使用X射線照射收集到的雄蛹，使混在雄蛹中的雌蛹不育、將輻射后的蚊蟲(chóng)運(yùn)輸至釋放點(diǎn)，按照釋放策略進(jìn)行釋放并進(jìn)行效果監(jiān)測(cè)。

本發(fā)明采用X射線在白紋伊蚊蛹期進(jìn)行輻射，從而使雌蚊無(wú)法產(chǎn)生后代，消除由意外釋放感染新型沃爾巴克菌雌蚊所導(dǎo)致的種群替換威脅。相比傳統(tǒng)人工去雌的方法，本發(fā)明是一種快速有效地使雌蚊不育的方法，大大提高生產(chǎn)效率，適合于大規(guī)模生產(chǎn)運(yùn)用。

附圖說(shuō)明：

圖1是在顯微鏡下觀察的白紋伊蚊雌蛹和雄蛹；

圖2是輻射或無(wú)輻射感染沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊入侵野生種群的流程圖；

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

一、快速鑒定白紋伊蚊雌、雄蛹包括以下步驟：

(1)在感染沃爾巴克菌白紋伊蚊幼蟲(chóng)發(fā)育至蛹期，使用巴氏吸管將蛹挑出放至到培養(yǎng)皿上，將蛹周?chē)乃治簦缓笤隗w式解剖鏡下觀察蛹的尾部。如圖1，尾器短的為雌蛹(圖左)，長(zhǎng)的則為雄蛹(圖右)。

二、輻射后雌蚊的不育評(píng)價(jià)：

(1)在顯微鏡下分離出雌蛹后(蛹齡為4-24小時(shí))，將雌蛹放置在輻射盤(pán)中間，然后使用X射線輻射儀(RS 2400)進(jìn)行照射(0，23，26，28，32，40Gy)，每次輻射約50頭雌蛹。輻射完之后，將輻射過(guò)的雌蛹與沒(méi)有進(jìn)行輻射的雄蛹按照1:1的比例放置在干凈的籠子中。

(2)待所有的蚊蛹全部羽化之后，給成蚊提供10％的葡萄糖溶液。4到5天之后，給予雌蚊提供血餐。

(3)將飽餐后的雌蚊單獨(dú)挑出，轉(zhuǎn)移到帶有少量水跟濕潤(rùn)的產(chǎn)卵紙的透明塑料管中，一只雌蚊一個(gè)管，并塞上海綿，防止蚊蟲(chóng)在產(chǎn)卵期間逃逸。

(4)3天之后，將產(chǎn)完卵的雌蚊從產(chǎn)卵管中移出，收集單個(gè)雌蚊的產(chǎn)卵紙，干燥，6到7天之后進(jìn)行孵化。24小時(shí)之后，在體式解剖鏡下計(jì)算單雌的產(chǎn)卵總數(shù)和卵破殼數(shù)，記錄產(chǎn)卵量和卵孵化率。結(jié)果如表1所示：

表1小規(guī)模照射不同輻射劑量對(duì)感染沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊產(chǎn)卵量和卵孵化率影響(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

由表1可以看出，當(dāng)劑量大于等于28Gy后，雌蚊產(chǎn)卵率為0，完全不育。

三、輻射后雌蚊的種群替代評(píng)價(jià)步驟：

(1)飼養(yǎng)野生株白紋伊蚊至成蚊，隨機(jī)挑選出50只4-5日齡的雌、雄野生株成蚊(F₀代)，轉(zhuǎn)移至新的籠子中，喂以血餐后，往籠子中添加步驟二的20只輻射過(guò)X射線且不產(chǎn)卵的絕育的沃爾巴克菌感染飽血后的雌蚊或無(wú)輻射的沃爾巴克菌感染飽血后的雌蚊，2天之后往籠子中放置產(chǎn)卵杯。3天之后將產(chǎn)卵杯取出，卵干燥后，放置7天后，將卵全部孵化。

(2)將上述幼蟲(chóng)飼養(yǎng)至成蛹，隨機(jī)挑選50只雌、雄蛹重新建立種群(F₁代)。待蚊蟲(chóng)羽化4-5天之后，喂予血餐，每周一次，共計(jì)四周，每周分別收集F₂代卵(第一至四周)。待F₁代雌蚊產(chǎn)完卵之后，隨機(jī)挑選10只成蚊，提取其基因組DNA，設(shè)計(jì)檢測(cè)沃爾巴克菌(wPip)的噬菌體WO的locus(orf7)基因引物，序列為：orf7-cf:CCCACATGAGCCAATGACGTCTG；orf7-cr:TTGCTTGCAACACTT ACACTT，進(jìn)行PCR檢測(cè)沃爾巴克菌是否入侵野生種群，連續(xù)監(jiān)測(cè)兩代，具體操作見(jiàn)圖2。PCR反應(yīng)體系為(20μL)，PCR Master Mix 10μL，上下游引物各1μL(10μM)，DNA模板1μL和水7μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃(5mins)；95℃(30s)，52℃(30s)，72℃(45s)，35個(gè)循環(huán)；72℃(10mins)。PCR結(jié)束后，取6μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳(1.5％)。

結(jié)果如表2所示

表2輻射和無(wú)輻射感染沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊入侵野生種群的評(píng)價(jià)：

wPip在F₁和F₂代蚊蟲(chóng)中的感染率(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

從表2可以看出，F(xiàn)₁和F₂代有檢測(cè)到陽(yáng)性感染wPip的雌蚊，可以得出沒(méi)有經(jīng)過(guò)輻射的白紋伊蚊雌蚊可以將沃爾巴克菌(wPip)傳播到野生種群中。而經(jīng)過(guò)輻射后，在后代的檢測(cè)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性，說(shuō)明輻射后雌蚊無(wú)法產(chǎn)卵，從而無(wú)法將陽(yáng)性wPip菌傳給野生種群中，消除了種群替換的可能性。

實(shí)施例2：

一、輻射后雌蚊的不育評(píng)價(jià)：

(1)大規(guī)模飼養(yǎng)感染沃爾巴克菌白紋伊蚊幼蟲(chóng)至蛹期(4-40小時(shí))，然后使用Fay-Morlan分離器初步分離雌、雄蛹。取雄蛹約6-7萬(wàn)只，混入0.5萬(wàn)只雌蛹，然后將蛹集中在輻射杯中，使用X射線輻射儀(Wolbaki射線儀)進(jìn)行照射(0，40，50和60Gy)。輻射完之后，重新使用分離器將雌雄蛹分離出來(lái)，將輻射過(guò)的雌蛹與沒(méi)有進(jìn)行輻射的雄蛹按照約1000:400的比例放置在干凈的籠子中。

(2)待所有的蚊蛹全部羽化之后，給成蚊提供10％的葡萄糖溶液。4到5天之后，給予雌蚊提供血餐。血餐后48小時(shí)放入產(chǎn)卵杯，收集蚊卵48小時(shí)。接著給予雌蚊第二次血餐，放產(chǎn)卵杯跟收卵時(shí)間與前面操作一致。收集到的卵干燥后，放置7天。然后把收集到的卵進(jìn)行孵化，24小時(shí)后計(jì)算產(chǎn)卵總數(shù)和卵孵化率。

結(jié)果如表3所示

表3大規(guī)模照射不同輻射劑量對(duì)感染沃爾巴克菌白紋伊蚊雌蚊產(chǎn)卵量和卵孵化率影響(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

從表3可以看出，在大規(guī)模運(yùn)用中，當(dāng)輻射劑量為60Gy時(shí)候，可以完全使混在雄蛹中的雌蛹完全不育。