本申請要求2014年10月31日提交的美國臨時(shí)專利申請62/073,649號的權(quán)益，所述申請的公開明確通過引用并入本文。公開背景蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis(B.t.))是土傳細(xì)菌，其產(chǎn)生稱為δ內(nèi)毒素或Cry蛋白的殺蟲晶體蛋白質(zhì)。Cry蛋白是口服毒物，其通過作用于易感昆蟲的中腸細(xì)胞而發(fā)揮功能。一些Cry毒素已被證明具有針對線蟲的活性。δ內(nèi)毒素的一個(gè)擴(kuò)充列表在NeilCrickmore維護(hù)的蘇云金芽孢桿菌毒素命名學(xué)網(wǎng)站上維持和定期更新(見Crickmoreetal.1998、第808頁)。鞘翅目是重要的農(nóng)作物害蟲群，每年對作物造成廣泛的破壞。鞘翅目害蟲的實(shí)例包括科羅拉多馬鈴薯甲蟲(CPB)，玉米根蟲，苜蓿象鼻蟲，貝爾象鼻蟲和日本甲蟲。科羅拉多馬鈴薯甲蟲是一種經(jīng)濟(jì)上重要的害蟲，以馬鈴薯、茄子、番茄、辣椒、煙草和其他茄科植物(nightshadefamily)的葉為食?？屏_拉多馬鈴薯甲蟲是造成嚴(yán)重的馬鈴薯脫葉問題，部分原因是它對許多類型的殺蟲劑已經(jīng)生成了抗性。Cry毒素，包括Cry3、Cry7和Cry8家族的成員，對鞘翅目昆蟲具有殺蟲活性。雖然目前在轉(zhuǎn)基因植物中部署的Cry蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可以提供對上述害蟲的強(qiáng)力保護(hù)，從而保護(hù)谷物產(chǎn)量，但在人工侵染試驗(yàn)中已經(jīng)出現(xiàn)了成體害蟲，表明幼蟲控制不徹底。另外，抗蟲昆蟲種群的發(fā)展威脅著Cry蛋白在害蟲控制中的長期耐久性。小菜蛾(Plutellaxylostella)(Tabashnik，1994)，粉紋夜蛾(Janmaat和Myers，2003,2005)和谷實(shí)夜蛾(Helicoverpazea)(Tabashnik等人，2008)等抗Cry蛋白質(zhì)鱗翅目昆蟲已經(jīng)在田間發(fā)生。鞘翅目昆蟲同樣在田間發(fā)現(xiàn)了Cry蛋白的抗性(Gassmanetal.，PLoSONEJuly2011|Volume6|Issue7|e22629)。對B.t.Cry蛋白的昆蟲抗性可通過若干種機(jī)制產(chǎn)生(Heckel等，2007，PigottandEllar，2007)。已在昆蟲中鑒定了Cry蛋白的多個(gè)受體蛋白質(zhì)類型，并且在每一受體類型中存在多個(gè)實(shí)例。例如，對特定Cry蛋白的抗性可通過受體蛋白的鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域的毒素結(jié)合部分的突變而產(chǎn)生。抗性的其他方式可通過原毒素加工蛋白酶介導(dǎo)。人們對開發(fā)可提供管理鞘翅目昆蟲害蟲的額外工具的新Cry蛋白質(zhì)有興趣。在轉(zhuǎn)基因植物中組合產(chǎn)生具有不同作用模式的蛋白質(zhì)，將阻止昆蟲抗性的發(fā)展，并保持B.t.昆蟲害蟲防治技術(shù)的長期效用。發(fā)明概述本發(fā)明基于殺蟲毒素的發(fā)現(xiàn)，這些殺蟲毒素基于本文中稱為DIG-303的Cry蛋白毒素，包括DIG-303的變體，編碼這些毒素的核酸，應(yīng)用該毒素控制害蟲的方法，在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中產(chǎn)生該毒素的方法，以及表達(dá)該毒素的轉(zhuǎn)基因植物。SEQIDNO:2中的天然DIG-303毒素的氨基酸序列表明，DIG-303歸類到Cry32家族是最好的。如實(shí)施例1所述，從本文稱為PS18A、也稱為DBt10340的B.t.菌株中發(fā)現(xiàn)并分離了編碼DIG-303蛋白的核酸。確定了全長編碼區(qū)的核酸序列，并從核酸序列推導(dǎo)出全長蛋白質(zhì)序列。編碼DIG-303毒素的核酸序列在SEQIDNO:1中給出。使用殺蟲核心片段作為查詢的BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，DIG-303毒素蛋白與搜索時(shí)已知的最接近的Cry毒素的核心片段(AAG36711)具有小于60％的序列同一性，并且與最接近的公開序列(Axmi174ATX25337)具有小于70％的同源性。因此，DIG-303代表了Cry32蛋白家族內(nèi)的一個(gè)新亞類。DIG-303可以單獨(dú)使用或者與其他Cry毒素組合使用，其他Cry毒素例如(事件DAS-59122-7)、Cry3Bb1(事件MON88017)、Cry3A(事件MIR604)、嵌合Cry3A/Cry1Ab(eCry3.1Ab、FR8A、事件5307、WO2008/121633A1)、CryET33和CryET34、Vip1A、Cry1Ia、CryET84、CryET80、CryET76、CryET71、CryET69、CryET75、CryET39、CryET79、TIC809、TIC810、以及CryET74，以控制抗性鞘翅目昆蟲群體的發(fā)生。此外，DIG-303毒素可以單獨(dú)使用或者與其他可控制其他害蟲群體的發(fā)生的Cry蛋白(例如Cry1F、Cry1Ab、Vip3A、Cry2A、Cry1Da、Cry1Ia、和Cry1Ac)聯(lián)合使用，以控制鱗翅目抗性昆蟲群體的發(fā)生。DIG-303殺蟲毒素也可與用于控制其他蟲害的RNAi方法聯(lián)合使用。例如，DIG-303殺蟲毒素可在轉(zhuǎn)基因植物中與抑制CPB、玉米根蟲或其他昆蟲害蟲中的關(guān)鍵基因的dsRNA聯(lián)合使用。此類靶基因包括例如，CPB中的ATP酶編碼基因。其他此類靶基因包括，例如，玉米根蟲中的液泡ATP酶、ARF-1、Act42A、CHD3、EF-1α、ROP、RNAPII、和TFIIB。合適的靶基因的實(shí)例是液泡ATP酶，如WO2007035650中所公開的那樣。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的、經(jīng)處理的、或經(jīng)制劑化的DIG-303殺蟲毒素多肽，其包含選自下組的核心毒素區(qū)段：(a)SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列；和(g)SEQIDNO:2的約1至約685的殘基的氨基酸序列，具有多達(dá)20個(gè)對SEQIDNO:2的毒素的表達(dá)或活性沒有不利影響的氨基酸取代、缺失或修飾；或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的殺蟲活性片段。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上述DIG-303殺蟲毒素多肽可以連接到另一不同的cry毒素的C末端原毒素區(qū)段，例如，另一不同的cry毒素的其中核心毒素區(qū)段已被去除的C-末端區(qū)域。特別地，Cry1Ab或Cry1Ac/Cry1Ab嵌合毒素的C末端原毒素區(qū)段在本領(lǐng)域熟知有助于嵌合的cry核心毒素的穩(wěn)定表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純化的，經(jīng)處理的或制劑化的DIG-303殺蟲毒素，其具有與天然毒素在天然狀態(tài)下所具有的性質(zhì)基本上不同的性質(zhì)，其包含選自下組的DIG-303核心毒素區(qū)段：(a)包含SEQIDNO:2的殘基1至1257的氨基酸序列的多肽；(b)包含與SEQIDNO:2的殘基1至1257的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；和(c)包含SEQIDNO:2的殘基1至1257的氨基酸序列、其中具有最多達(dá)20個(gè)不會(huì)不利地影響SEQIDNO:2的毒素的表達(dá)或活性的氨基酸取代、缺失或修飾的多肽；或(a)、(b)、或(c)的殺蟲活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含DIG-303殺蟲毒素的轉(zhuǎn)基因植物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供控制害蟲群體的方法，包括使所述群體與殺蟲有效量的DIG-303殺蟲毒素接觸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼DIG-303殺蟲毒素的非天然存在的核酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了DNA構(gòu)建體，其包含編碼DIG-303殺蟲毒素的核苷酸序列，其中該序列與能夠在植物中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的異源啟動(dòng)子可操作連接。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物，其包含穩(wěn)定地?fù)饺肫浠蚪M的該DNA構(gòu)建體，以及用于保護(hù)植物免遭害蟲的方法，包括將在所述植物中表達(dá)該構(gòu)建體。就“分離的”或“純化的”而言，，申請人意圖表示核苷酸或多肽分子已經(jīng)借助人力從其天然環(huán)境中被移出并放置在不同的環(huán)境中。因此，分離的核苷酸和多肽分子包括這樣的DNA或蛋白質(zhì)分子，其已經(jīng)被純化、濃縮或通過其它方式使得其基本上不含蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞材料。分離的DIG-303殺蟲多肽或核苷酸分子的實(shí)施方案可以具有少于約30％，少于約20％，少于約10％，少于約9％，少于約8％，少于約7％，更少約6％，少于約5％，少于約4％，少于約3％或少于約2％，或少于約1％(以干重計(jì))的污染蛋白質(zhì)(例如來自蘇云金芽孢桿菌者)。當(dāng)分離的DIG-303殺蟲多肽或核苷酸實(shí)施方案系重組產(chǎn)生時(shí)，培養(yǎng)基材料、化學(xué)前體和/或非DIG-303殺蟲多肽或核苷酸占分離的DIG-303殺蟲多肽或核苷酸的小于約30％，小于約20％，小于約10％，小于約5％，小于約4％，小于約3％或小于約2％，或小于約1％(以干重計(jì))。序列簡述SEQIDNO:1顯示具有10個(gè)可變核苷酸的編碼DIG-303毒素的DNA；3771nt。SEQIDNO:2顯示具有10個(gè)可變氨基酸殘基的DIG-303蛋白序列；1257aa。SEQIDNO:3是編碼DIG-303毒素的玉米優(yōu)化的DNA序列，其中36個(gè)5'核苷酸被缺失；3735nt。SEQIDNO:4是SEQIDNO:3編碼的DIG-303蛋白質(zhì)序列，其中12個(gè)N-末端氨基酸殘基被缺失。1245aa公開詳述DIG-303殺蟲毒素:除了SEQIDNO:2的全長DIG-303毒素之外，本發(fā)明還包括了其殺蟲活性變體。通過術(shù)語“變體”，發(fā)明人意圖包括片段、某些缺失和插入突變體、以及某些融合或嵌合蛋白。DIG-303包括三個(gè)通常與Cry毒素相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。在描述包括在本發(fā)明中的DIG-303殺蟲毒素變體之前，簡要地概覽三結(jié)構(gòu)域Cry毒素和具體的DIG-303蛋白毒素的架構(gòu)是有用的。多數(shù)蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素晶體蛋白分子包括兩個(gè)功能區(qū)段。蛋白酶抗性核心毒素是第一個(gè)區(qū)段，并相應(yīng)于該蛋白質(zhì)分子的約前一半。完整的～130kDa的原毒素分子在昆蟲消化道中被蛋白酶迅速地加工為抗性核心區(qū)段。被這一酶促加工過程除掉的C端區(qū)段在本文中稱為“C端原毒素區(qū)段”。該C端原毒素區(qū)段被認(rèn)為參與了毒素的晶體形成(Arvidson等，1989)。該C端原毒素區(qū)段因此可能通過減少毒素分子的蛋白酶加工(Haider等，1986)或通過降低毒素可溶性(Aronson等，1991)，以限制核心對昆蟲的可接近性，從而表達(dá)出部分對該毒素的昆蟲特異性。B.t.毒素，即使在一個(gè)類型之內(nèi)，在長度上，以及在從核心毒素區(qū)段至C端原毒素區(qū)段的轉(zhuǎn)換的精確位置上也有一定程度的差異。從從核心毒素區(qū)段至C端原毒素區(qū)段的轉(zhuǎn)換通常會(huì)出現(xiàn)在全長毒素的約50％至約60％之間。SEQIDNO:2公開了全長DIG-303多肽的1257個(gè)氨基酸的序列，其中N-端685個(gè)氨基酸構(gòu)成DIG-303核心毒素區(qū)段。已確定了Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1、Cry3Bb1、Cry4Aa、Cry4Ba和Cry8Ea1的三維晶體結(jié)構(gòu)。這些核心毒素的結(jié)構(gòu)令人注意地相似，并且包含具有下述特征的三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(deMaagd等，2003中綜述)。結(jié)構(gòu)域I是7個(gè)α螺旋的束，其中螺旋5被六個(gè)兩親性螺旋環(huán)繞。已經(jīng)有人提出這一結(jié)構(gòu)域涉及孔形成，并且該結(jié)構(gòu)域與包括溶血素和大腸桿菌素在內(nèi)的其他孔形成蛋白享有同源性。DIG-303蛋白的結(jié)構(gòu)域I包含SEQIDNO:2的大致氨基酸殘基1-300。結(jié)構(gòu)域II由三個(gè)反向平行的β片層形成，該三個(gè)β片層被一起包裝為β棱柱。這一結(jié)構(gòu)域的環(huán)在結(jié)合昆蟲中腸受體當(dāng)中起著重要作用。在Cry1A蛋白中，位于結(jié)構(gòu)域IIβ片層頂點(diǎn)的暴露于表面的環(huán)(surfaceexposedloop)參與了與鱗翅目昆蟲鈣粘蛋白的結(jié)合。Cry3Aa結(jié)構(gòu)域II的環(huán)以類似的方式與科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)(Say)(CPB)的膜相關(guān)金屬蛋白酶結(jié)合(Ochoa-Campuzano等，2007)。結(jié)構(gòu)域II與包括卵黃和jacaline在內(nèi)的某些糖結(jié)合蛋白共享同源性。DIG-303蛋白的結(jié)構(gòu)域II包含SEQIDNO:2的大致氨基酸殘基300-525。結(jié)構(gòu)域III是兩個(gè)反向平行β片層的β夾心(sandwich)。這一結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上與諸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等蛋白質(zhì)的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域相關(guān)。保守的B.t.序列區(qū)塊2和區(qū)塊3分別位于結(jié)構(gòu)域2的N端和C端附近。因此，這些保守的序列區(qū)塊2和區(qū)塊3是所述三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域之間大致的邊界區(qū)域。這些具有保守的DNA和蛋白質(zhì)同源性的區(qū)域已被開發(fā)用于工程化重組B.t.毒素(美國專利6090931、WO1991001087、WO1995006730、美國專利5736131、美國專利6204246、美國專利6780408、WO1998022595、美國專利申請20090143298，和美國專利7618942)。DIG-303蛋白的結(jié)構(gòu)域III包含SEQIDNO:2的大致氨基酸殘基526-685。已報(bào)道，在鱗翅目昆蟲中，Cry1A毒素結(jié)合某些類型的受體蛋白質(zhì)，包括鈣粘蛋白、氨基肽酶和堿性磷酸酶，其余的仍有待鑒定(Honéeetal.、1991；PigottandEllar，2007)。在鞘翅目昆蟲中，已經(jīng)鑒定出Cry3Aa的兩種受體；在科羅拉多馬鈴薯甲蟲中已經(jīng)鑒定出ADAM金屬蛋白酶(Ochoa-Campuzanoetal.、2007)，在擬步甲屬(Tenebrio)中已經(jīng)鑒定出一種鈣粘蛋白(Fabricketal.、2009)。鑒于蘇云金芽孢桿菌毒素和害蟲的多樣性，預(yù)計(jì)更多的受體將被識(shí)別出來，這些受體將包括額外的蛋白質(zhì)類型和膜表面取代基?，F(xiàn)已報(bào)道，結(jié)構(gòu)域I的α-螺旋1在受體結(jié)合后即被移除。Aronson等(1999)證實(shí)了與刷狀緣膜囊泡(BBMV)結(jié)合的Cry1Ac受到保護(hù)不被蛋白酶K從殘基59開始(正在α-螺旋1之后)切割；Cry1Ab引證了類似的結(jié)果。Gomez等(2002)發(fā)現(xiàn)，在與BBMV受體結(jié)合后形成的Cry1Ab寡聚物缺乏結(jié)構(gòu)域I的α-螺旋1。而且，Soberon等(2007)顯示，Cry1Ab和Cry1Ac的缺乏包含三維Cry結(jié)構(gòu)上的α-螺旋1的約60個(gè)氨基酸的N-端缺失突變體能夠在缺乏鈣粘蛋白結(jié)合的情況下組裝分子量約60kDa的單體至前孔中。已報(bào)道這些N-端缺失突變體對Cry-抗性昆蟲幼蟲有活性。此外，Diaz-Mendoza等(2007)描述了Cry1Ab的43kDa和46kDa片段，這些片段保持了對地中海玉米螟(西非蛀莖夜蛾(Sesamianonagrioides))的活性。已證實(shí)這些片段包括Cry1Ab的氨基酸殘基116至423；然而，其未描述具體的氨基酸序列，并且這些蛋白水解片段的活性機(jī)制也是未知的。Gomez等(2002)、Hofte等(1986)的結(jié)果與Soberon等(2007)和Diaz-Mendoza等(2007)的結(jié)果相反：Hofte等報(bào)道了從Cry1Ab的N端缺失36個(gè)氨基酸導(dǎo)致殺蟲活性的喪失。DIG-3的氨基端缺失變體：在其一個(gè)方面，本發(fā)明提供了DIG-303變體，其中一個(gè)或多個(gè)α-螺旋的全部或部分被缺失，以改進(jìn)殺蟲活性以及避免昆蟲產(chǎn)生抗性。進(jìn)行這些修飾是為了提供具有改良的特性(諸如改良的靶害蟲譜、效力和昆蟲抗性管理)的DIG-303變體。在本主題發(fā)明的一些實(shí)施方案中，修飾可能影響全長原毒素活化和孔形成的效率，導(dǎo)致昆蟲中毒。更具體地，為提供具有改良特性的DIG-303變體，描述了移除部分編碼N-端的DNA序列的逐步缺失。這樣的缺失移除結(jié)構(gòu)域I中的全部α-螺旋1以及全部或部分α-螺旋2，而保留α-螺旋3至7的結(jié)構(gòu)完整性。因此，本發(fā)明部分地涉及通過對結(jié)構(gòu)域1的α-螺旋成分進(jìn)行工程改造提高孔形成的效率，從而改善Cry蛋白的效力。更具體地，本主題發(fā)明提供改良的DIG-303蛋白質(zhì)，其被設(shè)計(jì)為在與Cry1蛋白結(jié)構(gòu)域I中的α-螺旋1和2具有推定的二級結(jié)構(gòu)同源性的區(qū)域中具有N端缺失。在N-端缺失變體編碼序列的設(shè)計(jì)中，將編碼甲硫氨酸的ATG起始密碼子插入在設(shè)計(jì)為表達(dá)該缺失變體的核苷酸序列的5’端。對于設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)基因植物的序列，恪守Varshavsky(1997)的“N-端規(guī)則”可能是有益的。其教導(dǎo)：某些氨基酸當(dāng)顯露為蛋白質(zhì)的N-端殘基時(shí)，可能促成真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的失穩(wěn)定和降解。例如，從對酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的觀察中收集的數(shù)據(jù)表明，N-端去穩(wěn)定氨基酸是F、L、W、Y、R、K、H、I、N、Q、D、E，可能還有P。盡管蛋白質(zhì)降解機(jī)制的具體細(xì)節(jié)在不同生物之間可能會(huì)有些不同，但上述N-端失穩(wěn)性氨基酸身份的保守性提示類似的機(jī)制可能在植物細(xì)胞中起作用。例如，Worley等(1998)發(fā)現(xiàn)在植物中，N-端規(guī)則包括堿性和芳香族殘基。有可能的是，在植物蛋白酶作用下該B.t.殺蟲蛋白α-螺旋3起點(diǎn)附近的蛋白水解裂解可能暴露了失穩(wěn)性的N-端氨基酸。這樣的加工可能使得經(jīng)裂解的蛋白質(zhì)易于迅速降解，并限制該B.t.殺蟲蛋白的積累，以致其水平不足以有效控制昆蟲。因此，對于某些以一個(gè)失穩(wěn)性氨基酸起始的N-端缺失變體的實(shí)例，可以在翻譯起始密碼子與該失穩(wěn)性氨基酸之間添加編碼G(甘氨酸)氨基酸的密碼子。蛋白酶敏感變體昆蟲消化道蛋白酶通常在幫助昆蟲從餌食蛋白質(zhì)中獲得所需氨基酸中發(fā)揮作用。了解最多的昆蟲消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其似乎是最常見的類型(Englemann和Geraerts(1980)，尤其是在鱗翅目昆蟲物種中。鞘翅目昆蟲具有比鱗翅目昆蟲消化道更中性至酸性的消化道。多數(shù)鞘翅目昆蟲幼蟲和成蟲(例如CPB)的中腸稍具酸性，以及半胱氨酸蛋白酶提供了主要的蛋白水解活性(Wolfson和Murdock，1990)。更確切地說，Thie和Houseman(1990)在CPB中鑒定和表征了半胱氨酸蛋白酶：組織蛋白酶B樣和組織蛋白酶H樣，以及天冬酰胺蛋白酶：組織蛋白酶D樣。Gillikin等(1992)描述了西方玉米根蟲幼蟲消化道中的蛋白水解活性，并發(fā)現(xiàn)主要是半胱氨酸蛋白酶。美國專利號7230167公開了歸因于組織蛋白酶G的蛋白酶活性存在于西方玉米根蟲中。昆蟲消化道蛋白酶的多樣且不同的活性水平可能影響昆蟲對特定B.t.毒素的敏感性。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可在期望的位置構(gòu)建蛋白酶裂解位點(diǎn)，以影響某些易感害蟲幼蟲的中腸內(nèi)的蛋白質(zhì)加工。這些蛋白酶裂解位點(diǎn)可通過諸如化學(xué)基因合成或剪接重疊PCR(Horton等，1989)的方法引入。例如，可任選地在Cry蛋白結(jié)構(gòu)中的特定位點(diǎn)任選地插入絲氨酸蛋白酶識(shí)別序列，以影響易感幼蟲的中腸中在期望缺失點(diǎn)處的蛋白質(zhì)加工。可以此種方式應(yīng)用的絲氨酸蛋白酶包括鱗翅目昆蟲中腸絲氨酸蛋白酶，諸如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶等(Christeller等，1992)。此外，可以構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)鑒定的缺失位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)活化，缺失位點(diǎn)是通過對由未分級幼蟲中腸蛋白酶制備物產(chǎn)生的Cry蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物進(jìn)行測序、或通過與刷狀緣膜囊的結(jié)合而經(jīng)驗(yàn)鑒定的。通過基因缺失或通過引入蛋白酶裂解位點(diǎn)產(chǎn)生的經(jīng)修飾的Cry蛋白具有改良的對鱗翅目害蟲和其它靶標(biāo)害蟲的活性，所述鱗翅目害蟲包括歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、西南玉米桿草螟(Diatraeagrandiosella)、美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)、小地老虎(Agrotisipsilon)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、蔗螟(Diatraeasaccharalis)、Loxagrotisalbicosta，以及鞘翅目害蟲如西方玉米根蟲、南方玉米根蟲、北方玉米根蟲(即葉甲屬物種)，和其他靶昆蟲。對屬于相同家族的絲氨酸蛋白酶，諸如胰蛋白酶、糜蛋白酶和組織蛋白酶G樣蛋白酶；鞘翅目半胱氨酸蛋白酶，諸如組織蛋白酶(B-樣、L-樣、O-樣以及K-樣蛋白酶)(Koiwa等，(2000)和Bown等，(2004)]；鞘翅目金屬蛋白酶，諸如ADAM10[Ochoa-Campuzano等，(2007))；以及鞘翅目天冬氨酸蛋白酶，諸如組織蛋白酶D-樣和E-樣、胃蛋白酶、plasmepsin和凝乳酶，可以通過在期望的加工位點(diǎn)工程構(gòu)建合適的識(shí)別序列，以影響某些昆蟲害蟲的易感性幼蟲的中腸內(nèi)的Cry蛋白加工，來進(jìn)一步加以利用。引入此類蛋白酶裂解位點(diǎn)的一個(gè)優(yōu)選位置是在α-螺旋2B和α-螺旋3之間的“間隔物”區(qū)域內(nèi)。另一個(gè)優(yōu)選的引入蛋白酶切割位點(diǎn)的位置是在α-螺旋3和α-螺旋4之間的間隔物區(qū)域內(nèi)。通過基因缺失或者通過導(dǎo)入蛋白酶切割位點(diǎn)而產(chǎn)生修飾的DIG-303殺蟲毒素蛋白，以提供改進(jìn)的對昆蟲害蟲的活性，所述昆蟲害蟲包括但不限于科羅拉多馬鈴薯甲蟲(CPB)、玉米根蟲、苜蓿象鼻蟲，貝爾象鼻蟲和日本甲蟲，等等。有多種技術(shù)可以用來確定多肽氨基酸序列(包括N端或C端殘基)。例如，可順序地使用自動(dòng)Edman降解方法以確定至多30個(gè)氨基酸殘基的N端氨基酸序列，每個(gè)殘基的準(zhǔn)確率98％。此外，確定包含多肽羧基末端的氨基酸序列也是可能的(Bailey等，1992；美國專利號6046053)。因此，在一些實(shí)施方案中，可表征通過蛋白酶水解加工方式(例如，通過從昆蟲消化道中制備的蛋白酶)活化的B.t.Cry蛋白酶，并鑒定該活化毒素片段的N端或C端氨基酸。通過在編碼序列的合適位置處引入或消除蛋白酶加工位點(diǎn)以允許或消除較大變體蛋白質(zhì)被昆蟲、植物或微生物蛋白酶蛋白水解裂解，從而產(chǎn)生的DIG-303變體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。應(yīng)理解此類操作的最終目的是產(chǎn)生具有與完整(全長)毒素蛋白具有相同或比之更好的活性的毒素片段分子。DIG-303殺蟲毒素的結(jié)構(gòu)域：預(yù)期DIG-303殺蟲毒素的單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域(以及與此類結(jié)構(gòu)域90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的變體)可用于形成與來自其他Cry毒素的結(jié)構(gòu)域的組合，以提供新的具有增加的害蟲毒性譜、改善的效能或升高的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的新毒素。DIG-303的結(jié)構(gòu)域I大致包含SEQIDNO:2的氨基酸殘基1至300。DIG-303的結(jié)構(gòu)域II大致包含SEQIDNO:2的氨基酸殘基301至525。DIG-3的結(jié)構(gòu)域III大致包含SEQIDNO:2的氨基酸殘基526至685。結(jié)構(gòu)域?qū)Q或位移是另一種產(chǎn)生改變的δ-內(nèi)毒素蛋白的機(jī)制。δ-內(nèi)毒素蛋白與δ-內(nèi)毒素蛋白之間的結(jié)構(gòu)域II和III可以對換，產(chǎn)生具有改良的殺害蟲活性或靶標(biāo)譜的雜種或嵌合毒素。結(jié)構(gòu)域II參與受體結(jié)合，結(jié)構(gòu)域III結(jié)合某些類型的受體蛋白并且可能參與低聚物毒素預(yù)孔(pre-pore)的插入。已顯示在其他毒素中某些結(jié)構(gòu)域III的取代產(chǎn)生了更好的抗甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)毒性(deMaagd等，1996)，且存在設(shè)計(jì)Cry毒素結(jié)構(gòu)域?qū)Q的指引(Knight等，2004)。用于產(chǎn)生重組蛋白及測試它們殺害蟲活性的方法是本領(lǐng)域公知的(例如，參見Naimov等，2001；deMaagd等，1996；Ge等，1991；Schnepf等，1990；Rang等，(1999))。已研究了來自Cry1A和Cry3A蛋白的結(jié)構(gòu)域I插入膜中并形成孔的能力。結(jié)構(gòu)域I的α-螺旋4和5在膜插入和孔形成中起著關(guān)鍵作用(Walters等，1993；Gazit等，1998；Nunez-Valdez等，2001)，而其他螺旋可能如傘的肋條那樣與膜表面接觸(Bravo等，2007；Gazit等，1998)。通過進(jìn)行少數(shù)氨基酸缺失、取代或添加而產(chǎn)生的DIG-303變體:可容易地以順序地方式在SEQIDNO:2的氨基酸序列中進(jìn)行氨基酸缺失、取代和添加，并通過生物測試法測試此類改變對殺蟲活性的影響。假如改變的數(shù)目有限，則此類測試不會(huì)涉及不合理的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明包括核心毒素(大致為SEQIDNO:2的氨基酸1-645)中已進(jìn)行了至多10個(gè)、至多15個(gè)或至多20個(gè)氨基酸添加、缺失或取代的的殺蟲活性變體。本發(fā)明包括具有與SEQIDNO:2的氨基酸1-685有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核心毒素區(qū)段的DIG-303殺蟲毒素變體。可通過進(jìn)行隨機(jī)突變制備變體，或者可以設(shè)計(jì)變體。在設(shè)計(jì)突變體的情況下，當(dāng)在毒素的負(fù)責(zé)生物活性或參與三維結(jié)構(gòu)(其最終負(fù)責(zé)生物活性)確定的關(guān)鍵區(qū)域中保持氨基酸同一性時(shí)，產(chǎn)生與天然毒素具有類似活性的變體的可能性很高。如果取代是保守的，保持活性的概率也會(huì)很高。一種氨基酸可以歸為下述類別：非極性、不帶電極性、堿性和酸性。保守取代，將一個(gè)類別的氨基酸取代為相同類型的另一氨基酸，對該變體的生物活性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)改變的可能性最小。表1提供了屬于每個(gè)類別的氨基酸的實(shí)例列表。表1在一些情況中，還可以進(jìn)行非保守取代。關(guān)鍵因素是這些取代必須不顯著減小該毒素的生物活性。變體包括由于誘變而在氨基酸序列上不同的多肽。本發(fā)明包含的變體蛋白是生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)擁有天然蛋白的期望生物學(xué)活性，即保持殺蟲活性。還可設(shè)計(jì)這樣的變體蛋白，即其在序列水平上不同，但維持了相同或類似的整體關(guān)鍵三維結(jié)構(gòu)、表面電荷分布等。例如參見，美國專利號7058515；Larson等(2002)；Stemmer(1994a，1994b，1995)以及Crameri等(1996a，1996b，1997)。美國專利US8,513,492B2核酸:分離的編碼DIG-303殺蟲毒素的核酸是本發(fā)明的一個(gè)方面。這包括編碼SEQIDNO:2的核酸，及其互補(bǔ)鏈，以及編碼SEQIDNO:2的殺蟲變體的其他核酸。術(shù)語“分離的”如本文上文所定義。由于遺傳密碼子的簡并性，多個(gè)不同的DNA序列可編碼本文公開的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同的或基本相同的毒素的備選DNA序列在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。基因合成:編碼本文描述的DIG-303殺蟲毒素的DNA序列可通過各種本領(lǐng)域公知的方法制得。例如，可通過亞磷酸三酯和亞磷酰胺化學(xué)來制得合成的基因片段或合成的基因(Caruthers等，1987)，并且可利用商業(yè)供應(yīng)商按需進(jìn)行基因合成。全長基因可用多種方式進(jìn)行組裝，包括例如，通過限制性片段的連接或重疊寡核苷酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)組裝(Stewart和Burgin，005)。此外，可通過應(yīng)用位點(diǎn)特異性終止寡核苷酸的PCR擴(kuò)增制得末端基因缺失。例如，可通過多個(gè)供應(yīng)商的任一種當(dāng)前實(shí)施的方法，通過合成構(gòu)建體，制得編碼DIG-303殺蟲毒素的核酸。(例如美國專利號7482119)。這些基因或其部分或變體可合成地構(gòu)建，例如通過使用基因合成儀以及例如美國專利號5380831的設(shè)計(jì)方法。備選地，合成或天然存在的基因的變體可應(yīng)用制備點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)容易地構(gòu)建。使用可通過商業(yè)途徑獲得的外切核酸酶或者內(nèi)切核酸酶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法可以制備這些基因的片段。例如，可以用諸如Bal31的酶或者位點(diǎn)定向誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。而且，可以使用多種限制酶得到編碼活性片段的基因片段。在給出了DIG-303殺蟲毒素氨基酸序列情況下，可應(yīng)用預(yù)期宿主優(yōu)選的同義密碼子通過逆翻譯該編碼序列，然后通過應(yīng)用替代同義密碼子移除可能在轉(zhuǎn)錄、翻譯或mRNA穩(wěn)定性方面產(chǎn)生問題的序列來精修該序列。此外，可以利用同義密碼子來在非DIG-303閱讀框(即閱讀框2、3、4、5和6)中導(dǎo)入終止密碼子以消除假的長開放編碼序列。量化多肽或核酸序列同一性:如下確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列的百分比同一性：首先將序列以最佳比較目的進(jìn)行比對。兩個(gè)序列間的百分比同一性是由該序列共有的同一位置數(shù)的函數(shù)(即，百分比同一性＝同一位置數(shù)/總位置數(shù)(例如，重疊位置)x100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該兩個(gè)序列一樣長。兩個(gè)序列間的百分比同一性可應(yīng)用類似于以下描述的那些得以確定，允許或不允許空位。在計(jì)算百分比同一性時(shí)，一般計(jì)算精確的匹配?？蓱?yīng)用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列間百分比同一性的確定。此類算法的非限制性實(shí)例是Altschuletal.(1990)，以及由Karlin和Altschul(1990)提出、由Karlin和Altschul(1993)改進(jìn)、并整合至BLASTN和BLASTX程序中的算法。BLAST檢索可方便地用于確定核酸或蛋白數(shù)據(jù)庫中與查詢序列同源(相似)的序列?？蛇M(jìn)行BLASTN檢索(得分＝100，字長＝12)以鑒定與本發(fā)明要求保護(hù)的核酸分子具有同源性的核苷酸序列?？蛇M(jìn)行BLASTX檢索(得分＝50，字長＝3)以鑒定與本發(fā)明要求保護(hù)的殺蟲蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。空位BLAST(GappedBLAST)(Altschul等，1997)可用于獲得為比較目的的空位比對。備選地，PSI-Blast可用于進(jìn)行迭代檢索，其檢測分子間的距離關(guān)系(Altschul等，1997)。當(dāng)應(yīng)用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可使用各個(gè)程序的缺省參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是ClustalW算法(Thompson等，1994)。ClustalW比較序列并比對整個(gè)氨基酸或DNA序列，并因此可提供有關(guān)整個(gè)氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法在多個(gè)可商購DNA/氨基酸分析軟件包中使用，諸如VectorNTIProgramSuite(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的ALIGNX模塊。當(dāng)用ALIGNX比對氨基酸序列時(shí)，可方便地使用缺省設(shè)置，即10的空位開放罰分、0.1空位延伸罰分以及blosum63mt2比較矩陣，從而評估兩個(gè)序列間的百分比氨基酸類似性(一致性)或同一性。當(dāng)使用ALIGNX比對DNA序列時(shí)，可方便地使用缺省設(shè)置，即15的空位開放罰分、6.6的空位延伸罰分以及swgapdnamt比較矩陣，以評估兩個(gè)序列間的百分比同一性。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一非限制性實(shí)例是Myers和Miller(1988)的算法。該算法已整合至wSTRETCHER程序中，所述程序是wEMBOSS序列比對軟件包(可在http://emboss.sourceforge.net/中獲得)的一部分。wSTRETCHER應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法(其使用線性空間)的修正版計(jì)算兩個(gè)序列的最佳全局比對。用于計(jì)算比對的取代矩陣、空位插入罰分和空位延伸罰分可以具體指定。當(dāng)使用wSTRETCHER比較核苷酸序列時(shí)，可與打分矩陣文件EDNAFULL一起使用16的空位開放罰分和4的空位延伸罰分。當(dāng)用于比較氨基酸序列時(shí)，可與EBLOSUM62一起使用12的空位開放罰分和2的空位延伸罰分。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的其它非限制性實(shí)例是Needleman和Wunsch(1970)的算法，其整合至序列比對軟件包GAP版本10和wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)中。GAP版本10可應(yīng)用以下參數(shù)從而用于確定序列同一性或相似性：對于核苷酸序列，應(yīng)用50的空位權(quán)重(GAPWeight)和3的長度權(quán)重(LengthWeight)，以及nwsgapdna.cmp打分矩陣，建立％同一性和％相似性。對于氨基酸序列比較，應(yīng)用8的空位權(quán)重和2的長度權(quán)重，以及BLOSUM62打分矩陣，建立％同一性或％相似性。wNEEDLE讀取兩個(gè)輸入序列，在它們的全長上找出最佳比對(包括空位)，并在文件中寫入它們的最佳全局序列比對。該算法應(yīng)用含有每一種可能的殘基或核苷酸匹配的值的打分矩陣，探索所有可能的比對并選擇最佳的。wNEEDLE尋找具有最大可能得分的比對，其中比對的得分等于獲自打分矩陣的匹配總分減去從比對序列中的開放和延伸空位產(chǎn)生的罰分。取代矩陣和空位開放及延伸罰分是用戶指定的。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，使用10的缺省空位開放罰分、0.5的空位延伸罰分以及EBLOSUM62比較矩陣。當(dāng)應(yīng)用wNEEDLE比較DNA序列時(shí)，使用10的缺省空位開放罰分、0.5的空位延伸罰分以及EDNAFULL比較矩陣。也可使用等價(jià)的程序?！暗葍r(jià)程序”預(yù)期了任何的序列比較程序，其中對于任何討論的兩個(gè)序列，所述程序產(chǎn)生這樣的比對，即當(dāng)與由ALIGNX、wNEEDLE或wSTRETCHER產(chǎn)生的相應(yīng)比對相比較時(shí)，所述比對具有同一的核苷酸或氨基酸殘基匹配及同一的百分比序列同一性。所述％同一性是兩個(gè)序列間同一的匹配除以報(bào)告的比對區(qū)(包括長度上的任何空位)的百分比，以及％相似性是兩個(gè)序列間的匹配除以報(bào)告的比對區(qū)(包括長度上的任何空位)的百分比。也可通過檢查手工地進(jìn)行比對。重組宿主:可以將本發(fā)明的毒素編碼基因?qū)攵喾N微生物或植物宿主中。毒素基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致殺蟲蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和保持。應(yīng)用合適的微生物宿主，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)，可將微生物施用于害蟲的環(huán)境中，微生物可以在那里增殖，并且被攝食。結(jié)果是害蟲的控制。備選地，可以在延長毒素的活性和穩(wěn)定重組宿主細(xì)胞的條件下處理含有毒素基因的微生物。經(jīng)處理的細(xì)胞，其包含經(jīng)過處理的、保留殺蟲活性的本發(fā)明毒素多肽，可以應(yīng)用于目標(biāo)害蟲的環(huán)境以控制害蟲。當(dāng)通過合適的DNA構(gòu)建體，例如載體將B.t.毒素基因?qū)胛⑸锼拗鳎⑶覍⑺鏊拗饕曰畹臓顟B(tài)應(yīng)用于環(huán)境時(shí)，使用某些宿主微生物是必須的。選擇已知占據(jù)一種或多種目的作物的“植物圈”(葉面、葉圈、根際和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物以便能夠在特定環(huán)境(作物和其他昆蟲棲息地)與野生型本土微生物成功地競爭，提供表達(dá)多肽殺蟲劑的基因的穩(wěn)定保持和表達(dá)，以及如希望的那樣，改進(jìn)保護(hù)殺蟲劑免于環(huán)境降解和失活。已知多種微生物棲息在多種重要作物的葉面(植物葉子的表面)和/或根際(植物根周圍的土壤)。這些微生物包括細(xì)菌、藻類和真菌。尤其重要的是微生物，諸如細(xì)菌，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、醋桿菌(Acetobacter)、乳桿菌(Lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)。尤其重要的諸如以下的植物圈細(xì)菌種：丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋桿菌(Acetobacterxylinum)、根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)(以前為Rhizobiummeliloti)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenesentrophus)、和棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)。進(jìn)一步感興趣的是真菌，尤其是酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、和短梗霉屬(Aureobasidium)，尤其感興趣的是以及諸如以下的植物圈酵母種：深紅酵母(Rhodotorularubra)、紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃紅酵母(R.aurantiaca)、淺白隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隱球酵母(C.diffluens)、變黃羅倫隱球酵母(C.laurentii)、羅斯酵母(Saccharomycesrosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、擲孢酵母(Sporobolomycesroseus)、香氣擲孢酵母(S.odorus)、佛地克魯維酵母(Kluyveromycesveronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。還重要的是著色的微生物。一種高度優(yōu)選的宿主是熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。分離的毒素多肽和本發(fā)明的組合物：可以處理或制備本發(fā)明的DIG-303殺蟲毒素多肽，例如以制備制劑化的農(nóng)藥組合物。制劑化的農(nóng)藥組合物的實(shí)例包括蛋白質(zhì)組合物、可噴霧蛋白質(zhì)組合物、誘餌基質(zhì)或其它遞送系統(tǒng)。在一個(gè)例子中，表達(dá)本發(fā)明的DIG-303殺蟲毒素的B.t.細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)培養(yǎng)基和發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)。一旦發(fā)酵周期完成，可以通過本領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵液分離B.t.孢子或其它重組宿主細(xì)胞和/或毒素晶體。B.t.孢子或重組宿主細(xì)胞也可以在施用或配制施用于植物之前進(jìn)行處理。例如，可以化學(xué)處理分離的B.t.孢子和/或毒素晶體以延長殺蟲活性，由此包括本發(fā)明的經(jīng)處理的多肽。在重組宿主中B.t.生長毒素多肽，然后處理B.t.以延長殺蟲活性的方法是已知的并已公開。參見例如美國專利號4,695,462和4,695,455。本發(fā)明的分離或處理的DIG-303殺蟲毒素可以制劑化成細(xì)碎的顆粒狀固體顆粒，小丸，可濕性粉劑，粉塵(dust)，水懸浮液或分散體，乳劑，噴霧劑，液體濃縮物或其它殺蟲劑制劑。這些殺蟲劑制劑通過將本文的DIG-303殺蟲劑多肽與佐劑，稀釋劑，表面活性劑，分散劑，惰性載體和其它組分組合來制備，以便于處理和應(yīng)用以控制一種或多種目標(biāo)害蟲。這樣的制劑成分是本領(lǐng)域已知的，施用方法和確定提供期望的殺蟲活性的B.t.孢子和/或分離的DIG-303多肽晶體的水平的方法亦是本領(lǐng)域已知的。控制害蟲的方法：當(dāng)昆蟲接觸通過殺蟲劑組合物(例如制劑化的蛋白質(zhì)組合物、可噴霧的蛋白質(zhì)組合物、誘餌基質(zhì)、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、或者其他遞送系統(tǒng))遞送的有效量的本文公開的DIG-303毒素時(shí)，結(jié)果通常是昆蟲死亡，或昆蟲不再進(jìn)食給昆蟲提供該蛋白質(zhì)的來源。可以多種方式“施與/施用”或提供主題蛋白質(zhì)毒素與靶標(biāo)昆蟲接觸。例如，本發(fā)明的DIG-303殺蟲毒素可以在與輔料、稀釋劑、載體等等一起配制，以例如提供細(xì)碎固體顆粒物、顆粒、小丸、可濕性粉劑、粉塵、水懸液或分散體、以及乳劑等形式的組合物之后施用。或者，可使用轉(zhuǎn)基因植物(其中蛋白質(zhì)由該植物表達(dá)，并存在于其中)來投放DIG-303殺蟲多肽，此為本領(lǐng)域公知的。還可實(shí)現(xiàn)毒素基因在植物特定組織中的選擇性表達(dá)，諸如根、葉等。這例如可通過使用組織特異性啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。噴灑使用是另一實(shí)例，也是本領(lǐng)域公知的?？珊线m地配制該主題蛋白質(zhì)用于預(yù)期的終端用途，并且然后噴霧(或以其它方式施與)至植物和/或植物周圍/至待保護(hù)的植物附近——在發(fā)現(xiàn)侵染之前、發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)昆蟲之后、之前及之后等。例如，還可使用誘餌顆粒，其也是本領(lǐng)域公知的。轉(zhuǎn)基因植物.本文中公開的DIG-303殺蟲毒素可用于實(shí)際地保護(hù)任何類型的植物免遭昆蟲害蟲的損害。此類植物的非限制性實(shí)例包括馬鈴薯、茄子、辣椒、番茄，以及其他茄科植物。此類植物的其他實(shí)例包括玉米、向日葵、大豆、棉花、蕓苔、稻、高粱、小麥、大麥、植物、觀賞植物、胡椒(包括辣椒)、糖甜菜、果樹以及草皮，僅略舉數(shù)例。轉(zhuǎn)化植物的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在實(shí)施例中描述了示范性的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是用編碼DIG-303殺蟲毒素、殺蟲蛋白質(zhì)、或其變體的基因轉(zhuǎn)化植物。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物由于在該轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞中存在控制量的該主題殺蟲蛋白或其變體，因此能耐受昆蟲靶標(biāo)害蟲的攻擊。通過將編碼B.t.殺蟲毒素殺蟲特征的遺傳材料整合至特定害蟲攝食的植物的基因組中，成蟲或幼蟲在消費(fèi)該食物植物后將死亡。已轉(zhuǎn)化了大量的單子葉和雙子葉植物。轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物以及果樹和蔬菜是商業(yè)上感興趣的。此類作物包括但不限于玉米、稻、大豆、蕓苔、向日葵、紫花苜蓿、高粱、小麥、棉花、花生、番茄、馬鈴薯等。存在多種將外源遺傳材料導(dǎo)入植物細(xì)胞，以及獲得穩(wěn)定保持并表達(dá)該引入的基因的技術(shù)。此類技術(shù)包括將包被在微粒上的遺傳物質(zhì)直接導(dǎo)入細(xì)胞中(美國專利號4945050和美國專利號5141131)?？梢允褂猛寥罈U菌技術(shù)轉(zhuǎn)化植物，美國專利號5177010、歐洲專利號EP131624B1、歐洲專利號EP159418B1、歐洲專利號EP176112B1、美國專利號5149645、EP120516B1、美國專利號5464763、美國專利號4693976、歐洲專利號EP116718B1、歐洲專利號EP290799B1、歐洲專利號EP320500B1、歐洲專利號EP604662B1、美國專利號7060876、美國專利號6037526、美國專利號6376234、歐洲專利號EP292435B1、美國專利號5231019、美國專利號5463174、美國專利號4762785、美國專利號5608142，和美國專利號5159135。其他轉(zhuǎn)化技術(shù)包括WHISKERSTM技術(shù)，見美國專利號5302523和美國專利號5464765。電穿孔技術(shù)也已被用于轉(zhuǎn)化植物，參見WO1987006614、美國專利號5472869、美國專利號5384253、WO199209696、美國專利號6074877、WO1993021335，和美國專利號5679558。除了多種用于轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)之外，與外源基因接觸的組織類型也可以不同。此類組織將包括但不限于胚胎組織、I型和II型愈傷組織、胚軸、分生組織等。應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)的合適技術(shù)，幾乎所有植物組織均可在分化期間轉(zhuǎn)化。編碼DIG-303殺蟲毒素的基因可應(yīng)用各種如上公開的本領(lǐng)域公知的技術(shù)插入植物細(xì)胞中。例如，包含在大腸桿菌中起作用的允許對轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞進(jìn)行選擇的標(biāo)記物和復(fù)制系統(tǒng)的大量克隆載體可用于制備和修飾用于插入到高等植物中的外來基因。此類操作可包括例如，插入突變、截短、添加或取代，如預(yù)期用途所期望的那樣。該載體例如包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以將編碼Cry蛋白或其變體的序列插入到載體的適當(dāng)限制性位點(diǎn)。所得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將得到的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后收獲并裂解，回收可工作量的質(zhì)粒。通常實(shí)施序列分析、限制性分析、電泳和其他生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法作為分析的方法。每一次操作之后，切割所使用的DNA序列并且連接到下一個(gè)DNA序列中?？梢詫⒚恳粋€(gè)操作的DNA序列克隆到相同的或者其他的質(zhì)粒中。對于含T-DNA的載體用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的用途已經(jīng)得以廣泛研究并在歐洲專利號EP120516B1；Lee和Gelvin(2008)；Fraley等(1986)以及An等(1985)中得以充分地?cái)⑹?。一旦插入的DNA被整合進(jìn)入基因組，則它在隨后的世代中是相對穩(wěn)定的。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體通常含有編碼賦予轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞抗除草劑或者抗生素的蛋白質(zhì)的選擇標(biāo)記基因，諸如膦絲菌素、雙丙膦、卡那霉素、新霉素、G418、博來霉素、潮霉素、或編碼對草甘膦、甲氨蝶呤、吲哚啉酮、磺酰脲和三唑并嘧啶類除草劑，諸如氯磺隆、溴苯腈、茅草枯等的抗性或耐性的基因。進(jìn)一步感興趣的是賦予對除草劑如蓋草能、喹禾靈、禾草靈等的耐性的基因，例如AAD基因(美國專利申請?zhí)?0090093366)。單個(gè)應(yīng)用的選擇標(biāo)記基因因此應(yīng)當(dāng)允許選擇轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，同時(shí)通過選擇化合物抑制不含插入DNA的細(xì)胞的生長。大量的技術(shù)可用于將DNA插入到宿主植物細(xì)胞中。這些技術(shù)包括通過作為轉(zhuǎn)化劑的根癌土壤桿菌或毛根土壤桿菌遞送，用T-DNA轉(zhuǎn)化。此外，也可使用植物原生質(zhì)體與含有待遞送DNA的脂質(zhì)體的融合、直接注射DNA、基因槍轉(zhuǎn)化(微粒轟擊)或電穿孔，以及其他可能的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，用其中針對植物優(yōu)化了蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的密碼子選擇的基因轉(zhuǎn)化植物。例如參見美國專利號5380831。例如，本發(fā)明的DIG-303殺蟲毒素可以優(yōu)化用于在雙子葉植物中，例如在馬鈴薯，茄子，番茄，辣椒，煙草和其他茄科植物中表達(dá)。本發(fā)明的DIG-303殺蟲毒素也可以優(yōu)化用于在其他雙子葉植物中表達(dá)，或在單子葉植物如玉米(Zeamays)中表達(dá)。而且，有利地使用編碼截短毒素的植物。截短的毒素通常編碼全長毒素的約55％至約80％。產(chǎn)生用于植物中的合成B.t.基因的方法是本領(lǐng)域公知的(Stewart，2007)。無論轉(zhuǎn)化技術(shù)如何，優(yōu)選將該基因摻入通過在載體中包含植物啟動(dòng)子從而適于在植物中表達(dá)B.t殺蟲毒素基因和變體的基因轉(zhuǎn)化載體中。除了植物啟動(dòng)子之外，可在植物細(xì)胞中有效地使用來自各種來源的啟動(dòng)子以表達(dá)外源基因。例如，可使用細(xì)菌來源的啟動(dòng)子，諸如章魚氨酸合酶啟動(dòng)子、胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子以及甘露堿合酶啟動(dòng)子；可使用病毒來源的啟動(dòng)子，例如，花椰菜花葉(CaMV)病毒35S和19S啟動(dòng)子等等。植物衍生的啟動(dòng)子包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)、β-伴大豆球蛋白質(zhì)(conglycinin)啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子、ADH(醇脫氫酶)啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、ADF(肌動(dòng)蛋白解聚因子)啟動(dòng)子、和組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可含有可改善轉(zhuǎn)錄效率的某些增強(qiáng)子序列元件。典型的增強(qiáng)子包括但不限于ADH1-內(nèi)含子1和ADH1-內(nèi)含子6。可使用組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在幾乎所有的細(xì)胞類型并且在幾乎所有的時(shí)間引導(dǎo)持續(xù)的基因表達(dá)(例如，肌動(dòng)蛋白、遍在蛋白、CaMV35S)。組織特異性啟動(dòng)子負(fù)責(zé)特定細(xì)胞或組織類型中的基因表達(dá)，諸如葉子或種子(例如，玉米醇蛋白、油質(zhì)蛋白、油菜籽蛋白、ACP(?；d體蛋白)，也可使用這些啟動(dòng)子。也可使用在植物發(fā)育的某些階段活化，以及在特定植物組織及器官中活化的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于根特異性、花粉特異性、胚特異性、玉米穗絲特異性、棉纖維特異性、種子胚乳特異性、韌皮部特異性的啟動(dòng)子。在某些條件下，期望使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子負(fù)責(zé)響應(yīng)特定信號而表達(dá)，諸如：物理刺激(例如，熱休克基因)；光(例如，RUBP羧化酶)；激素(例如，糖皮質(zhì)激素)；抗生素(例如，四環(huán)素)；代謝物；以及脅迫(例如，干旱)?？墒褂迷谥参镏衅鹱饔玫钠渌谕霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件，諸如5’非翻譯引導(dǎo)序列、RNA轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸附加信號序列。多種植物特異性基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明包括不全能(非全能)的植物細(xì)胞，不是繁殖材料(例如，在一些實(shí)施方案中，葉細(xì)胞；某些實(shí)施方案中排除種子細(xì)胞)，并且不能分化成全植物的植物細(xì)胞。本發(fā)明包括除了具有再生成整個(gè)植物以外的其他用途的植物細(xì)胞。例如，所述植物細(xì)胞可用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明的DIG-303蛋白質(zhì))。因此，本發(fā)明的植物細(xì)胞包括具有全能性以外的用途(即，本發(fā)明的一些細(xì)胞不可再生成整個(gè)植物)的植物細(xì)胞。然而，一些實(shí)施方案確實(shí)包括種子細(xì)胞和可以再生成整個(gè)植物的植物細(xì)胞。含有抗蟲性(IR)性狀的轉(zhuǎn)基因作物在北美的玉米和棉花植物中是很流行的，并且這些性狀的使用正在全球擴(kuò)張。已由多個(gè)種子公司開發(fā)了合并有IR和抗除草劑(HT)性狀的商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物。這些包括由B.t.殺蟲蛋白賦予的IR性狀和HT性狀的組合，所述HT性狀諸如是抗乙酰乳酸合酶(ALS)抑制劑，諸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、sulfonanilides等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制劑，諸如雙丙磷(bialaphos)、草銨膦等；4-羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)抑制劑，諸如米斯通除草劑(mesotrione)、isoxaflutole等；5烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制劑，諸如草甘膦等，以及乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑，諸如蓋草能(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)、禾草靈(diclofop)等。其他的實(shí)例是已知的，其中轉(zhuǎn)基因提供的蛋白質(zhì)給植物提供了對除草劑化學(xué)類的抗性，諸如鹵代苯氧酸除草劑和吡啶基氧醋酸酯植物生長素除草劑(參見WO2007053482)，或鹵代苯氧酸除草劑和芳氧基苯氧基丙酸酯除草劑(參見美國專利申請20090093366)。通過IR性狀控制多種害蟲問題的能力是有價(jià)值的商業(yè)產(chǎn)品概念，而且如果在相同的植物中合并昆蟲控制性狀和雜草控制性狀，則增強(qiáng)了這一產(chǎn)品概念的便利性。此外，通過以下性狀的單植物組合，可獲得改良的價(jià)值：由B.t.殺蟲蛋白賦予的IR性狀，諸如本發(fā)明的那些；一種或多種附加的HT性狀，諸如上面提及的那些；加上一種或多種額外的輸入性狀(例如，由B.t.衍生的或其他殺蟲蛋白賦予的其他昆蟲抗性，由諸如RNAi等機(jī)制賦予的昆蟲抗性，線蟲抗性，疾病抗性，脅迫耐受性，改進(jìn)的氮利用等)，或輸出性狀(例如，高油含量、健康油組成、營養(yǎng)改良等)。此類組合可通過常規(guī)育種(育種堆)或涉及同時(shí)導(dǎo)入多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化事件的結(jié)合(分子堆或共轉(zhuǎn)化)而獲得。有益性包括在作物植物中提供管理害蟲的能力和經(jīng)改進(jìn)的雜草控制能力，其中所述作物植物還給生產(chǎn)者和/或消費(fèi)者提供第二有益性。因此，本發(fā)明可與其他性狀組合使用，從而提供改進(jìn)的作物品質(zhì)的完整農(nóng)學(xué)包，具有靈活且成本有效地控制任意數(shù)量的農(nóng)學(xué)問題的能力。靶昆蟲:本發(fā)明的DIG-303殺蟲毒素特別適合用于控制昆蟲害蟲。鞘翅目是一群重要的農(nóng)業(yè)、園藝和家庭害蟲，每年造成極大量的損失。這一大目昆蟲涵蓋食葉和食根的幼蟲和成蟲，包括例如金花蟲科(Chrysomelidae)、瓢蟲科(Coccinellidae)、象鼻蟲科(Curculionidae)、皮蠹科(Dermestidae)、叩甲科(Elateridae)、金龜子科(Scarabaeidae)、小蠹科(Scolytidae)、和擬步甲科(Tenebrionidae)等昆蟲科的成員。這些科中包括金花蟲科中的金花蟲(leafbeetles)和潛葉蟲(leafminers)，馬鈴薯甲蟲(例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲(LeptinotarsadecemlineataSay)、葡萄肖葉甲(ColaspisbrunneaFabricius)、黑角負(fù)泥蟲(OulemamelanopusLinnaeus)、向日葵葉甲(ZygogrammaexclamationisFabricius))，和瓢蟲科的甲蟲(例如墨西哥豆瓢蟲(EpilachnavarivestisMulsant))。進(jìn)一步的實(shí)例是金龜子(chafer)和金龜子科的其他甲蟲(例如日本甲蟲(PopilliajaponicaNewman)、北方圓頭犀金龜(白蠐螬，CyclocephalaborealisArrow)、南方圓頭犀金龜(白蠐螬，CyclocephalaimmaculataOlivier)、歐洲金龜子(RhizotrogusmajalisRazoumowsky)、白蠐螬(PhyllophagacrinitaBurmeister)、胡蘿卜甲蟲(LigyrusgibbosusDeGeer)，以及絲爪鰓金龜屬(Holotrichiaspp)和鰓角金龜屬(Melolontha)的金龜子)。鞘翅目害蟲的更多實(shí)例有象鼻蟲(例如苜蓿葉象甲(AnthonomusgrandisBoheman)、稻水象甲(LissorhoptrusoryzophilusKuschel)、谷象(SitophilusgrananusLinnaeus)、米象(SitophilusoryzaeLinnaeus)、和三葉草葉象(HyperapunctataFabricius))。還包括玉米象蟲(SphenophorusmaidisChittenden)、跳甲(例如玉米跳甲(ChaetocnemapulicaraMelsheimer)和十字花科跳甲(PhyllotretacruciferaeGoeze))，十一星瓜葉甲(Diabroticaundecimpunctata)，和根蟲(例如西方玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)、北方玉米根蟲(DiabroticabarbenSmith&Lawrence)和南方玉米根蟲(DiabroticaundecimpunctatahowardiBarber))。鞘翅目害蟲的更多實(shí)例有麗金龜亞科(Rutelinae)的甲蟲(麗金龜)，例如異麗金龜屬(Anomala)(包括A.marginata、A.lucicola、A.oblivia和A.orientalis)。其他鞘翅目昆蟲有皮蠹科的地毯甲蟲，來自叩甲科的金針蟲(例如梳爪叩甲屬(Melanotusspp.)、單葉叩甲屬(Conoderusspp.)、丘胸叩甲屬(Limoniusspp.)、細(xì)胸叩甲屬(Agriotesspp.)、Cteniceraspp.、Aeolusspp.))、來自小蠹科的小蠹(barkbeetles)；來自擬步甲科的甲蟲(例如偽金針蟲屬(Eleodesspp))。上文列出的任何屬(以及其他)，一般而言，也可以作為包含單獨(dú)的DIG-303殺蟲多肽或其與其他殺蟲作用劑的組合的殺蟲組合物的靶標(biāo)作為本主題發(fā)明的一部分。這些屬中的任何者的任何其他昆蟲(作為靶標(biāo))也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？紤]了DIG-303殺蟲毒素用于控制作物植物的鞘翅目害蟲的用途。在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)濟(jì)地部署Cry蛋白用于控制昆蟲害蟲，包括但不限于，例如，根蟲，如西方玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)、北方玉米根蟲(DiabroticabarberiSmith&Lawrence)、和南方玉米根蟲(DiabroticaundecimpunctatahowardiBarber)，以及蠐螬，如Cyclocephalaborealis(北方圓頭犀金龜)、圓頭無斑犀金龜(Cyclocephalaimmaculate)(南方圓頭犀金龜)和日本麗金龜(Popilliajaponica)(日本甲蟲)。鱗翅目是另一群重要的農(nóng)業(yè)、園藝和家庭害蟲，每年造成極大量的損失。本發(fā)明提供DIG-303毒素與其他殺蟲劑組合用于控制該目中的昆蟲害蟲的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這一目昆蟲涵蓋食葉和食根的幼蟲和成蟲，包括例如燈蛾科(Arctiidae)、麥蛾科(Gelechiidae)、尺蛾科(Geometridae)、枯葉蛾科(Lasiocampidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、夜蛾科(Noctuidae)、螟蛾科(Pyralidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、天蛾科(Sphingidae)、谷蛾科(Tineidae)、和卷葉蛾科(Tortricidae)等昆蟲科的成員。鱗翅目害蟲包括，但不限于：小蠟螟(Achoroiagrisella)、東部黑頭長翅卷蛾(Aclerisgloverana)、黑頭長翅卷蛾(Aclerisvariana)、棉褐帶卷葉蛾(Adoxophyesorana)、小地老虎(Agrotisipsilon)、Alabamaargillacea、秋星尺蠖(Alsophilapometaria)、Amyeloistransitella、地中海粉螟(Anagastakuehniella)、桃條麥蛾(Anarsialineatella)、Anisotasenatoria、柞蠶(Antheraeapernyi)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、黃卷蛾屬(Archipssp.)、條卷蛾屬(Argyrotaeniasp.)、Athetismindara、家蠶(Bombyxmori)、棉潛葉蛾(Bucculatrixthurberiella)、粉斑螟(Cadracautella)、色卷蛾屬(Choristoneurasp.)、Cochyllshospes、苜蓿粉蝶(Coliaseurytheme)、米蛾(Corcyracephalonica)、Cydialatiferreanus、蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)、Datanaintegerrima、落葉松毛蟲(Dendrolimussibericus)、Desmiafeneralis、甜瓜絹野螟(Diaphaniahyalinata)、黃瓜絹野螟(Diaphanianitidalis)、西南玉米桿草螟(Diatraeagrandiosella，巨座玉米螟)、小蔗螟(Diatraeasaccharalis，甘蔗螟)、白尺蠖蛾(Ennomossubsignaria)、Eoreumaloftini、煙草粉螟(Esphestiaelutella)、Erannistilaria、細(xì)斑燈蛾(Estigmeneacrea)、Euliasalubricola、Eupocoelliaambiguella、女貞細(xì)卷蛾(Eupoeciliaambiguella)、黃毒蛾(Euproctischrysorrhoea)、暗緣地老虎(Euxoamessoria)、蠟螟(Galleriamellonella)、梨小食心蟲(Grapholitamolesta)、黑擬蛉蛾(Harrisinaamericana)、Helicoverpasubflexa、谷實(shí)夜蛾(Helicoverpazea，玉米夜蛾)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens，煙草夜蛾)、新墨西哥草原毛蟲(Hemileucaoliviae)、向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)、美國白蛾(Hyphantiacunea)、Keiferialycopersicella、Lambdinafiscellariafiscellaria、Lambdinafiscellarialugubrosa、雪毒蛾(Leucomasalicis)、葡萄漿果小卷蛾(Lobesiabotrana)、Loxagrotisalbicosta(西部豆地老虎)、草地螟(Loxostegesticticalis)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、Macallathyrisalis、天幕毛蟲屬(Malacosomasp.)、甘藍(lán)燈蛾(Mamestrabrassicae)、蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)、番茄天蛾(Manducaquinquemaculata)、煙草天蛾(Manducasexta)、豆野螟(Marucatestulalis)、斑馬紋夜蛾(Melanchrapicta)、秋尺蛾(Operophterabrumata)、古毒蛾屬(Orgyiasp.)、歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、Paleacritavernata、Papiapemanebris(普通鉆心蟲)、Papiliocresphontes、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)、Phryganidiacalifornica、Phyllonorycterblancardella、暗脈菜粉蝶(Pierisnapi)、油菜菜粉蝶(Pierisrapae)、苜蓿綠夜蛾(Plathypenascabra)、Platynotaflouendana、荷蘭石竹小卷蛾(Platynotastultana)、Platyptiliacarduidactyla、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、Pontiaprotodice、一點(diǎn)粘蟲(Pseudaletiaunipuncta、粘蟲)、大豆夜蛾(Pseudoplasiaincludens)、Sabulodesaegrotata、Schizuraconcinna、麥蛾(Sitotrogacerealella)、蘋白小卷蛾(Spilontaocellana)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda，秋粘蟲)；甜菜夜蛾(Spodopteraexigua，beetarmyworm)、松異舟蛾(Thaurnstopoeapityocampa)、Ensolabisselliella、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)(甘藍(lán)銀紋夜蛾)、溫室結(jié)網(wǎng)野螟(Udearubigalis)、Xylomygescuriails和蘋果巢蛾(Yponomeutapadella)。還考慮了DIG-303殺蟲毒素用于控制寄生線蟲的用途，所述寄生線蟲包括但不限于：根癌線蟲(Meloidogyneicognita)和大豆囊線蟲病線蟲[大豆異皮線(Heteroderaglycines)]?？苟舅乜贵w:可應(yīng)用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法容易地制備針對本文公開的毒素、或針對這些毒素的等價(jià)毒素或片段的抗體。此類抗體可用于檢測DIG-303殺蟲毒素的存在。一旦分離了B.t.殺蟲毒素，則可通過本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生對該毒素特異的抗體。在數(shù)周或數(shù)月的期間內(nèi)重復(fù)注射至所選擇的宿主將誘發(fā)免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生顯著的抗B.t.毒素血清滴度。優(yōu)選的宿主是哺乳動(dòng)物物種，更優(yōu)選的物種是兔、山羊、綿羊和小鼠。從此類免疫動(dòng)物獲取的血液可通過已建立的方法加工，從而得到與B.t.殺蟲毒素反應(yīng)的抗血清(多克隆抗體)。然后可根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，通過吸附至該毒素從而親和純化該抗血清。親和純化的抗血清可通過本領(lǐng)域已知的方法分離該抗血清內(nèi)的免疫球蛋白級分從而進(jìn)一步加以純化。得到的材料將是與B.t.殺蟲毒素反應(yīng)的免疫球蛋白的異質(zhì)的群體?？笲.t.毒素抗體還可通過制備半合成免疫原而產(chǎn)生，所述半合成免疫原由與免疫原性載體綴合的B.t.殺蟲毒素的合成肽片段組成?？捎糜谥苽潆钠蔚亩喾N方案和儀器是本領(lǐng)域公知的。許多合適的免疫原性載體諸如牛血清白蛋白或鑰孔戚血藍(lán)蛋白也是本領(lǐng)域公知的，用于偶聯(lián)免疫原和載體蛋白的技術(shù)也是公知的。一旦構(gòu)建了半合成免疫原，則制備對B.t.殺蟲毒素片段特異的抗體的方法與制備和天然B.t.毒素反應(yīng)的抗體的方法是相同的。抗B.t.毒素單克隆抗體(MAbs)可容易地應(yīng)用純化的B.t.殺蟲毒素制備。用于產(chǎn)生MAbs的方法已實(shí)施20多年，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。重復(fù)腹膜內(nèi)或皮下注射佐劑中的純化B.t.殺蟲毒素將在多數(shù)動(dòng)物中誘發(fā)免疫反應(yīng)。從動(dòng)物中取出高免疫B-淋巴細(xì)胞，并與能夠無限培養(yǎng)的合適的融合配偶體細(xì)胞系融合。優(yōu)選的其B淋巴細(xì)胞可被高免疫并可用于產(chǎn)生MAbs的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選的動(dòng)物是大鼠和小鼠，最優(yōu)選的是BALB/c小鼠株系。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的合適融合配偶。許多此類細(xì)胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)及商業(yè)供應(yīng)者處獲得。優(yōu)選的融合配偶細(xì)胞系衍生自小鼠骨髓瘤，并且Friendly骨髓瘤-653細(xì)胞系(Ventrex、Portland，ME)是最優(yōu)選的。一旦融合，則在選擇生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的雜交瘤細(xì)胞1至2周。兩個(gè)公知的選擇系統(tǒng)可用于從混合的雜交瘤培養(yǎng)物中消除未混合的骨髓瘤細(xì)胞、或兩個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的融合。選擇系統(tǒng)的選擇取決于免疫的小鼠株以及所使用的雜交瘤融合配偶體。可使用Taggart和Samloff(1983)描述的AAT選擇系統(tǒng)；然而，由Littlefield(1964)描述的HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)是優(yōu)選的，因?yàn)槠淇膳c上述優(yōu)選的小鼠株及融合配偶相容。然后對用過的生長培養(yǎng)基中篩選免疫特異性MAb分泌。酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)法最適于這一目的；但適用于大體積篩選的放射免疫測試法也是可接受的?？蛇M(jìn)行被設(shè)計(jì)用于連續(xù)地減少相當(dāng)數(shù)量的無關(guān)或不太期望的培養(yǎng)基的多重篩選?？舍槍εc已知B.t.殺蟲毒素的交叉反應(yīng)性篩選分泌與B.t.殺蟲毒素反應(yīng)的MAb的培養(yǎng)物?？蓱?yīng)用商業(yè)提供的測試鑒定優(yōu)先與優(yōu)選的B.t.殺蟲毒素結(jié)合的MAbs的同種型。優(yōu)選的MAbs是IgG類，更高優(yōu)選的MAbs是IgG1和IgG2a亞同種型?？蓙喛寺?shù)次分泌優(yōu)選的MAbs的雜交瘤培養(yǎng)物，以建立單克隆性和穩(wěn)定性。用于亞克隆真核、非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物的已知方法包括有限稀釋、軟瓊脂糖和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)。在每次亞克隆后，優(yōu)選針對抗體分泌和亞型再次分析得到的培養(yǎng)物，以確保建立了穩(wěn)定分泌優(yōu)選MAb的培養(yǎng)物?？笲.t.毒素抗體可用于檢測本發(fā)明要求保護(hù)的B.t.殺蟲毒素及其變體或片段的各種方法中。公知用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的抗體可用于鑒定各種環(huán)境中抗原的存在。用放射性同位素標(biāo)記的抗體已在放射免疫測試中用了數(shù)十年，其以高精度和靈敏度鑒定各種生物液體中抗原的存在。最近，酶標(biāo)記的抗體已在ELISA測試中用作放射標(biāo)記的抗體的替代手段。此外，可將與本發(fā)明B.t.殺蟲毒素免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合至固定物質(zhì)，諸如聚苯乙烯孔或顆粒，并用于確定測試樣本中是否存在B.t.毒素的免疫測試法中。應(yīng)用探針檢測:用于鑒定本發(fā)明的毒素和基因的其他方法是通過使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測的核苷酸序列。這些序列是依靠恰當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記或者如美國專利號6268132中所述的制作成固有熒光性的，從而使得能夠被檢測。如本領(lǐng)域所熟知，如果探針分子與核酸樣品通過在該兩個(gè)分子間形成強(qiáng)堿基配對鍵而雜交，可以有理由認(rèn)為該探針和樣品具有相當(dāng)?shù)耐葱浴?yōu)選地，通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，例如如Keller和Manak(1993)所描述的那樣。探針檢測提供了以已知的方式確定雜交是否發(fā)生的方法。此種探針分析提供了鑒定本發(fā)明編碼毒素的基因的快速方法。作為本發(fā)明探針使用的核苷酸片段可以使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行合成。這些核苷酸序列還可以用作PCR引物，用于擴(kuò)增本發(fā)明的基因。雜交:如分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那樣，兩個(gè)核酸分子的相似性可通過它們的雜交傾向來表征。如本文所使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”是指這樣條件，在該條件下探針以比與其他序列更高程度地(例如，比背景高至少2倍)可檢測地與其靶序列雜交(退火)。嚴(yán)格條件是序列依賴的，并且在不同的環(huán)境下會(huì)不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格程度，可鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測)。備選地，可調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件，以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測較低程度的相似性(異源探測)。一般地，探針少于100個(gè)核苷酸長，優(yōu)選少于500個(gè)核苷酸長。一般地，嚴(yán)格條件將是以下這些：其中在pH7.0至pH8.3下鹽濃度低于約1.5MNa離子，一般為約0.01至1.0MNa離子濃度(或其他鹽)，并且對于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言至少約30℃、對于長探針(例如，超過50個(gè)核苷酸)而言至少約60℃的溫度。嚴(yán)格條件也可通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑而實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格條件包括用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37℃雜交，并在50℃至55℃在1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括用40％至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中在37℃雜交，并在55℃至60℃在0.5X至1XSSC中洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括用50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃雜交，并在60℃至65℃在0.1XSSC中洗滌。任選地，洗滌緩沖液可包含約0.1％至約1％SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間一般少于約24小時(shí)，通常為約4至約12小時(shí)。特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于DNA/DNA雜交，熱溶解點(diǎn)(Tm)是其中50％的互補(bǔ)靶序列與優(yōu)選匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子濃度和pH下)。每1％的錯(cuò)配，則Tm降低約1℃；因此，可調(diào)節(jié)Tm、雜交條件和/或洗滌條件以促進(jìn)期望同一性的序列的退火。例如，若尋找具有>90％同一性的序列，則Tm可降低10℃。一般地，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列和它的互補(bǔ)序列在確定離子強(qiáng)度和pH下的Tm低約5℃。然而，高嚴(yán)格條件可應(yīng)用在比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃下的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可應(yīng)用在比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下的雜交和/或洗滌；以及低嚴(yán)格條件可應(yīng)用在比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的雜交和/或洗滌；Tm(單位為℃)可實(shí)驗(yàn)確定或可通過計(jì)算估計(jì)。對于DNA-DNA雜交，可從Meinkoth和Wahl(1984)等式估計(jì)Tm：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比(w/v)，并且L是雜交的堿基對長度。備選地，Tm由以下公式描述(Beltz等，1983)。Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L其中，[Na+]是鈉離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比(w/v)，并且L是雜交的堿基對長度。應(yīng)用上述的等式、雜交和洗滌組分，以及期望的Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格度的變化均已被內(nèi)在地規(guī)定。如果期望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，優(yōu)選增加SSC濃度，使得可使用更高的溫度。核酸雜交的廣泛指引可在Tijssen(1993)和Ausubel等(1995)中找到，還參見Sambrook等(1989)。可通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，同上)進(jìn)行應(yīng)用放射標(biāo)記的基因特異性探針，在DNA印跡上對固定的DNA的雜交。用于標(biāo)記多核苷酸探針的放射性同位素可包括32P、33P、14C或3H。將放射性同位素?fù)饺攵嗪塑账崽结樂肿涌赏ㄟ^分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法的任一種完成。(參見，Sambrook等，同上)。一般地，在允許檢測與所要求保護(hù)的毒性編碼基因具有同源性的靶序列的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交和隨后的洗滌。對于雙鏈DNA基因探針，可在6XSSPE、5XDenhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/mL變性DNA中，在比DNA雜種分子的Tm低20℃-25℃下進(jìn)行雜交過夜(20XSSPE是3MNaCl、0.2MNaHPO4和0.02MEDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)；100XDenhardt溶液是20gm/L聚乙烯吡咯烷酮、20gm/LFicoll400型和20gm/L牛血清白蛋白(級分V))。通?？梢匀缦逻M(jìn)行洗滌：室溫下1XSSPE，0.1％SDS中15分鐘兩次(低嚴(yán)格洗滌)。在0.2XSSPE，0.1％SDS中-20℃洗滌一次15分鐘(中等嚴(yán)格洗滌)。對于寡核苷酸探針，在在6XSSPE、5XDenhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在低于雜種分子的Tm10℃-20℃下進(jìn)行雜交過夜。通過以下公式確定寡核苷酸探針的Tm(Suggs等人，1981)：Tm(℃)＝2(T/A堿基對數(shù)目)+4(G/C堿基對數(shù)目)通?？梢匀缦逻M(jìn)行洗滌：室溫下1XSSPE，0.1％SDS中15分鐘兩次(低嚴(yán)格洗滌)。在1XSSPE，0.1％SDS中雜交溫度下洗滌一次15分鐘(中等嚴(yán)格洗滌)?？赏ㄟ^除放射性標(biāo)記之外的方法使用于雜交的探針分子及探針與靶分子之間形成的雜種分子可檢測。此類備選的方法包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文提到或引用的所有專利、專利申請、臨時(shí)申請和出版物都完整引入本文，以它們沒有與本說明書的明確教導(dǎo)不一致為限。本文通過使用術(shù)語“遺傳材料”，其意思是包括所有的基因、核酸、DNA和RNA。術(shù)語“dsRNA”指雙鏈RNA。為命名多核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸和引物的核苷酸殘基，以及命名蛋白質(zhì)的氨基酸殘基，在本文間中使用了標(biāo)準(zhǔn)的IUPAC簡寫。核酸序列以標(biāo)準(zhǔn)的5’至3’方向呈現(xiàn)，以及蛋白質(zhì)序列以標(biāo)準(zhǔn)的氨基(N)端至羧基(C)端方向呈現(xiàn)。本文描述的這些實(shí)施例和實(shí)施方案應(yīng)該解釋為僅用于闡明的目的，并且在其教導(dǎo)下的各種修飾和改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易想到的，并且包括在本申請的精神和范圍之內(nèi)，并且包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。這些實(shí)施例不能被理解為是限制性的除非另有明確說明，術(shù)語“一”和“該”在本文中使用時(shí)表示“至少一”。除非另外注釋，所有的百分?jǐn)?shù)是以重量計(jì)，并且所有溶劑混合物比例是以體積計(jì)。所有的溫度是攝氏度。實(shí)施例1分離編碼DIG-303毒素的基因除非另有說明，本實(shí)施例和后續(xù)實(shí)施例中描述的分子生物學(xué)和生物化學(xué)操作通過例如Ausubel等人(1995)和Sambrook等人(1989)及其更新所公開的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。從B.t.菌株P(guān)S18A，也稱為DBt10340，分離了編碼本文命名為DIG-303的殺蟲Cry蛋白的核酸。設(shè)計(jì)了用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的簡并正向和反向引物，用這些引物從基因組DNA文庫擴(kuò)增出一個(gè)與Cry32同源的DNA片段。使用該擴(kuò)增片段的測定的序列再進(jìn)行基因組步移，獲得DIG-303的完整開放閱讀框。SEQIDNO:1是編碼全長DIG-303蛋白的3771bp核苷酸序列。SEQIDNO:2是從SEQIDNO:1推導(dǎo)的全長DIG-303蛋白的1257個(gè)氨基酸序列。實(shí)施例2在細(xì)菌宿主中表達(dá)DIG-303嵌合毒素使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens，Pf)表達(dá)質(zhì)粒，所述質(zhì)粒被工程化以產(chǎn)生DIG-303嵌合毒素，由DIG-303核心毒素編碼序列(編碼氨基酸1-685)和如上所述的Cry1AbC末端原毒素編碼區(qū)段組成，二者分別由玉米優(yōu)化的編碼序列編碼。從NewEnglandBioLabs(NEB；Ipswich，MA)獲得限制性內(nèi)切酶，并將T4DNA連接酶(Invitrogen)用于DNA連接。應(yīng)用質(zhì)粒試劑盒(Macherey-NagelInc，Bethlehem，PA)，根據(jù)供應(yīng)商的說明進(jìn)行質(zhì)粒制備。在瓊脂糖Tris乙酸凝膠電泳后應(yīng)用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化DNA片段。線性化的載體用NEBAntarctic磷酸酶進(jìn)行磷酸酶處理以強(qiáng)化重組分子的形成。基礎(chǔ)克隆策略涉及將具有DIG-303Cry1Ab嵌合物編碼序列(CDS)的DNA片段亞克隆至pDOW1169的例如SpeI和SalI限制性位點(diǎn)之間，由此該DIG-303嵌合物CDS被置于Ptac啟動(dòng)子和來自質(zhì)粒pKK223-3(PLPharmacia，Milwaukee，WI)的rrnBT1T2終止子的表達(dá)控制之下。pDOW1169是中等拷貝質(zhì)粒，具有RSF1010復(fù)制起始點(diǎn)、pyrF基因、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可將含有蛋白質(zhì)編碼區(qū)的DNA片段引入所述限制酶識(shí)別位點(diǎn)中(美國專利號7618799)。通過電穿孔將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DC454(具有突變?chǔ)yrF和lsc::lacIQI的近野生型熒光假單胞菌)或其衍生物，在SOC-大豆水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中回收，并置于選擇培養(yǎng)基上(缺乏尿嘧啶的M9葡萄糖瓊脂，Sambrook等，同上)。轉(zhuǎn)化與選擇方法的細(xì)節(jié)的一般性描述可在通過引用并入本文的Squires等，(2004)；美國專利申請?zhí)?0060008877；美國專利號7681799和美國專利申請?zhí)?0080058262中得到。通過對小提質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制消化鑒定重組菌落。有多種適合熒光假單胞菌生長的培養(yǎng)基可供使用，例如，如Huangetal.2007和美國專利申請?zhí)?0060008877所述。在來自熒光假單胞菌發(fā)酵的細(xì)胞中產(chǎn)生了不溶性的B.t.殺蟲蛋白包涵體。通過搖瓶培養(yǎng)含有表達(dá)構(gòu)建體熒光假單胞菌菌株，實(shí)現(xiàn)了用于表征和昆蟲生物測試的DIG-303嵌合物的生產(chǎn)。用在補(bǔ)充有葡萄糖和痕量元素的M9培養(yǎng)基中生長的種子培養(yǎng)物接種最小培養(yǎng)基。振蕩下在30°初始培養(yǎng)24小時(shí)后，通過添加異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)從而誘導(dǎo)DIG-303嵌合物編碼序列的表達(dá)。在誘導(dǎo)的時(shí)候以及在誘導(dǎo)后不同的時(shí)間取樣培養(yǎng)基。通過600nm處的光密度(OD600)測量細(xì)胞密度。有多種適合熒光假單胞菌生長的培養(yǎng)基可供使用，例如，如Huangetal.2007和美國專利申請?zhí)?0060008877所述。在來自熒光假單胞菌發(fā)酵的細(xì)胞中產(chǎn)生了不溶性的B.t.殺蟲蛋白包涵體。簡而言之，裂解細(xì)胞，通過離心制備離心沉淀和上清液部分，將離心沉淀重新懸浮并通過在裂解緩沖液中再懸浮反復(fù)洗滌，直到上清液變得無色，并且IB離心沉淀物變得堅(jiān)實(shí)且顏色呈灰白。將最終的離心沉淀洗滌，重懸于含有2mMEDTA的無菌過濾蒸餾水中，并儲(chǔ)存在-80℃。通過柱層析富集上清液級分中的重組蛋白。通過SDS_PAGE分析制備物。通過將條帶的光密度值與在相同凝膠上運(yùn)行的牛血清白蛋白(BSA)樣品進(jìn)行比較來給靶條帶定量，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后使用一次性PD-10柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ)將樣品緩沖液變?yōu)閜H10的10mMCAPS(3-(環(huán)己基氨基)1-丙磺酸)。濃縮的提取物通過SDS_PAGE進(jìn)行分析并相對于背景扣除的BSA標(biāo)準(zhǔn)物定量，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算DIG-303嵌合體的濃度。實(shí)施例3玉米密碼子優(yōu)化的序列SEQIDNO:3的設(shè)計(jì)植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可以設(shè)計(jì)多種DNA序列來編碼單個(gè)氨基酸序列。一個(gè)常用的增加感興趣的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)的表達(dá)的手段是以這樣的方式定制編碼區(qū)，使得其密碼子組成類似于該基因確定要在其中表達(dá)的宿主的總體密碼子組成。關(guān)于合成基因的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的指導(dǎo)可以在例如WO1997013402、美國專利號6,166,302和美國專利5,380,831中找到。設(shè)計(jì)并合成具有玉米密碼子偏倚的DNA序列，用以在轉(zhuǎn)基因單子葉植物中產(chǎn)生DIG-303殺蟲蛋白。根據(jù)從GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中存儲(chǔ)的序列獲得的數(shù)百種蛋白質(zhì)編碼序列計(jì)算玉米(ZeamaysL.)的密碼子使用表。省略任何使用量小于該氨基酸的總密碼子用量的約10％的同義密碼子，然后計(jì)算重定標(biāo)(rescaled)的玉米密碼子組。為了得到編碼SEQIDNO:3的DIG-303蛋白或其殺蟲片段的玉米密碼子優(yōu)化的DNA序列，對天然DIG-303DNA序列(SEQIDNO:1)進(jìn)行了取代，使得所得的DNA序列具有玉米優(yōu)化的密碼子偏倚表的總密碼子組成。對該序列進(jìn)行進(jìn)一步精修以消除不期望的限制酶識(shí)別位點(diǎn)、潛在的植物內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、長段的A/T或C/G殘基，以及可能干擾編碼的mRNA穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它基序植物細(xì)胞中的區(qū)域。進(jìn)行其他改變以引入所需的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，并消除長內(nèi)部開放閱讀框架(+1以外的框架)。這些變化都是在保持玉米偏倚的重定標(biāo)密碼子組成約束條件之內(nèi)進(jìn)行的。實(shí)施例4在細(xì)菌宿主中構(gòu)建編碼DIG-303毒素的表達(dá)質(zhì)粒使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建熒光假單胞菌(Pf)表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒被工程改造從而產(chǎn)生由玉米優(yōu)化的編碼序列所編碼的DIG-303。限制性內(nèi)切核酸酶得自NewEnglandBioLabs(NEB；Ipswich，MA)，T4DNA連接酶(Invitrogen)用于DNA連接。按照供應(yīng)商的指示，使用質(zhì)粒試劑盒(Macherey-NagelInc，Bethlehem，PA)進(jìn)行質(zhì)粒制備。在瓊脂糖Tris-乙酸凝膠電泳后，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化DNA片段。線性化載體用NEBAntarctic磷酸酶進(jìn)行磷酸酶處理，以強(qiáng)化重組分子的形成。將具有如SEQIDNO:3所示的DIG-303編碼序列(CDS)的DNA片段亞克隆到pDOW1169中，例如SpeI和SalI限制性位點(diǎn)處，由此將DIG-303CDS置于Ptac啟動(dòng)子和來自質(zhì)粒pKK223-3(PLPharmacia，Milwaukee，WI)的rrnBT1T2終止子的表達(dá)控制下。pDOW1169是一種中等拷貝質(zhì)粒，具有RSF1010復(fù)制起點(diǎn)、pyrF基因、以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，其中限制酶識(shí)別位點(diǎn)中可以引入含有蛋白質(zhì)編碼區(qū)的DNA片段(美國專利號7618799)。通過電穿孔將表達(dá)質(zhì)粒(pDAB107162，含有DIG-303編碼序列)轉(zhuǎn)化入DC454(具有突變?chǔ)yrF和lsc::lacIQI的近野生型熒光假單胞菌菌株)或其衍生物，在SOC-大豆水解產(chǎn)物中恢復(fù)，然后在選擇性培養(yǎng)基(缺乏尿嘧啶的M9葡萄糖瓊脂，Sambrook等人，同上)上鋪板。轉(zhuǎn)化和選擇方法一般描述于：Squires等人(2004)，美國專利申請?zhí)?0060008877，美國專利號7681799和美國專利申請?zhí)?0080058262，通過引用將它們并入本文。通過限制酶消化小提質(zhì)粒DNA來鑒定重組菌落。所得的表達(dá)菌株在陶氏益農(nóng)公司重組培養(yǎng)物收集處(DowAgroSciencesRecombinantCultureCollection)中稱為DPf21990。實(shí)施例5制備DIG-303蛋白樣品通過在含有表達(dá)質(zhì)粒pDAB107162的搖瓶生長的熒光假單胞菌熒光菌菌株DPf21990中表達(dá)DIG-303，實(shí)現(xiàn)了用于表征和昆蟲生物測定的DIG-303的生產(chǎn)。使用補(bǔ)充有葡萄糖和微量元素的M9培養(yǎng)基中生長的種子培養(yǎng)物接種限定的基本培養(yǎng)基。在30℃振蕩初始溫育24小時(shí)后，通過加入異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)DIG-303編碼區(qū)的表達(dá)。在誘導(dǎo)時(shí)和誘導(dǎo)后的不同時(shí)間對培養(yǎng)物進(jìn)行取樣。通過600nm處的光密度(OD600)測量細(xì)胞密度。將最終的離心沉淀洗滌，重懸于含有2mMEDTA的無菌過濾蒸餾水中，并儲(chǔ)存在-80℃。通過離心收集包涵體(IB)離心沉淀，再懸浮，并反復(fù)通過重懸在裂解緩沖液中來洗滌，直到上清液變成無色，并且IB顆粒變得堅(jiān)實(shí)且呈灰白色。通過SDS_PAGE分析IB制備物。通過將條帶的光密度值與在相同凝膠上運(yùn)行的牛血清白蛋白(BSA)樣品進(jìn)行比較來給靶條帶定量，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后使用10mMCAPS(3-(環(huán)己氨基)1-丙磺酸)緩沖液(pH10)從包涵體中提取靶蛋白，并在平臺(tái)上輕輕搖動(dòng)4℃過夜。將溶解的DIG-303離心，將得到的上清液濃縮。濃縮提取物通過SDSPAGE相對于背景扣除的BSA標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行分析和定量，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算DIG-303的濃度。實(shí)施例6DIG-303殺蟲毒素的昆蟲活性測試DIG-303，發(fā)現(xiàn)其對鞘翅目昆蟲(科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata))的幼蟲具有殺蟲活性。在用第二齡科羅拉多馬鈴薯甲蟲(CPB，Leptinotarsadecimlineata)幼蟲進(jìn)行的生物測定中，測試含有全細(xì)胞(表2)或純化蛋白質(zhì)(溶解的或作為包含體；表4)的溶液的殺蟲活性。從BayerCorp.(Pittsburg，PA)獲得昆蟲卵。生物測定在128孔塑料托盤中進(jìn)行。每個(gè)孔含有0.5mL水瓊脂和一個(gè)用軟木鑿子切割下來的1.5cm直徑的“黑美人”茄子(Solanummelongena)葉盤。測試葉盤用40μl三倍稀釋的DIG-303全細(xì)胞處理。用作殺蟲活性陽性對照的葉盤用1μg/mLCry3Aa全長原毒素處理。陰性對照葉盤用緩沖液處理或不處理。將經(jīng)處理的葉盤保持在通風(fēng)櫥中，直到表面上的液體蒸發(fā)或被吸收到餌食中。在孵化后約2天，用潤濕的駱駝毛刷取出個(gè)體幼蟲，并將其放置在經(jīng)處理的葉片上，每孔一只幼蟲。然后用透明塑料粘合片將帶蟲的孔密封，粘合片是通氣的，以允許氣體交換(C-DInternational，Pitman，NJ)。上述每個(gè)處理完成了11～16個(gè)重復(fù)。溫育兩天后，記錄葉盤損傷的估計(jì)百分比、死亡昆蟲數(shù)量、和存活昆蟲重量。生物測定盤保持在受控環(huán)境條件下(28℃，～40％相對濕度，16:8(光：暗))。計(jì)算每次處理的百分比死亡率和生長抑制百分比。生長抑制(GI)計(jì)算如下：GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]其中TWIT是處理中的昆蟲總重量，TNIT是處理中的昆蟲總數(shù)，TWIBC是背景檢查中的昆蟲的總重量(緩沖液對照)，TNIBC是背景檢查中的昆蟲總數(shù)(緩沖區(qū)對照)。生物測定結(jié)果總結(jié)在下表2和表4中。生物測定結(jié)果顯示，對于全細(xì)胞DIG-3031:10稀釋處理(表2)，葉損傷較少，生長抑制增加。重復(fù)的生物測定表明攝入DIG-303制劑導(dǎo)致科羅拉多馬鈴薯甲蟲的死亡和生長抑制(表4)。表2:在科羅拉多馬鈴薯甲蟲上進(jìn)行的DIG-303的全假單胞菌細(xì)胞活性生物測定在5日后的百分比死亡率、葉盤損傷比例、和生長抑制測試DIG-303，發(fā)現(xiàn)其對鱗翅目昆蟲小菜蛾(Plutellaxylostella)的幼蟲具有殺蟲活性(表3)。在96孔生物測定盤(C-DInternational，Pitman，NJ)中進(jìn)行小菜蛾(DBM)生物測定。將20μl等份的三倍稀釋的全細(xì)胞懸浮液投放到每個(gè)孔中的多物種鱗翅目餌食(SouthlandProducts，LakeVillage，AR)的表面上。將經(jīng)處理的托盤空氣干燥，并將一條單獨(dú)的幼蟲(孵化后24至48小時(shí))放置在處理過的餌食表面上。然后將帶蟲的孔用透明塑料的粘合片密封，通氣以允許氣體交換(C-DInternational，Pitman，NJ)。生物測定盤在受控的環(huán)境條件(28℃，40％相對濕度，16:8h光:暗光周期)下保持5天。重復(fù)的生物測定表明攝入DIG-303制備物導(dǎo)致了小菜蛾死亡(表3)。測試DIG-303，發(fā)現(xiàn)其對鞘翅目昆蟲玉米根蟲(玉米根螢葉甲(Diabroticavigiferavigifera))的幼蟲具有殺蟲活性(表5)。對于玉米根螢葉甲，遵循類似于DBM昆蟲生物測定的方法，不同之處如下：生物測定在128孔生物測定盤中進(jìn)行；使用DowAgroSciencesLLC專有的根蟲餌食；且使用80-100μl等份處理餌食表面。在所有昆蟲生物測定中記錄了暴露于每個(gè)蛋白質(zhì)樣品的昆蟲總數(shù)、死亡昆蟲的數(shù)量、和存活的昆蟲的重量。對于西方玉米根蟲檢測，使用胰蛋白酶活化的Cry3Aa和Cry34+Cry35作為陽性對照。陰性對照包括：水；未處理；Cry1F；20mM檸檬酸鈉，p.H.3.5；和10mMCAPS，pH10。表3:在小菜蛾上進(jìn)行的DIG-303的全假單胞菌細(xì)胞活性生物測定在5日后的百分比死亡率處理測試的昆蟲數(shù)％死亡率全細(xì)胞DIG-3031:10稀釋771.43全細(xì)胞DIG-3031:30稀釋771.43空載體(DPf5)1:10稀釋540空載體(DPf5)1:30稀釋50PBS80未處理320Cry1Ac(陽性對照)2100Cry3Aa2100在鱗翅目昆蟲上測試了從包涵體富集的DIG-303，使用與測試小菜蛾昆蟲所用的方法類似的方法，對玉米螟(CEW)、歐洲玉米螟(ECB)和秋粘蟲(FAW)進(jìn)行了與DBM昆蟲生物測定。沒有觀察到對CEW，ECB和FAW的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。表4.在科羅拉多馬鈴薯甲蟲上測試來自包涵體溶解(10mMCAPSpH10)的DIG-303蛋白表5.在128孔測定中在西方玉米根蟲上測試來自包涵體溶解的DIG-303蛋白(10mMCAPSpH10)，每孔一只昆蟲。實(shí)施例7土壤桿菌轉(zhuǎn)化在雙元植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中使用了標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶獲自NEB。應(yīng)用質(zhì)粒制備試劑盒或AXXtraMidi試劑盒(兩者均來自Macherey-Nagel)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行質(zhì)粒制備。應(yīng)用PCR純化試劑盒或QIAEXII凝膠提取試劑盒(兩者均來自Qiagen)在凝膠分離后純化DNA片段。包含編碼DIG-303殺蟲毒素的核苷酸序列的DNA由商業(yè)供應(yīng)商(例如，DNA2.0，MenloPark，CA)合成，并作為質(zhì)粒載體中的克隆片段提供。編碼其他DIG-303毒素的其他DNA序列通過對含有合適核苷酸序列的構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作而獲得。將編碼經(jīng)修飾的DIG-303片段的DNA片段與其他DIG-303殺蟲毒素編碼區(qū)片段或其他B.t.(Cry)編碼區(qū)片段在適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)處連接，以獲得編碼期望的全長DIG-303毒素蛋白。將DIG-303殺蟲毒素的全長或經(jīng)修飾的編碼序列(CDS)亞克隆至植物表達(dá)質(zhì)粒的NcoI和SacI限制位點(diǎn)中。得到的植物表達(dá)盒含有在植物表達(dá)元件(例如，植物表達(dá)啟動(dòng)子、3’端翻譯終止和聚腺苷酸附加序列等)控制下的適當(dāng)?shù)腃ry編碼區(qū)，將其亞克隆至雙元載體質(zhì)粒中，例如應(yīng)用技術(shù)或標(biāo)準(zhǔn)限制酶片段克隆方法克隆。如果使用技術(shù)，則可使用例如LRClonaseTM(Invitrogen)將全長和經(jīng)修飾的基因植物表達(dá)盒重組到雙元植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中。所述的雙元植物轉(zhuǎn)化載體包含細(xì)菌選擇標(biāo)記基因，該基因當(dāng)該質(zhì)粒存在于大腸桿菌和土壤桿菌細(xì)胞中時(shí)可賦予針對抗生素大觀霉素的抗性。該雙元載體質(zhì)粒還包含在期望的宿主細(xì)胞中有功能的可植物表達(dá)的選擇標(biāo)記基因，即轉(zhuǎn)座子Tn5的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(aphII)，其編碼對卡那霉素、新霉素和G418等抗生素的抗性。制備根癌土壤桿菌Z707S(Z707的鏈霉素抗性衍生物，Hepburn等，1985)的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并用電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Weigel和Glazebrook，2002)。電穿孔后，添加1mLYEP肉湯(gm/L:酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)至電轉(zhuǎn)杯中，并將細(xì)胞-YEP懸浮液轉(zhuǎn)移至15mL培養(yǎng)試管中，在水浴中28℃恒定攪拌下溫育4小時(shí)。將細(xì)胞涂板至含有大觀霉素(200μg/mL)和鏈霉素(250μg/mL)的YEP+瓊脂(25gm/L)上，并在28℃溫育該板2-4天。選擇分離良好的單克隆，在含大觀霉素和鏈霉素的YEP+瓊脂板上劃線，并在28℃溫育1-3天。用自選定的土壤桿菌菌落制備的質(zhì)粒DNA作為模板，應(yīng)用載體特異性引物，通過PCR分析驗(yàn)證DIG-303殺蟲毒素基因在雙元植物轉(zhuǎn)化載體中的存在。從15mL在YEP(如前所述含有大觀霉素和鏈霉素)中的過夜培養(yǎng)物取4mL的等份，離心沉淀細(xì)胞，用QiagenSpinMiniPreps根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行提取。來自在土壤桿菌電穿孔轉(zhuǎn)化中使用的雙元載體的空質(zhì)粒DNA被包含在內(nèi)作為對照。應(yīng)用來自Invitrogen的TaqDNA聚合酶，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，以0.5X濃度完成PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在MJResearchPeltier熱循環(huán)儀上進(jìn)行，所述熱循環(huán)儀編程的條件如下：步驟1)94℃3分鐘；步驟2)94℃45秒；步驟3)55℃30秒；步驟4)72℃1分鐘/kb預(yù)期產(chǎn)物長度；步驟5)29次至步驟2；步驟6)72℃10分鐘。循環(huán)后反應(yīng)保持在4℃。通過瓊脂糖凝膠電泳(例如，0.7％至1％瓊脂糖，w/v)分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過溴化乙錠染色顯現(xiàn)。選擇其PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒對照相同的克隆。通過土壤桿菌操作領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，對從候選土壤桿菌分離株制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制消化指紋圖譜作圖，完成另一個(gè)含DIG-3基因插入物的雙元植物轉(zhuǎn)化載體。實(shí)施例8在雙子葉植物中產(chǎn)生DIG-303殺蟲毒素?cái)M南芥轉(zhuǎn)化。應(yīng)用花序浸漬法(Weigel和Glazebrook，2002)轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsisthaliana)Col-01。用選定的土壤桿菌克隆接種1mL至15mL含有適當(dāng)?shù)倪x擇用抗生素的YEP肉湯培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在28℃220rpm恒定攪拌下溫育過夜。用每一培養(yǎng)物接種兩個(gè)500mL的含有適當(dāng)?shù)倪x擇用抗生素的YEP肉湯培養(yǎng)基，新培養(yǎng)物在恒定攪拌下在28℃溫育過夜。室溫下以約8700xg沉淀細(xì)胞10分鐘，棄去產(chǎn)生的上清液。將細(xì)胞沉淀輕柔地重懸于500mL含有以下物質(zhì)的滲透培養(yǎng)基中：1/2xMurashige和Skoog鹽(Sigma-Aldrich)/GamborgB5維生素(GoldBioTechnology，St.Louis，MO)、10％(w/v)蔗糖、0.044μM芐氨基嘌呤(10μL/升的在DMSO中的1mg/mL儲(chǔ)液)和300μL/升SilwetL-77。將約1個(gè)月大的植物浸入該培養(yǎng)基中15秒，小心地確保最新的花序被浸沒。側(cè)放植物，并覆蓋(透明或不透明)24小時(shí)，用水洗滌，并直立放置。使植物在22℃、16小時(shí)光/8小時(shí)暗的光周期下生長。浸泡約4周后，收獲種子。擬南芥生長和選擇使新鮮收獲的T1種子在室溫下在干燥劑的存在下干燥至少7天。將種子懸浮于0.1％瓊脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中，然后在4℃分層2天。為準(zhǔn)備種植，用細(xì)蛭石覆蓋在10.5英寸x21英寸發(fā)芽托盤(T.O.PlasticsInc.，Clearwater，MN)中的SunshineMixLP5(SunGroHorticultureInc.、Bellevue，WA)，用Hoagland溶液(Hoagland和Arnon，1950)地下灌溉直至潮濕，然后放置排水24小時(shí)。將分層的種子播種至蛭石上，并用潮濕的頂蓋(KORDProducts，Bramalea，Ontario，Canada)覆蓋7天。在光強(qiáng)度為120-150μmol/m2秒的長白晝條件(16小時(shí)光/8小時(shí)暗)下及恒定溫度(22℃)和濕度(40-50％)下，讓種子在ConvironTM生長室(CMP4030型或CMP3244型；ControlledEnvironmentsLimited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中發(fā)芽，并讓植物生長。植物最初用Hoagland溶液澆灌，隨后用去離子水澆灌，以保持土壤濕潤但不潮濕。播種5-6天后移除頂蓋，用化學(xué)選擇劑噴灑植物，以殺死從未轉(zhuǎn)化的種子萌出的植物。例如，若由雙元植物轉(zhuǎn)化載體提供的可植物表達(dá)的選擇標(biāo)記基因是pat或bar基因(Wehrmann等，1996)，則可通過噴灑1000X的Finale溶液(5.78％草胺磷，F(xiàn)arnamCompaniesInc.，Phoenix，AZ.)選擇轉(zhuǎn)化植物。隨后的兩次噴霧間隔5-7天進(jìn)行。最后一次噴霧后7-10天鑒定存活的植物(積極生長的植物)，并將其移栽至備有SunshineMixLP5的花盆中。移栽的植物用潮濕的頂蓋覆蓋3-4天，并置于上述生長條件下的ConvironTM生長室中。雙子葉植物所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠理解，當(dāng)使用其他可植物表達(dá)的選擇標(biāo)記基因(例如，除草劑抗性基因)時(shí)，其他的選擇轉(zhuǎn)化植物的方法也是可用的。轉(zhuǎn)基因擬南芥的害蟲生物測試在人工膳食覆蓋測試法中證實(shí)了表達(dá)DIG-303殺蟲毒素的轉(zhuǎn)基因擬南芥系對敏感的害蟲種類是有效的。通過適當(dāng)?shù)姆椒▽μ崛∽赞D(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因擬南芥系的蛋白進(jìn)行定量，并調(diào)整樣品的體積以標(biāo)準(zhǔn)化蛋白濃度。如上所述那樣在人工膳食上進(jìn)行生物測試。測定中包含非轉(zhuǎn)基因擬南芥和/或緩沖液及水，作為背景檢查處理。實(shí)施例9用于產(chǎn)生超雙元載體(superbinaryvectors)的土壤桿菌轉(zhuǎn)化土壤桿菌超雙元系統(tǒng)可方便地用于轉(zhuǎn)化單子葉植物。構(gòu)建和驗(yàn)證超雙元載體的方法是久已確立的，參見例如歐洲專利號EP604662B1和美國專利號7060876。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和微生物學(xué)方法產(chǎn)生超雙元質(zhì)粒。超雙元質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和核實(shí)/驗(yàn)證應(yīng)用如上述雙元載體所述的方法完成。實(shí)施例9在單子葉植物中產(chǎn)生DIG-303殺蟲毒素土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化將來自HighIIF1雜交的種子(Armstrong等，1991)種植在含有95％Metro-Mix360無土培養(yǎng)基(SunGroHorticulture，Bellevue，WA)和5％粘土/壤土的混合物的5加侖花盆中。使植物在應(yīng)用高壓鈉和金屬鹵化物燈組合的溫室中生長，光周期為16:8小時(shí)光:暗。為獲得用于轉(zhuǎn)化的未成熟F2胚，進(jìn)行人工同胞授粉。在授粉后8-10天，當(dāng)胚為約1.0至2.0mm大小時(shí)，分離未成熟的胚。感染和共培養(yǎng)如下對玉米穗進(jìn)行表面消毒：用液體皂洗滌，浸入70％乙醇中2分鐘，然后浸入20％商業(yè)漂白劑(0.1％次氯酸鈉)中30分鐘，再用無菌水潤洗。如下制備含有超雙元載體的土壤桿菌細(xì)胞的懸浮液：將1-2環(huán)在含有100mg/L大觀霉素、10mg/L四環(huán)素和250mg/L鏈霉素的YEP固體培養(yǎng)基上在28℃生長了2-3天的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至5mL含有100μM乙酰丁香酮的液體感染培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Linsmaier和Skoog，1965)、N6維生素(Chu等，1975)、1.5mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、68.5gm/L蔗糖、36.0gm/L葡萄糖、6mML-脯氨酸，pH5.2)中。渦旋振蕩該溶液，直到獲得均勻的懸浮液，然后將濃度調(diào)節(jié)至最終密度為200Klett單位(應(yīng)用配置紫色濾片的Klett-Summerson比色計(jì))或在600nm測得的相當(dāng)?shù)墓饷芏?OD600)。將未成熟的胚直接分離至含有2mL感染培養(yǎng)基的微量離心管中。移除該培養(yǎng)基，并更換為1mL密度為200Klett單位或相當(dāng)?shù)腛D600的土壤桿菌溶液，并在室溫下溫育該土壤桿菌和胚溶液5分鐘，并然后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N6維生素、1.5mg/L2,4-D、30.0gm/L蔗糖、6mML-脯氨酸、0.85mg/LAgNO3、100μM乙酰丁香酮、3.0gm/L吉蘭糖膠(PhytoTechnologyLaboratories.，Lenexa，KS)，pH5.8)中，在25℃在黑暗條件下保持5天。共培養(yǎng)后，將胚轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基中，此后在約8周的期間獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的分離株。為選擇已被含有可植物表達(dá)的pat或bar選擇標(biāo)記基因的超雙元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的玉米組織，與雙丙磷(GoldBioTechnology)一起使用LS基培養(yǎng)基(LS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，N6維生素、1.5mg/L2,4-D、0.5gm/LMES(2-(N-嗎啉代)甲磺酸一水合物；PhytoTechnologiesLabr.)、30.0gm/L蔗糖、6mML-脯氨酸、1.0mg/LAgNO3、250mg/L頭孢噻肟、2.5gm/L吉蘭糖膠，pH5.7)。將胚轉(zhuǎn)移至含有3mg/L雙丙磷的選擇培養(yǎng)基中，直到獲得生胚分離株。通過每隔2周將回收的分離株轉(zhuǎn)移至新鮮選擇培養(yǎng)基中來使分離株變大，用于再生和進(jìn)一步分析。玉米轉(zhuǎn)化所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)使用其他植物可表達(dá)的選擇標(biāo)記基因(例如，除草劑耐受基因)時(shí)，其他選擇轉(zhuǎn)化植物的方法也是可用的。再生和種子產(chǎn)生.為進(jìn)行再生，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至“28”誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS鹽和維生素、30gm/L蔗糖、5mg/L芐氨基嘌呤、0.25mg/L2、4-D、3mg/L雙丙磷、250mg/L頭孢噻肟、2.5gm/L吉蘭糖膠，pH5.7)中，在弱光條件(14μEm-2s-1)下保持1周，然后在強(qiáng)光條件(約89μEm-2s-1)下一周。然后將組織轉(zhuǎn)移至“36”再生培養(yǎng)基(除了缺乏植物生長調(diào)節(jié)因子外，與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)。當(dāng)植物長至3-5cm長時(shí)，將它們轉(zhuǎn)移至含有SHGA培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt(1972)鹽及維生素；PhytoTechnologiesLabr.)、1.0gm/L肌醇、10gm/L蔗糖和2.0gm/L吉蘭糖膠，pH5.8)的玻璃培養(yǎng)管中，以允許它們進(jìn)一步生長并發(fā)育枝條和根。將植物移植至與本文早前所描述的相同的土壤混合物中，并在溫室中使其生長至開花。進(jìn)行控制授粉以產(chǎn)生種子。實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因玉米的生物測定通過常規(guī)生物測定方法(例如參見，Huang等，2006)證實(shí)了植物細(xì)胞中產(chǎn)生的DIG-303殺蟲毒素的生物活性。例如，通過將衍生自產(chǎn)DIG-303殺蟲毒素植物的各種植物組織或組織塊飼喂受控飼喂環(huán)境中的靶昆蟲，可以證實(shí)效力。備選地，可從衍生自產(chǎn)DIG-303殺蟲毒素植物的各種植物組織中制備蛋白質(zhì)提取物，并將該提取的蛋白摻入如本文之前描述的人工膳食生物測定中。應(yīng)當(dāng)理解，此類飼喂測定的結(jié)果必須與應(yīng)用適當(dāng)對照組織類似進(jìn)行的生物測定相比較，其中所述對照組織來自不產(chǎn)生DIG-303殺蟲毒素的宿主植物；或與其他對照樣品相比較。參考文獻(xiàn)An,G.,Watson,B.D.,Stachel,S.,Gordon,M.P.,Nester,E.W.(1985)Newcloningvehiclesfortransformationofhigherplants.EMBOJ.4:277–284.Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,Lipman,D.J.(1990)Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.215:403-410.Altschul,S.F.,Madden,T.L.,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.,Lipman,D.J.(1997)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.Nucl.AcidsRes.25:3389-3402.Armstrong,C.L.,Green,C.E.,Phillips,R.L.(1991)DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformationresponse.MaizeGenet.Coop.Newslett.65:92-93.Aronson,A.I.,Han,E.-S.,McGaughey,W.,Johnson,D.(1991)ThesolubilityofinclusionproteinsfromBacillusthuringiensisisdependentuponprotoxincompositionandisafactorintoxicitytoinsects.Appl.Environ.Microbiol.57:981-986.Aronson,A.I.,Geng,C.,Wu.L.(1999)AggregationofBacillusthuringiensisCry1Atoxinsuponbindingtotargetinsectlarvalmidgutvesicles.Appl.Environ.Microbiol.65:2503-2507.Arvidson,H.,Dunn,P.E.,Strand,S.,Aronson,A.I.(1989)SpecificityofBacillusthuringiensisforlepidopteranlarvae:factorsinvolvedinvivoandinthestructureofapurifiedtoxin.Molec.Microbiol.3:1533-1543.Ausubeletal.,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork).Bailey,J.M.,Shenov,N.R.,Ronk,M.,andShively,J.E.,(1992)Automatedcarboxy-terminalsequenceanalysisofpeptides.ProteinSci.1:68–80.Beltz,G.A.,Jacobs,K.A.,Eickbush,T.H.,Cherbas,P.T.,Kafatos,F.C.(1983)Isolationofmultigenefamiliesanddeterminationofhomologiesbyfilterhybridizationmethods.InWu,R.,Grossman,L.,Moldave,K.(eds.)MethodsofEnzymology,Vol.100AcademicPress,NewYorkpp.266-285.Bown,D.P.,Wilkinson,H.S.,Jongsma,M.A.,Gatehouse,J.A.(2004)Characterizationofcysteineproteinasesresponsiblefordigestiveproteolysisingutsoflarvalwesterncornrootworm(Diabroticavirgifera)byexpressionintheyeastPichiapastoris.InsectBiochem.Molec.Biol.34,:305-320.Bravo,A.,Gill,S.S.,Soberon,M.(2007)ModeofactionofBacillusthuringiensisCryandCyttoxinsandtheirpotentialforinsectcontrol.Toxicon49:423-435.Caruthers,M.H.,Kierzek,R.,Tang,J.Y.(1987)Synthesisofoligonucleotidesusingthephosphoramiditemethod.BioactiveMolecules(BiophosphatesTheirAnalogues)3:3-21.Christeller,J.T.,Laing,W.A.,Markwick,N.P.,Burgess,E.P.J.(1992)Midgutproteaseactivitiesin12phytophagouslepidopteranlarvae:dietaryandproteaseinhibitorinteractions.InsectBiochem.Molec.Biol.22:735-746.Chu,C.C.,Wand,C.C.,Sun,C.S.,Hsu,C.,Yin,K.C.,Chu,C.Y.,Bi,F.Y.(1975)Establishmentofanefficientmediumforanthercultureofricethroughcomparativeexperimentsonthenitrogensources.ScientiaSinica18:659-668.Crameri,A.,Cwirla,S.,Stemmer,W.P.C.(1996a)Constructionandevolutionofantibody-phagelibrariesbyDNAshuffling.Nat.Med.2:100-103.Crameri,A.,Whitehom,E.A.,Tate,E.,Stemmer,W.P.C.(1996b)ImprovedgreenfluorescentproteinbymolecularevolutionusingDNAshuffling.Nat.Biotech.14:315-319.Crameri,A.,Dawes,G.,Rodriguez,E.,Silver,S.,Stemmer,W.P.C.(1997)MolecularevolutionofanarsenatedetoxificationpathwaybyDNAshuffling.Nat.Biotech.15:436-438.CrickmoreN.,Zeigler,D.R.,FeitelsonJ.,Schnepf,E.,VanRieJ.,LereclusD.,BaumJ.,andDeanD.H.(1998)RevisionoftheNomenclaturefortheBacillusthuringiensisPesticidalCrystalProteinsMicrobiol.Mol.Biol.Reviews62:807-813.deMaagd,R.A.,Kwa,M.S.,vanderKlei,H.,Yamamoto,T.,Schipper,B.,Vlak,J.M.,Stiekema,W.J.,Bosch,D.(1996)DomainIIIsubstitutioninBacillusthuringiensisdelta-endotoxinCryIA(b)resultsinsuperiortoxicityforSpodopteraexiguaandalteredmembraneproteinrecognition.Appl.Environ.Microbiol.62:1537-1543.deMaagd,R.A.,Bravo,A.,Berry,C.,Crickmore,N.,Schnepf,E.(2003)Structure,diversity,andevol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