本申請涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及斑馬魚用于人類白血病的發(fā)病機理研究及其大規(guī)模藥物篩選的用途。

背景技術(shù)：

很多調(diào)節(jié)因子都與正常造血細(xì)胞的增殖、分化以及譜系命運決定相關(guān)。原癌基因c-myb是其中一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子(1，2)。c-myb特異性表達(dá)在造血干細(xì)胞以及祖細(xì)胞中，并且其表達(dá)隨著細(xì)胞分化而降低(2-4)。

骨髓增生異常綜合癥(mds)是老年人常見的血液腫瘤疾病，并且可以進(jìn)展為急性髓系白血病(aml)或者急性淋系白血病(all)(38)。然而，mds進(jìn)展為aml或者all的具體分子機制尚不清楚。其中獲得型突變是mds向急性白血病轉(zhuǎn)化的一個重要因素(39)。

現(xiàn)有的一種c-myb異常激活小鼠中，其c-myb是在鼠的淋巴細(xì)胞特異性啟動子下啟動，而不是原有的啟動子啟動，其表達(dá)的時空已經(jīng)發(fā)生改變。結(jié)果是，只影響到淋巴細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞血液疾病，而對髓系細(xì)胞發(fā)育和髓系血液疾病的影響并無研究(42)。

斑馬魚與人的血液組成以及基因調(diào)控機制的相似使得斑馬魚成為研究造血發(fā)育的理想動物模型(19)。斑馬魚已經(jīng)作為疾病模式動物用于闡述一些造血疾病的新的分子機制(20)和篩選新的藥物(21)。通過突變或者過表達(dá)一些原癌基因建立起與血液腫瘤相關(guān)的越來越多的斑馬魚突變體和轉(zhuǎn)基因系(22，23)。利用斑馬魚白血病模型不僅可以進(jìn)一步研究人白血病發(fā)病的分子機制，還可以在體內(nèi)進(jìn)行新的小分子化合物的藥篩。

斑馬魚是進(jìn)行藥物研發(fā)的理想模式動物(21，35)。斑馬魚相比于小鼠更適合做大規(guī)模的藥物篩選，具有成本低、高效等優(yōu)勢。斑馬魚用于藥物篩選可以實現(xiàn)以下益處：高通量：斑馬魚產(chǎn)卵數(shù)量多，且受精后的1天開始加藥，2-5天后檢測，在此期間卵黃可提供胚胎營養(yǎng)而不用喂食，使得可以用96孔或384孔板進(jìn)行藥物篩選。低費用：斑馬魚飼養(yǎng)和消耗的費用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于小鼠，平均每天每只消費約為小鼠的1/100。給藥方便：可直接將化合物溶于水中，擴散至胚胎，所需化合物的量僅為小鼠的1/100-1/1000。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：c-myb轉(zhuǎn)基因斑馬魚在表型、藥物敏感性、疾病進(jìn)展過程等方面與人的白血病具備何種程度的相似性？如何開展新的斑馬魚白血病模型的建立及標(biāo)準(zhǔn)化、高通量新藥篩選？

為了解決這些技術(shù)問題，本發(fā)明人提出了以下發(fā)明總體構(gòu)思：

(1)胚胎時期，利用標(biāo)記不同階段髓系細(xì)胞的探針進(jìn)行wish實驗來檢測詳細(xì)的髓系造血改變，用c/ebpɑ標(biāo)記不成熟的中性粒細(xì)胞；用lyz標(biāo)記成熟的中性粒細(xì)胞；用mfap4來標(biāo)記成熟的巨噬細(xì)胞。闡述c-myb在斑馬魚中特異性髓系祖細(xì)胞分化以及隨后中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞命運選擇中的作用。

(2)在成魚時期，將c-myb異常激活斑馬魚和已經(jīng)用dsred標(biāo)記了髓系祖細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因家系魚進(jìn)行雜交，用流式細(xì)胞儀(facs)和細(xì)胞學(xué)方法分析(3m，1y)雜交子代的腎臟、血液循環(huán)系統(tǒng)中髓系細(xì)胞的數(shù)量、亞型、分化階段的情況，觀察白血病的特征是否會在這些魚中出現(xiàn)。

(3)用brdu、tunel實驗確定髓系細(xì)胞分化過程中增殖和凋亡的改變。

(4)已知白血病治療藥物對白血病模型的藥理學(xué)驗證：配魚(將c-myb異常激活斑馬魚tg(c-myb:gfp)與野生型斑馬魚ab雜交)，每條母魚產(chǎn)卵200-300個。通過綠色熒光挑出c-myb異常激活受精卵。將c-myb異常激活受精卵放入6孔板，每孔放30～50個。選取已知的臨床上治療白血病的藥物(主要為臨床上已知的且以c-myb為靶點的藥物)。將所選的不同的藥物加入到含有魚卵和水的孔中，每孔只加一種藥物。孵育一段時間后，通過蘇丹黑b(sudanblackb，sb)染色等方法分析，找到可以改變c-myb異常激活魚卵造血發(fā)育表型的藥物。

(5)潛在生物活性小分子庫的藥物篩選：配魚(將c-myb異常激活斑馬魚tg(c-myb:gfp)與野生型斑馬魚ab雜交)，每條母魚產(chǎn)卵200-300個。通過綠色熒光挑出c-myb異常激活受精卵。將c-myb異常激活受精卵放入96孔板或384孔板，每孔放3～5個。選取具有潛在生物學(xué)活性化合物的小分子庫(主要為成藥庫)。將所選的不同的小分子加入到含有魚卵和水的孔中，每孔只加一種藥物。孵育一段時間后，通過sb染色等方法大規(guī)模分析，找到可以改變c-myb異常激活魚卵造血發(fā)育表型的新的化合物。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別主要在于：本發(fā)明是在c-myb時空表達(dá)不改變的情況下c-myb被異常激活，繼而引起髓系造血異常的表型。發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因斑馬魚在幼年和成年時示出類似人白血病的表型，并證明了可以利用其對治療白血病的藥物進(jìn)行高通量篩選。

本發(fā)明的斑馬魚模型中，c-myb是在原有的核心啟動子下啟動，時空表達(dá)不改變。造成的表型主要表現(xiàn)在血液系統(tǒng)上，且有類白血病表型。

本申請?zhí)峁┝艘环N轉(zhuǎn)基因斑馬魚在制備骨髓增生異常綜合癥(mds)的動物模型中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚為c-myb^hyper突變體。在一些實施方案中，所述骨髓增生異常綜合癥(mds)可以是由c-myb基因的異常激活引起。一些實施方案中，所述骨髓增生異常綜合癥(mds)可以在通過阻斷細(xì)胞周期起作用的藥物或c-myb靶向藥物治療后癥狀緩解。在進(jìn)一步的實施方案中，所述通過阻斷細(xì)胞周期起作用的藥物為阿糖胞苷，所述c-myb靶向藥物為弗拉平度。

本申請還提供了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚在制備用于篩選對骨髓增生異常綜合癥(mds)有效的藥物的動物模型中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚為c-myb^hyper突變體。在一些實施方案中，所述骨髓增生異常綜合癥(mds)可以是由c-myb基因的異常激活引起。在一些實施方案中，所述骨髓增生異常綜合癥(mds)可以在通過阻斷細(xì)胞周期起作用的藥物或c-myb靶向藥物治療后癥狀緩解。在一些實施方案中，所述通過阻斷細(xì)胞周期起作用的藥物為阿糖胞苷，所述c-myb靶向藥物為弗拉平度。在一些實施方案中，所述篩選可以包括以下步驟：(a)以相同濃度的備選藥物處理受精后第一至兩天的所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎和野生型同胞魚胚胎；(b)在處理后第二至五天觀察胚胎尾部造血組織(cht)區(qū)域的血液表型，以確定所述備選藥物對所述骨髓增生異常綜合癥(mds)的治療效果。在一些實施方案中，所述血液表型可以包括蘇丹黑b(sb)染色陽性粒細(xì)胞計數(shù)。

本申請還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚來篩選對骨髓增生異常綜合癥(mds)有效的藥物的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚為c-myb^hyper突變體。在一些實施方案中，所述骨髓增生異常綜合癥(mds)可以是由c-myb基因的異常激活引起。在一些實施方案中，所述骨髓增生異常綜合癥(mds)可以在通過阻斷細(xì)胞周期起作用的藥物或c-myb靶向藥物治療后癥狀緩解。在一些實施方案中，所述通過阻斷細(xì)胞周期起作用的藥物為阿糖胞苷，所述c-myb靶向藥物為弗拉平度。在一些實施方案中，所述篩選可以包括以下步驟：(a)以相同濃度的備選藥物處理受精后第一至兩天的所述轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎和野生型同胞魚胚胎；(b)在處理后第二至五天觀察胚胎尾部造血組織(cht)區(qū)域的血液表型，以確定所述備選藥物對所述骨髓增生異常綜合癥(mds)的治療效果。在一些實施方案中，所述血液表型可以包括蘇丹黑b(sb)染色陽性粒細(xì)胞計數(shù)。

本申請還提供了一種骨髓增生異常綜合癥(mds)的動物模型，所述動物模型包括c-myb^hyper突變體的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

本文所使用的術(shù)語“hpf”指受精后的小時數(shù)。本文所使用的術(shù)語“dpf”指受精后的天數(shù)。舉例來說，“3dpf”指受精后三天，“8dpf”指受精后八天。

本文所使用的術(shù)語“野生型”或者“wt”都是指野生型斑馬魚。

本文所使用的術(shù)語“同胞魚(sibling)”是指由同一雙親的后代個體。

附圖說明

圖1.c-mybmrna在c-myb^hyper突變體的胚胎到成魚時期持續(xù)增加。(a)在c-myb-gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚的pac中發(fā)現(xiàn)兩段重復(fù)序列。第一段(1^st，485-bp的小啟動子)用實線框標(biāo)出，第二段重復(fù)序列(2^nd，pwsmk-t到c-myb內(nèi)含子10的區(qū)域)用實線框標(biāo)出。每段重復(fù)序列的插入位點用箭頭指示。c-myb的外顯子用黑色條指示，pwsmk-t載體包含了gfp、sv40ploya終止信號以及氨芐抗性基因的反向序列。77-bp的未知序列用白色條指示出。(b)c-myb-wt以及c-myb-t1的轉(zhuǎn)錄本和蛋白信息。c-myb-wt和c-myb-t1的轉(zhuǎn)錄起始位點分別用箭頭標(biāo)出。終止密碼子用星號標(biāo)出。dbd表示dna結(jié)合域，tad表示轉(zhuǎn)錄激活域，nrd表示負(fù)性調(diào)控域。(c)c-myb在受精后36小時、3天以及5天的原位雜交結(jié)果。黑色框為agm(主動脈性腺中腎區(qū))、cht(尾部造血組織)以及腎臟區(qū)域放大到20倍的結(jié)果。圖右上方的數(shù)字表示表達(dá)增加的胚胎比胚胎總數(shù)(fisher’s檢驗，p≤0.01)。(d)c-myb基因在受精后3天、5天的整體胚胎以及3個月、6個月和1年的腎臟中qpcr結(jié)果(*p≤0.05，**p≤0.01，獨立樣本t檢驗；整體胚胎每組30個樣品，腎臟每組10個樣品)。

圖2.c-myb^hyper胚胎中髓系細(xì)胞異常增生。(a-c)c-myb異常激活促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的積累以及巨噬細(xì)胞的減少。原位雜交顯示c/ebpα(a)、mfap4(b)和lyz(c)在受精后3天的c-myb^hyper斑馬魚和其同胞魚中的表達(dá)。sb在受精后3天(d)以及7天(e)的幼魚中的染色。黑色框為cht以及腎臟區(qū)域放大到20倍的結(jié)果。d圖中的最右邊黑色框為單個細(xì)胞放大到100倍的結(jié)果。圖右上方的數(shù)字表示表達(dá)增加的胚胎比胚胎總數(shù)(fisher’s檢驗，n≥10，p≤0.01)。

圖3.c-myb^hyper成魚表現(xiàn)出類mds表型：腎臟血異常髓系增生。(a-d)1年的c-myb^hyper斑馬魚和其同胞魚的外周血(pb)細(xì)胞(a)和腎臟血(km)細(xì)胞(c)的瑞姬氏染色。箭頭、星號、三角形和閃電分別指示紅細(xì)胞、祖細(xì)胞、髓系單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞。c-myb^hyper斑馬魚(黑色條圖)和其同胞魚(灰色條圖)的pb(b)以及km(d)血細(xì)胞計數(shù)。黑色星號表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。(t-檢驗，1年同胞魚和c-myb^hyper的pb樣本量分別為9和5，km樣本量分別為6和5，平均值±sem；*p≤0.05，**p≤0.01)。(e和f)流式分析c-myb^hyper斑馬魚和其同胞魚的血液組成。利用fsc表示細(xì)胞大小和利用ssc表示細(xì)胞內(nèi)顆粒多少將血液細(xì)胞區(qū)分計數(shù)。(g-k)c-myb^hyper斑馬魚出現(xiàn)腎腫大和肝腫大。1年的c-myb^hyper斑馬魚腎臟面積為同胞魚的1.4倍(h)，重量為同胞魚的3.3倍(i)。1年的c-myb^hyper斑馬魚肝臟出現(xiàn)sb陽性細(xì)胞增多(j)。j圖中右邊黑色框為左圖中的局部放大圖。1年的c-myb^hyper斑馬魚肝臟重量增加(k)。(t-檢驗，n≥10；平均值±sem；*p≤0.05，**p≤0.01)。

圖4.c-myb^hyper胚胎以及成魚中髓系細(xì)胞的增多是由于細(xì)胞增殖增加導(dǎo)致的。(a-h)c-myb異常激活會導(dǎo)致胚胎(a-d)以及成魚腎臟(e-h)中髓系細(xì)胞的增殖增加而凋亡無顯著性改變。brdu/lcp的免疫熒光雙染(a和e)以及tunel/lcp雙染(c和g)指示了brdu⁺或者tunel⁺在3dpf/3個月的cht/km區(qū)域與lcp⁺細(xì)胞共染結(jié)果。cht和km區(qū)域中l(wèi)cp⁺/brdu⁺細(xì)胞占lcp⁺細(xì)胞的比例(b和f)以及l(fā)cp⁺/tunel⁺細(xì)胞占lcp⁺細(xì)胞的比例(d和h)被計算出(t-檢驗，n>13；平均值±sem；*p≤0.05，**p≤0.01)。

圖5.c-myb^hypermds樣斑馬魚對化療藥物的反應(yīng)。(a-c)用pbs(a)或者阿糖胞苷(ara-c，b)，柔紅霉素(dnr，c)處理受精后1天的c-myb^hyper(右邊欄)和同胞魚(左邊欄)胚胎5天后進(jìn)行sb染色。(d和e)受精后1天的胚胎用二甲基亞砜(d)或者弗拉平度(e)處理4天后進(jìn)行sb染色。(f)藥物處理后每條幼魚的sb陽性細(xì)胞計數(shù)。(t-檢驗，n≥10；平均值±sem；*p≤0.05，**p≤0.01)。(g)利用qpcr檢測藥物處理后c-myb基因在c-myb^hyper(黑色條圖)和同胞魚(灰色條圖)中的表達(dá)情況(t-檢驗，n＝30；平均值±sem；*p≤0.05，**p≤0.01)。

圖6.c-myb^hyper斑馬魚中的重復(fù)序列。(a)c-myb小的啟動子重復(fù)序列包含一個315bp的核心啟動子序列以及170bp的外顯子1的序列。c-myb小啟動子重復(fù)序列和其附近序列被標(biāo)示出來。(b)第二段重復(fù)序列中的內(nèi)含子10的斷點位置附近序列被標(biāo)示出來(黑色框)。c-myb的外顯子用黑色條指示，pwsmk-t載體包含了gfp、sv40ploya終止信號以及氨芐抗性基因的反向序列(ampr)。77-bp的未知序列用白色條指示出。

圖7.髓系細(xì)胞在3個月的c-myb^hyper斑馬魚腎臟血中異常增生。(a-d)3個月的c-myb^hyper斑馬魚和其同胞魚的外周血(pb)細(xì)胞(a)和腎臟血(km)細(xì)胞(c)的瑞姬氏染色。箭頭、星號、三角形和閃電分別指示紅細(xì)胞、祖細(xì)胞、髓系單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞。c-myb^hyper斑馬魚(黑色條圖)和其同胞魚(灰色條圖)的pb(b)以及km(d)血細(xì)胞計數(shù)。黑色星號表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。(t-檢驗，1年同胞魚和c-myb^hyperpb樣本量分別為6和9，km樣本量分別為8和8，平均值±sem；*p≤0.05，**p≤0.01)。

具體實施方式

下面將以實施例的方式對本申請作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用其他實施方式，并且可以做出適當(dāng)?shù)母淖兌黄x本申請的精神或范圍。為了避免對于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請來說不必要的細(xì)節(jié)，說明書可能省略了對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知的某些信息。因此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)以限制性的意義來理解，且本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求界定。

以下的實施例便于更好地理解本申請，但并不用來限制本申請的范圍。

下述實施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。

材料和方法

斑馬魚養(yǎng)殖

斑馬魚的養(yǎng)殖如文獻(xiàn)所述(25)。本發(fā)明中用到下面的品系：ab、tg(c-myb-gfp)、tg(rag2:dsred)。

5’和3’-race

race是用race5’/3’kit(clontech，ca，usa；634858)進(jìn)行的，具體的操作步驟參考該試劑盒的說明書。5’-racepcr中c-myb基因特異性引物是5’-gattacgccaagctttccatgatcgaacgcctcaggttggga-3’，3’-racepcr中c-myb基因特異性引物是5’-gattacgccaagcttcgaggcggcacagacacagtgtttacag-3’。pcr產(chǎn)物電泳后回收，插入到prace載體后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞，挑取多于12個的單克隆進(jìn)行測序。

整體原位雜交

整體原位雜交(wish)是利用抗地高辛標(biāo)記的rna探針進(jìn)行的，實驗步驟如文獻(xiàn)所述(28)。圖像利用奧林巴斯mvx10顯微鏡(shinjuku，tokyo，japan)進(jìn)行拍攝。

實時熒光定量pcr

總rna利用rnaeasykit(qiagen，maryland，usa；74004)提取，繼而利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega，madison，usa；m1701)合成cdna。實時熒光定量pcr利用sybrgreenreal-timepcrmastermix(appliedbiosystems，austin，usa；4472908)染料在lightcyclernanosw1.0機器上進(jìn)行。具體操作步驟參照說明書。內(nèi)參為衍伸因子1α(ef1a)。所有的引物利用primer5軟件設(shè)計(表1)。

表1：qpcr引物

溴脫氧尿嘧啶核苷和末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dutp缺口末端標(biāo)記法

溴脫氧尿嘧啶核苷(brdu)標(biāo)記實驗操作如文獻(xiàn)所述(29)。受精后3天的tg(c-myb-egfp)胚胎和同胞魚對照組用10mm的brdu(sigma-aldrich；b5002)孵育2小時，之后用4％的多聚甲醛固定，再用鼠源性的抗-brdu(roche，germany；10875400)和兔源性的抗-lcp抗體孵育，最后用抗鼠的488(invitrogen，ca，usa；a21202)以及抗兔的555(invitrogen，ca，usa；a31572)熒光染色并觀察。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dutp缺口末端標(biāo)記(tunel)實驗利用insitucelldeathdetectionkittmrred(roche；12156792910)試劑盒進(jìn)行。接著使用兔源性的抗-lcp以及抗兔的555染色。圖像利用奧林巴斯fluoview1000共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。

細(xì)胞學(xué)分析

造血細(xì)胞的分離如下：斑馬魚用三卡因麻醉，外周血(pb)通過用10μl肝素化過的微量血細(xì)胞比容管從鰓中獲取。腎臟血(km)細(xì)胞從腎臟中分離。分離出的pb和km用含5％的fbs的pbs重懸，接著將重懸的細(xì)胞400轉(zhuǎn)3分鐘離心至玻片上。最后用姬姆薩(merck，germany；1.09204.0500)，瑞士姬(merck；1.01424.0500)染色。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)對pb和km細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

實施例1：c-myb的表達(dá)量在c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中從胚胎到成魚不斷增加

north等人首次描述了c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，它是作為用于標(biāo)記c-myb陽性的hscs被建立的(24)(對構(gòu)建c-myb-gfp所需的重組序列的測序結(jié)果如seqidno：1所示)。然而，當(dāng)我們將c-myb-gfp和c-myb^hkz3/hkz3突變斑馬魚交配后，發(fā)現(xiàn)c-myb^hkz3/hkz3斑馬魚造血缺陷表型被拯救。

為了尋找c-myb-gfp/c-myb^hkz3/hkz3斑馬魚中造血缺陷的恢復(fù)的原因，我們將c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中pac區(qū)域進(jìn)行測序(測序結(jié)果如seqidno：2所示)并發(fā)現(xiàn)了兩段重復(fù)序列，其中一段是在翻譯起始位點之前發(fā)現(xiàn)的一段485bp的重復(fù)序列，它包括了315bp的核心啟動子區(qū)域以及170bp的5’utr(圖1a和圖6a)；另一段大的重復(fù)區(qū)域是從pwsmk-t載體到c-myb內(nèi)含子10的重復(fù)序列，它插在了c-myb內(nèi)含子10中的斷裂位置(圖1a和圖6b)。3’以及5’race實驗則發(fā)現(xiàn)c-myb–gfp中pac產(chǎn)生了2種不同的轉(zhuǎn)錄本(分別命名為c-myb-wt和c-myb-t1)(圖1b)。其中一個轉(zhuǎn)錄本是c-myb-wt(其對應(yīng)的cdna序列如seqidno：3所示)，它由第二個小啟動子啟動，并且與野生型斑馬魚的c-myb基因轉(zhuǎn)錄本(其對應(yīng)的cdna序列如seqidno：4所示)完全一致(圖1b)；另一個轉(zhuǎn)錄本是4.3kb的c-myb-t1(其對應(yīng)的cdna序列如seqidno：5所示)，它由第一個小啟動子啟動，并且由一個截斷的c-myb(外顯子1到外顯子10)以及一個接近完整的c-myb(外顯子2到外顯子15)組成(圖1b)。c-myb-t1翻譯的蛋白是由兩段蛋白融合而成的，第一段是缺少完整c端的負(fù)性調(diào)控區(qū)域(nrd)的c-myb蛋白，另一段則是在n端少了8個氨基酸的c-myb蛋白(圖1b)。

為了檢測c-myb基因在c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的表達(dá)情況，我們對c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚的整體胚胎以及成魚的腎臟進(jìn)行了wish和qpcr實驗(圖1c、d)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中，以c-myb探針(seqidno：6)檢測，c-myb基因在hsc產(chǎn)生的部位——主動脈性腺中腎區(qū)(agm)、尾部造血組織(cht)以及腎臟中表達(dá)，但是，c-myb基因在c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的表達(dá)水平相比于野生型增強了很多(圖1c)。qpcr結(jié)果顯示從3dpf開始，c-myb基因在c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的表達(dá)量約為野生型中的2倍，并且隨著時間推移越來越多(圖1d)。c-myb基因在c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的過表達(dá)可能是由于pac中外源性c-myb基因的表達(dá)。發(fā)明人據(jù)此將c-myb–gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚命名為c-myb基因異常激活斑馬魚(c-mybhyperactivity，c-myb^hyper)。

實施例2：早期胚胎時期c-myb基因異常激活導(dǎo)致異常的粒細(xì)胞累積

我們在c-myb^hyper斑馬魚胚胎中利用譜系特異性標(biāo)記物通過wish實驗來觀察c-myb的異常激活對髓系細(xì)胞發(fā)育的影響。我們在定向髓系發(fā)生的時期用c/ebpα探針(seqidno：7)檢測了c/ebpα基因(一種早期的髓系細(xì)胞特異性標(biāo)記物)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，c-myb^hyper中表達(dá)c/ebpα基因的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(圖2a)。

接下來，我們利用巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物以及粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物通過wish實驗來研究c-myb^hyper中累積的髓系細(xì)胞的細(xì)胞類型。其中表達(dá)巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物mfap4(seqidno：8)的細(xì)胞在3dpf的c-myb^hyper中數(shù)量顯著減少(圖2b)。相反的，表達(dá)粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物lyz(seqidno：9)的細(xì)胞在3dpf的c-myb^hyper中數(shù)量顯著增多(圖2c)。這提示在c-myb^hyper胚胎中積累的髓系細(xì)胞來源為粒細(xì)胞。這一結(jié)果也被sb染色(sb染色可以特異標(biāo)記斑馬魚中的粒細(xì)胞，在臨床上也被用于診斷髓系白血病細(xì)胞)進(jìn)一步證明。在c-myb^hyper胚胎以及幼魚中，被sb染色所標(biāo)記的粒細(xì)胞在cht以及腎臟(km)中顯著增多(圖2d和e)。更重要的是，在c-myb^hyper中sb陽性的粒細(xì)胞不僅數(shù)量增多，而且其大小更大、染色更深(圖2d、e)。這提示了c-myb^hyper中粒細(xì)胞功能的異常。以上的結(jié)果顯示，在c-myb^hyper胚胎中積累的髓系細(xì)胞是粒細(xì)胞來源而不是巨噬細(xì)胞來源，并且這種粒細(xì)胞在早期發(fā)育時期存在功能和形態(tài)上的異常。

實施例3：c-myb^hyper成魚出現(xiàn)mds樣表型

為了觀察成魚的造血改變，我們利用流式細(xì)胞儀以及細(xì)胞學(xué)實驗分離c-myb^hyper和同胞魚對照組中的血細(xì)胞。對從3個月和1年的c-myb^hyper和同胞魚對照組中分離的外周血(pb)和腎臟血(km)細(xì)胞進(jìn)行不同細(xì)胞類型計數(shù)分析。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在3個月和1年的c-myb^hyper中pb血的組成比例與同胞魚對照組沒有明顯區(qū)別(圖7a、b和圖3a、b)；而3個月和1年的c-myb^hyper中km血的組成比例區(qū)別于同胞魚對照組。與同胞魚對照組相比，3個月的c-myb^hyper的km血中髓系細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時伴隨祖細(xì)胞的減少(圖7c、d)。與同胞魚對照組相比，1年的c-myb^hyper的km血中髓系細(xì)胞數(shù)量增加了一倍，并伴隨其它譜系細(xì)胞的減少(圖3c、d)。這些表型與髓系異常增生相符合。

流式細(xì)胞分析結(jié)果與之前的一致，顯示在1年的c-myb^hyper中髓系細(xì)胞數(shù)量增多兩倍并伴隨其它譜系細(xì)胞的減少(圖3e、f)。并且通過流式細(xì)胞分析可以看出髓系細(xì)胞不僅數(shù)量增多，其大小變大，粒性更強。為了觀察c-myb^hyper斑馬魚中的內(nèi)臟是否受到影響，我們將c-myb^hyper和同胞魚對照組的內(nèi)臟在顯微鏡下解剖出來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1年的c-myb^hyper斑馬魚腎臟出現(xiàn)腫大，與同胞魚對照組相比，腎臟的面積增加1.37倍，重量增加了4倍(圖3g-i)。肝臟也變重并且與對照組相比有大量的sb陽性細(xì)胞浸潤(圖3j、k)。這些內(nèi)臟的缺陷以及浸潤同樣出現(xiàn)在人粒細(xì)胞性血液惡性腫瘤中。

綜上所述，c-myb^hyper斑馬魚中血液表型和組織浸潤表型與人的mds癥狀類似。

實施例4：c-myb^hyper斑馬魚中粒細(xì)胞增多主要由于增殖增多導(dǎo)致

c-myb^hyper斑馬魚中粒細(xì)胞增多既可能由于粒細(xì)胞增殖增多導(dǎo)致也可能由于凋亡減少導(dǎo)致。為了明確c-myb^hyper斑馬魚中粒細(xì)胞增多的分子機制，我們分別用brdu和tunel實驗來監(jiān)測細(xì)胞的增殖和凋亡情況。c-myb^hyper胚胎以及成魚腎臟中髓系細(xì)胞的凋亡情況與對照組類似(圖4c、d、g和h)，提示c-myb^hyper斑馬魚中粒細(xì)胞增多并不是由于凋亡改變而導(dǎo)致的。然而，brdu實驗結(jié)果顯示c-myb^hyper胚胎以及成魚腎臟中髓系細(xì)胞的增殖顯著增多(圖4a、b、e和f)，顯示c-myb^hyper斑馬魚中粒細(xì)胞增多可能是增殖增多的結(jié)果。以上結(jié)果提示c-myb異常激活促進(jìn)了粒細(xì)胞的持續(xù)增殖。

實施例5：臨床化療藥物對c-myb^hyper斑馬魚白血病模型有效

我們觀察了臨床常用抗白血病藥物在c-myb^hyper斑馬魚中的效果。阿糖胞苷(36)和柔紅霉素(37)是治療白血病的常用化療藥物，它們分別通過阻斷細(xì)胞周期以及促進(jìn)累積的白血病細(xì)胞凋亡而起作用。將1dpf的c-myb^hyper胚胎以及同胞魚對照組用10³mg/l阿糖胞苷或者30mg/l柔紅霉素孵育，在6dpf的時候?qū)ε咛ht區(qū)域進(jìn)行sb陽性粒細(xì)胞計數(shù)(圖5a–c和f)。未經(jīng)藥物處理的c-myb^hyper斑馬魚cht區(qū)域sb陽性粒細(xì)胞數(shù)量很多(圖5a和f)。經(jīng)過5天的阿糖胞苷處理后的c-myb^hyper斑馬魚的sb陽性粒細(xì)胞數(shù)量與未經(jīng)過藥物處理組相比顯著減少(圖5b和f)，而阿糖胞苷處理的同胞魚對照組與未處理的同胞魚對照組相比沒有明顯改變(圖5a和f)。然而，柔紅霉素對c-myb^hyper斑馬魚的粒細(xì)胞沒有任何作用(圖5c和f)。以上結(jié)果顯示c-myb異常激活誘導(dǎo)的髓系異常增殖表型可以被細(xì)胞周期特異性抗增殖藥物阿糖胞苷緩解而不能被促凋亡藥物柔紅霉素緩解。

我們同時觀察了c-myb^hyper中異常增殖的髓系細(xì)胞對c-myb靶向藥物cdk9的抑制劑弗拉平度的反應(yīng)。弗拉平度可以顯著減少c-myb^hyper中sb陽性粒細(xì)胞的數(shù)量，而對同胞魚對照組沒有影響(圖5d–f)。同時，與未經(jīng)藥物處理的c-myb^hyper相比，經(jīng)過弗拉平度處理的c-myb^hyper中c-myb的rna表達(dá)水平顯著降低(圖5g)。結(jié)果表明臨床上的c-myb靶向藥可以減少c-myb^hyper斑馬魚中的髓系細(xì)胞異常擴增。

綜上所述，研究結(jié)果顯示斑馬魚中c-myb異常激活可以引起mds并隨著年齡進(jìn)展為aml以及all，并且c-myb^hyper斑馬魚模型的腫瘤表型可以被臨床的化療藥物阿糖胞苷、弗拉平度所緩解。提示c-myb可以作為特定類型白血病的一個新的治療靶點。c-myb^hyper斑馬魚模型也為在體內(nèi)的新藥篩選提供有價值的平臺，特別是應(yīng)用于旨在治療上述特定類型白血病的細(xì)胞周期特異性抗增殖藥物候選物以及c-myb靶向藥候選物的篩選。

綜上所述，以上僅為本申請的較佳實施例而已，并非用于限定本申請的保護范圍，因此，凡在本申請的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護范圍之內(nèi)。

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