本申請(qǐng)基于35U.S.C.§119(e)要求于2014年6月6日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第62/008,957號(hào)的權(quán)益，將其通過引用整體并入本文。

背景

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及改善的T細(xì)胞組合物以及用于制備T細(xì)胞的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及導(dǎo)致在體內(nèi)具有改善的存活、擴(kuò)增和持續(xù)的過繼性T細(xì)胞免疫療法的T細(xì)胞制備方法。

相關(guān)技術(shù)的描述

過繼性免疫療法是將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至對(duì)象，用于疾病的治療。過繼性免疫療法尚未發(fā)揮其治療多種疾病的潛能，所述疾病包括癌癥、感染性疾病、自身免疫病、炎癥性疾病和免疫缺陷。然而，大多數(shù)(即使不是全部)過繼性免疫療法策略需要T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增步驟以產(chǎn)生臨床有效的治療劑量的T細(xì)胞。用于產(chǎn)生治療劑量的T細(xì)胞(包括工程化的T細(xì)胞)的當(dāng)前技術(shù)仍然受繁瑣的T細(xì)胞制備方法限制。例如，T細(xì)胞的擴(kuò)增通常需要?jiǎng)趧?dòng)密集且昂貴的克隆和/或多輪活化/擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)治療相關(guān)的T細(xì)胞數(shù)。此外，既有的T細(xì)胞的活化/擴(kuò)增方法通常伴有大量的T細(xì)胞分化，并且通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞具有短期效果，包括短期存活、缺乏持續(xù)性以及缺乏體內(nèi)擴(kuò)增。因此，既有的T細(xì)胞制備方法產(chǎn)生易于耗盡且喪失效應(yīng)免疫細(xì)胞功能的較差的T細(xì)胞產(chǎn)物。

迄今為止，工程化的T細(xì)胞過繼性免疫療法的臨床功效受輸注回患者之后不良的T細(xì)胞擴(kuò)增和持續(xù)的限制。因此，此類療法不適用于廣泛的臨床應(yīng)用。因此，對(duì)于改善T細(xì)胞的制備以及在體內(nèi)存活、擴(kuò)增和持續(xù)的治療性T細(xì)胞組合物，存在持續(xù)、未滿足的需求。

概述

本發(fā)明通常提供包含持續(xù)且強(qiáng)有力的抗腫瘤T細(xì)胞組合物的過繼性T細(xì)胞免疫療法以及制備所述組合物的方法。

本發(fā)明涉及改善的T細(xì)胞組合物以及制備T細(xì)胞的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及導(dǎo)致在體內(nèi)具有改善的存活、擴(kuò)增和持續(xù)的T細(xì)胞制備方法。

在不同的實(shí)施方案中，提供制備T細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)從對(duì)象中分離T細(xì)胞群，例如，腫瘤浸潤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(TIL)；(b)活化所述T細(xì)胞群并刺激所述T細(xì)胞群增殖，其中所述活化和刺激步驟在存在AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下進(jìn)行；(c)將T細(xì)胞培養(yǎng)增殖；其中與在不存在所述PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞的增殖相比，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下進(jìn)行的活化和刺激步驟導(dǎo)致維持T細(xì)胞的增殖。

在不同的實(shí)施方案中，提供制備T細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)活化T細(xì)胞群，并刺激所述T細(xì)胞群增殖，其中所述活化和刺激步驟在存在AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下進(jìn)行；(b)用包含工程化T細(xì)胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞；(c)將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞培養(yǎng)增殖；其中與在不存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖相比，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下進(jìn)行活化和刺激步驟導(dǎo)致維持轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖。

在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的方法包括分離外周血單個(gè)核細(xì)胞作為T細(xì)胞的來源。

在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞的活化包括使所述T細(xì)胞與抗CD3抗體或其CD3結(jié)合片段接觸。

在另外的實(shí)施方案中，T細(xì)胞的刺激包括使所述T細(xì)胞與抗CD28抗體或其CD28結(jié)合片段、B7-1或其CD28結(jié)合片段或者B7-2或其CD28結(jié)合片段接觸。

在一些實(shí)施方案中，在T細(xì)胞增殖之前用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，在T細(xì)胞增殖之后用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。

在具體實(shí)施方案中，載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

在其它實(shí)施方案中，載體是慢病毒載體。

在其它具體實(shí)施方案中，細(xì)胞包含嵌合抗原受體(CAR)。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域與選自以下的抗原結(jié)合：α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CMV、EBV、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、HPV、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2；所述跨膜結(jié)構(gòu)域來源于選自以下的多肽：CD8α；CD4、CD28、CD45、PD-1和CD152；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)。

在另外的實(shí)施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包含與抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段。

在某些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域源自CD8α或CD28。

在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD134和CD137。

在另外的實(shí)施方案中，CAR包含鉸鏈區(qū)多肽。

在具體實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)多肽包含IgG1或CD8α的鉸鏈區(qū)。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含信號(hào)肽。

在一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽包含IgG1重鏈信號(hào)多肽或CD8α信號(hào)多肽。

在一些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑選自：BEZ235、LY294002、GDC-0941、BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、IPI-145、MK-2206、GSK690693、GDC-0068、A-674563、CCT128930、AZD8055、INK128、雷帕霉素、PF-04691502、依維莫司、BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK、AT7867、NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75、ZSTK474和PP-121。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BEZ235、LY294002和GDC-0941的pan-PI3K抑制劑。

在其它具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101和IPI-145的選擇性PI3K抑制劑。

在其它具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是PI3K抑制劑ZSTK474。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自MK-2206、GSK690693和GDC-0068的pan-AKT抑制劑。

在另外的實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選擇性AKT1抑制劑A-674563。

在某些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選擇性AKT2抑制劑CCT128930.

在某些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制DNA-PK激活A(yù)KT。

在其它實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制PDK-1激活A(yù)KT。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制mTORC2激活A(yù)KT。

在另外的實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制HSP激活A(yù)KT。

在其它具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自AZD8055、INK128和雷帕霉素的pan-mTOR抑制劑。

在某些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自PF-04691502和依維莫司的選擇性mTORC1抑制劑。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK和AT7867的s6激酶抑制劑。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75和PP-121的DNA-PK抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，與在不存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞群相比，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞群具有增加數(shù)目的表達(dá)一種或多種標(biāo)志物的T細(xì)胞，所述一種或多種標(biāo)志物選自：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。

在其它實(shí)施方案中，與在不存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞群相比，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞群不表達(dá)CD57或KLRG1或者表達(dá)較少的CD57或KLRG1。

在不同的實(shí)施方案中，提供維持表達(dá)工程化的TCR或CAR的再刺激的T細(xì)胞的增殖并減少其分化的方法，所述方法包括：(a)使包含工程化的TCR或CAR的增殖的T細(xì)胞群全部或部分與抗CD3抗體或其CD3結(jié)合片段和抗CD28抗體或其CD28結(jié)合片段接觸，從而再刺激活化的T細(xì)胞增殖，所述抗CD28抗體或其CD28結(jié)合片段刺激T細(xì)胞表面上的CD28輔助分子；其中與在不存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下刺激或再刺激的T細(xì)胞的增殖相比，所述再刺激的T細(xì)胞具有維持的增殖和減少的分化。

在具體實(shí)施方案中，細(xì)胞包含工程化的TCR。

在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含CAR。

在其它具體實(shí)施方案中，細(xì)胞包含編碼工程化的TCR或CAR的病毒載體。

在另外的實(shí)施方案中，載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

在另外的實(shí)施方案中，載體是慢病毒載體。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域與選自以下的抗原結(jié)合：α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2；所述跨膜結(jié)構(gòu)域來源于選自以下的多肽：CD8α；CD4、CD28、CD45、PD-1和CD152；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)。

在一些實(shí)施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包含與抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段。

在某些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域源自CD8α或CD28。

在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD134和CD137。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含鉸鏈區(qū)多肽。

在其它實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)多肽包含IgG1或CD8α的鉸鏈區(qū)。

在另外的實(shí)施方案中，CAR包含信號(hào)肽。

在其它具體實(shí)施方案中，信號(hào)肽包含IgG1重鏈信號(hào)多肽或CD8α信號(hào)多肽。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑選自：BEZ235、LY294002、GDC-0941、BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、IPI-145、MK-2206、GSK690693、GDC-0068、A-674563、CCT128930、AZD8055、INK128、雷帕霉素、PF-04691502、依維莫司、BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK、AT7867、NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75、ZSTK474和PP-121。

在其它實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BEZ235、LY294002和GDC-0941的pan-PI3K抑制劑。

在其它具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101和IPI-145的選擇性PI3K抑制劑。

在其它具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是PI3K抑制劑ZSTK474。

在某些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自MK-2206、GSK690693和GDC-0068的pan-AKT抑制劑。

在具體實(shí)施方案中，其中PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選擇性AKT1抑制劑A-674563。

在另外的實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選擇性AKT2抑制劑CCT128930.

在一些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制DNA-PK激活A(yù)KT。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制PDK-1激活A(yù)KT。

在某些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制mTORC2激活A(yù)KT。

在具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑抑制HSP激活A(yù)KT。

在其它實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自AZD8055、INK128和雷帕霉素的pan-mTOR抑制劑。

在另外的實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自PF-04691502和依維莫司的選擇性mTORC1抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK和AT7867的s6激酶抑制劑。

在其它具體實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75和PP-121的DNA-PK抑制劑。

在具體實(shí)施方案中，與在不存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞群相比，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下再刺激的活化的T細(xì)胞群具有增加數(shù)目的表達(dá)一種或多種標(biāo)志物的T細(xì)胞，所述一種或多種標(biāo)志物選自：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。

在另外的實(shí)施方案中，與在不存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下活化和刺激的T細(xì)胞群相比，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下再刺激的活化的T細(xì)胞群不表達(dá)CD57或KLRG1或者表達(dá)較少的CD57或KLRG1。

在不同的實(shí)施方案中，提供包含含有工程化的TCR或CAR的載體的T細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下被活化并刺激增殖。

在不同的具體實(shí)施方案中，提供包含含有工程化的TCR或CAR的載體的T細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已在存在PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑的情況下被活化和刺激以進(jìn)行增值，以及已通過使增殖的免疫效應(yīng)細(xì)胞群全部或部分與抗CD3抗體或其CD3結(jié)合片段和抗CD28抗體或其CD28結(jié)合片段接觸而被再刺激，所述抗CD28抗體或其CD28結(jié)合片段刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞表面上的CD28輔助分子。

在某些實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包含T細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞是TIL。

在不同的實(shí)施方案中，提供包含本文所考慮的免疫效應(yīng)細(xì)胞群和生理學(xué)可接受的賦形劑的組合物。

在不同的特定實(shí)施方案中，提供治療有需要的對(duì)象中的癌癥的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用治療有效量的本文所考慮的T細(xì)胞組合物。

在具體實(shí)施方案中，所述癌癥選自：維爾姆斯瘤、尤文肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、皮膚癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、肺癌、膽管癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺髓樣癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥與病毒感染相關(guān)，或者由病毒感染引起，例如，由CMV、HPV或EBV導(dǎo)致的感染。

在另外的實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌，并且胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PSCA或MUC1的表位結(jié)合

在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是膀胱癌，并且胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PSCA或MUC1的表位結(jié)合

在其它實(shí)施方案中，所述癌癥是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，并且胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與EPHA2、EGFRvIII或CSPG4的表位結(jié)合。

在具體實(shí)施方案中，所述癌癥是肺癌，并且胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PSCA或GD2的表位結(jié)合。

在某些實(shí)施方案中，所述癌癥是乳腺癌，并且胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CSPG4或HER2的表位結(jié)合。

在另外的實(shí)施方案中，所述癌癥是黑素瘤，并且胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CSPG4或GD2的表位結(jié)合。

在具體實(shí)施方案中，所述癌癥是B-細(xì)胞惡性腫瘤，并且結(jié)合結(jié)構(gòu)域與BCMA的表位結(jié)合。

在不同的實(shí)施方案中，提供治療有需要的對(duì)象中的血液惡性腫瘤的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用治療有效量的本文所考慮的T細(xì)胞組合物。

在某些實(shí)施方案中，血液惡性腫瘤是選自多發(fā)性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)的B-細(xì)胞惡性腫瘤。

在具體實(shí)施方案中，MM選自：明顯多發(fā)性骨髓瘤、冒煙型多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細(xì)胞瘤以及髓外漿細(xì)胞瘤。

在某些實(shí)施方案中，NHL選自：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性大細(xì)胞淋巴瘤、前體B淋巴母細(xì)胞淋巴瘤以及套細(xì)胞淋巴瘤。

附圖幾個(gè)視圖的簡要描述

圖1顯示了在用AKT抑制劑處理的T細(xì)胞中T細(xì)胞增殖的維持的示例性實(shí)例。用不同濃度的AKT抑制劑MK-22067培養(yǎng)T細(xì)胞，持續(xù)多至七天。最右邊的圖顯示了從六個(gè)正常供體PBMC樣本起始的T細(xì)胞培養(yǎng)物中分裂的T細(xì)胞的百分比。最右邊圖中的各符號(hào)代表用滴定的MK-2206劑量并行制備的獨(dú)特培養(yǎng)物。最左邊的圖顯示了來自這些實(shí)驗(yàn)的示例性實(shí)例。A)在用MK-2206培養(yǎng)三天之后，當(dāng)與未處理的對(duì)照相比時(shí)，T細(xì)胞的增殖僅略微減少。B)在用MK-2206培養(yǎng)7天之后，與未處理的對(duì)照相比，T細(xì)胞的增殖未顯著不同。

圖2顯示了用AKT抑制劑處理的T細(xì)胞的CD62L表達(dá)的示例性實(shí)例。用不同濃度的AKT抑制劑MK-22067培養(yǎng)T細(xì)胞，持續(xù)多至七天。最右邊的圖顯示了從六個(gè)正常供體PBMC樣本起始的T細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)CD62L的T細(xì)胞的百分比。最右邊圖中的各符號(hào)代表用滴定的MK-2206劑量并行制備的獨(dú)特培養(yǎng)物。最左邊的圖顯示了來自這些實(shí)驗(yàn)的示例性實(shí)例。A)在用MK-2206培養(yǎng)三天之后，當(dāng)與未處理的對(duì)照相比時(shí)，MK-2206處理的T細(xì)胞上CD62L的表達(dá)無顯著不同。B)在培養(yǎng)7天之后，與未處理的對(duì)照相比，MK-2206處理的T細(xì)胞顯示顯著較高的CD62L表達(dá)水平。

圖3顯示了在用MK-2206、TCN或ZSTK474培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估的抗BCMA CAR T細(xì)胞上CD62L的表達(dá)。與用單獨(dú)的IL-2或者用TCN處理的CAR T細(xì)胞培養(yǎng)物相比，MK-2206和ZSTK474具有顯著較高的CD62L表達(dá)。

圖4顯示了用IL-2、IL-7和IL-15、MK-2206、ZST747或TCN培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理的小鼠中多發(fā)性骨髓瘤腫瘤的平均腫瘤體積。與用標(biāo)準(zhǔn)的IL-2培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞相比，用IL-7和IL-15、MK-2206或ZST747培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞顯示相似水平的抗腫瘤活性。用TCN培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞未顯示抗腫瘤應(yīng)答。

圖5顯示了在Daudi腫瘤模型中，用IL-2、IL-7/15、MK-2206、TCN或ZSTK474處理的抗BCMA CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性。在用IL-2或IL7/15培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理之后，Daudi腫瘤的進(jìn)展未受影響。用MK-2206或ZST474培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞引起完全的腫瘤消退。

圖6顯示了用IL-2-、MK-2206-或ZSTK474培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理的100mm³RPMI-8226腫瘤已完全消退的動(dòng)物中，ZSTK474-培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞的持續(xù)。隨后，用RPMI-8226在另一側(cè)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行再激發(fā)，持續(xù)13天。用IL-2培養(yǎng)的CAR T細(xì)胞處理的動(dòng)物不能阻止腫瘤長出。用ZSTK474培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理的動(dòng)物均不具有腫瘤移植的任何跡象。

詳細(xì)描述

A.綜述

本發(fā)明通常涉及制備T細(xì)胞組合物的改善的方法。不希望束縛于任何具體理論，與本領(lǐng)域既有的T細(xì)胞組合物相比，本文所考慮的發(fā)明方法將T細(xì)胞的增殖與T細(xì)胞的分化分開以產(chǎn)生具有優(yōu)良特性的T細(xì)胞，例如，在體內(nèi)的存活、擴(kuò)增和持續(xù)增加，以及分化同時(shí)減少。因此，本文所考慮的T細(xì)胞組合物包含具有年輕或初始T細(xì)胞群的特性的強(qiáng)有力的T細(xì)胞，其能夠在很少分化的情況下進(jìn)行多輪擴(kuò)增。而且，擴(kuò)增的細(xì)胞隨后能夠分化并提供免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。

在不同的實(shí)施方案中，提供制備T細(xì)胞的方法，所述方法維持或最低程度地減少T細(xì)胞的增殖，并且在T細(xì)胞擴(kuò)增期間降低、減少或緩和T細(xì)胞分化。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過本文所考慮的方法制備工程化的T細(xì)胞組合物，其還可以增加T細(xì)胞過繼性免疫療法的功效。本文所考慮的制備的T細(xì)胞組合物可用于多種病況的治療或預(yù)防，所述病況包括但不限于癌癥、感染性疾病、自身免疫病、炎癥性疾病以及免疫缺陷。不希望束縛于任何具體理論，本發(fā)明的發(fā)明人意外且出于意料地發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路未被調(diào)控的T細(xì)胞相比，T細(xì)胞中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，導(dǎo)致基本上維持T細(xì)胞的增殖或者無實(shí)質(zhì)性地減少T細(xì)胞的增殖并且在T細(xì)胞擴(kuò)增期間減少T細(xì)胞的分化，所述通路通常與癌細(xì)胞的增殖相關(guān)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，制備工程化的T細(xì)胞的方法包括使T細(xì)胞與抑制所述細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR通路的物質(zhì)接觸?？梢允辜?xì)胞在活化和擴(kuò)增之前、期間和/或之后進(jìn)行接觸。工程化的T細(xì)胞組合物保有充分的T細(xì)胞效力，以使它們可以經(jīng)受多輪擴(kuò)增，而分化無實(shí)質(zhì)的增加。

因此，與既有的過繼性細(xì)胞免疫療法相比，本文所考慮的方法和組合物顯示重大改善。

除非明確指明相反，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)化學(xué)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法，出于示例的目的，下文描述了其中的一些。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分解釋。參見，例如，Sambrook等人，《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版,2001)；Sambrook等人，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989)；Maniatis等人，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1982)；Ausubel等人，《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊專著如Advances in Immunology。

在此，將本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過引用整體并入。

B.定義

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了組合物、方法和材料的優(yōu)選實(shí)施方案。出于本發(fā)明的目的，下文定義了以下術(shù)語。

冠詞“一個(gè)/一種(a)”、“一個(gè)/一種(an)”和“所述(the)”在本文用來指“一個(gè)/一種(one)”或者指“多個(gè)/多種(more than one)”(即，指“至少一個(gè)/一種”)的所述冠詞的語法上對(duì)象。舉例來說，“元素(an element)”意指一種元素或多種元素。

本文使用的術(shù)語“約”或“大約”指針對(duì)參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度變化多達(dá)30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度。在具體實(shí)施方案中，當(dāng)在數(shù)值之前時(shí)，術(shù)語“約”或“大約”表示加或減15％、10％、5％或1％范圍的值。

本文使用的術(shù)語“基本上”指為參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度。在一個(gè)實(shí)施方案中，“基本上相同”指產(chǎn)生與參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度大約相同的效果(例如，生理效應(yīng))的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度。

在整個(gè)說明書中，除非上下文另有要求，單詞“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為暗示包括指定的步驟或元素或者步驟或元素的組，但不排除任何其它步驟或元素或者步驟或元素的組?！坝?..組成”意指包括且限于短語“由...組成”之后的任何內(nèi)容。因此，短語“由...組成”表示列出的元素是必需或強(qiáng)制的，并且不可以存在其它元素?！盎旧嫌?..組成”意指包括在短語之后列出的任何元素，且限于不干擾或者不促進(jìn)本公開詳細(xì)說明的所列元素的活性或作用的其它元素。因此，短語“基本上由...組成”表示所列元素是必需的或強(qiáng)制的，但是其它元素不是任選的，且可以存在或不可以存在，這取決于它們是否影響所列元素的活性或作用。

在整個(gè)說明書中提及的“一個(gè)實(shí)施方案”、“實(shí)施方案”、“具體實(shí)施方案”、“相關(guān)實(shí)施方案”、“某些實(shí)施方案”、“另外的實(shí)施方案”或“其它實(shí)施方案”或者以上的組合意指，與實(shí)施方案相關(guān)的所描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或特性被包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，前述短語在整個(gè)說明書的不同地方的出現(xiàn)不一定全部指相同的實(shí)施方案。而且，可以在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，以任意合適的方式將具體的特征、結(jié)構(gòu)或特性進(jìn)行組合。

本文使用的術(shù)語“T細(xì)胞的制備”或“制備T細(xì)胞的方法’或者相當(dāng)?shù)男g(shù)語指產(chǎn)生T細(xì)胞的治療性組合物的方法，所述制備方法可以包括以下步驟中的一個(gè)或多個(gè)或者全部：收獲、刺激、活化和擴(kuò)增。

術(shù)語“T細(xì)胞”或“T淋巴細(xì)胞”是本領(lǐng)域公知的，并且旨在包括胸腺細(xì)胞、初始T淋巴細(xì)胞、未成熟的T淋巴細(xì)胞、成熟的T淋巴細(xì)胞、靜息T淋巴細(xì)胞或者活化的T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞可以是輔助性T(Th)細(xì)胞，例如輔助性T1(Th1)或輔助性T2(Th2)細(xì)胞。T細(xì)胞可以是輔助性T細(xì)胞(HTL；CD4⁺T細(xì)胞)CD4⁺T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL；CD8⁺T細(xì)胞)、腫瘤浸潤細(xì)胞毒性T細(xì)胞(TIL；CD8⁺T細(xì)胞)、CD4⁺CD8⁺T細(xì)胞、CD4^-CD8^-T細(xì)胞或者T細(xì)胞的任何其它亞群。適合于具體實(shí)施方案中的其它示例性T細(xì)胞群包括初始T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。

在具體實(shí)施方案中，“強(qiáng)有力的T細(xì)胞(potent T cell)”和“年輕的T細(xì)胞(young T cell)”可互換使用，并且指T細(xì)胞的表型，其中T細(xì)胞能夠增殖且同時(shí)分化減少。在具體實(shí)施方案中，年輕的T細(xì)胞具有“初始T細(xì)胞”的表型。在不同的實(shí)施方案中，本文所考慮的制備方法產(chǎn)生年輕的T細(xì)胞；其中在T細(xì)胞刺激、活化和擴(kuò)增期間T細(xì)胞的增殖與T細(xì)胞的分化分開的細(xì)胞。不希望受任何具體理論的束縛，用所考慮的組合物和方法制備的強(qiáng)有力的T細(xì)胞在過繼性轉(zhuǎn)移之后具有較強(qiáng)的抗腫瘤功效。在具體實(shí)施方案中，年輕的T細(xì)胞包含以下生物標(biāo)志物中的一種或多種或者全部：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。在一個(gè)實(shí)施方案中，年輕的T細(xì)胞包含以下生物標(biāo)志物中的一種或多種或者全部：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127，且缺乏CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3的表達(dá)。

本文使用的術(shù)語“增殖”指細(xì)胞分裂(細(xì)胞的對(duì)稱或不對(duì)稱分裂)增加。在具體實(shí)施方案中，“增殖”指T細(xì)胞的對(duì)稱或不對(duì)稱分裂。當(dāng)與未處理的樣本中的細(xì)胞相比，處理的樣本中的細(xì)胞數(shù)存在增加時(shí)，發(fā)生“增殖增加”。

本文使用的術(shù)語“分化”指減少細(xì)胞的效力或增殖或者使細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育更受限的狀態(tài)的方法。在具體實(shí)施方案中，分化的T細(xì)胞獲得免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能。

“免疫效應(yīng)細(xì)胞”是具有一種或多種效應(yīng)功能(例如，細(xì)胞毒性細(xì)胞殺傷活性、細(xì)胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的誘導(dǎo))的免疫系統(tǒng)的任何細(xì)胞。本文所考慮的示例性的免疫效應(yīng)細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞，特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL；CD8⁺T細(xì)胞)、TIL以及輔助性T細(xì)胞(HTL；CD4⁺T細(xì)胞)。

“修飾的T細(xì)胞”指通過引入編碼本文所考慮的工程化的TCR或CAR的多核苷酸而被修飾的T細(xì)胞。修飾的T細(xì)胞既包含遺傳修飾又包含非遺傳修飾(例如，游離的或染色體外的)。

本文使用的術(shù)語“遺傳工程化的”或“遺傳修飾的”指將DNA或RNA形式的額外的遺傳物質(zhì)添加至細(xì)胞的總遺傳物質(zhì)中。

術(shù)語“遺傳修飾的細(xì)胞”、“修飾的細(xì)胞”和“重定向的細(xì)胞”可互換使用。

本文使用的術(shù)語“基因療法”指為恢復(fù)、校正或改變基因的表達(dá)，或者出于表達(dá)治療性多肽例如，TCR或CAR和/或一種或多種細(xì)胞因子的目的，將DNA或RNA形式的額外的遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞的總遺傳物質(zhì)中。在具體實(shí)施方案中，例如，通過將表達(dá)TCR或CAR的附加型載體引入細(xì)胞，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾以表達(dá)工程化的TCR或CAR，而不改變細(xì)胞的基因組。

術(shù)語“離體”通常指在有機(jī)體外發(fā)生的活動(dòng)，如在有機(jī)體外的人工環(huán)境(優(yōu)選對(duì)自然條件進(jìn)行最小改變)中的活組織內(nèi)或活組織上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)或測(cè)量。在具體實(shí)施方案中，“離體”程序涉及取自有機(jī)體且在實(shí)驗(yàn)室裝置中培養(yǎng)或調(diào)整的活細(xì)胞或組織，所述培養(yǎng)或調(diào)整通常在無菌條件下進(jìn)行，并且通常持續(xù)幾小時(shí)或多至約24小時(shí)，但是包括多至48小時(shí)或72小時(shí)，這取決于環(huán)境。在某些實(shí)施方案中，可以將此類組織或細(xì)胞收集并冷凍，以及隨后解凍用于離體處理。利用活細(xì)胞或組織，持續(xù)時(shí)間長于幾天的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或程序通常被認(rèn)為是“在體外”，但是在某些實(shí)施方案中，該術(shù)語與離體可互換使用。

術(shù)語“在體內(nèi)”通常指發(fā)生在有機(jī)體內(nèi)的活動(dòng)，如細(xì)胞的自我更新和細(xì)胞擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“體內(nèi)擴(kuò)增”指細(xì)胞群在體內(nèi)數(shù)目增加的能力。

術(shù)語“刺激”指通過刺激分子(例如，TCR/CD3復(fù)合物)與其同源配體結(jié)合從而介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(包括但不限于經(jīng)TCR/CD3復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))而誘導(dǎo)的初始應(yīng)答。

“刺激分子”指與同源刺激配體特異性結(jié)合的T細(xì)胞上的分子。

本文使用的“刺激配體”意指這樣的配體，當(dāng)其存在于抗原遞呈細(xì)胞(例如，aAPC、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞等)上時(shí)，可以與T細(xì)胞上的同源結(jié)合伴侶(在本文被稱為“刺激分子”)特異性結(jié)合，從而通過T細(xì)胞介導(dǎo)初始應(yīng)答，包括但不限于，活化、起始免疫應(yīng)答、增殖等。刺激配體包括但不限于CD3配體(例如，抗CD3抗體)和CD2配體(例如，抗CD2抗體)以及肽(例如，CMV、HPV、EBV肽)。

術(shù)語“活化”指被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測(cè)的細(xì)胞增殖的T細(xì)胞的狀態(tài)。在具體實(shí)施方案中，活化還可以與誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生和可檢測(cè)的效應(yīng)功能相關(guān)。術(shù)語“活化的T細(xì)胞”指(除了其它方面)正在增殖的T細(xì)胞。通過單獨(dú)的TCR產(chǎn)生的信號(hào)不足以完全活化T細(xì)胞，還需要一種或多種次級(jí)信號(hào)或共刺激信號(hào)。因此，T細(xì)胞的活化包含通過TCR/CD3復(fù)合物的初級(jí)刺激信號(hào)以及一種或多種次級(jí)共刺激信號(hào)。由已接收初級(jí)活化信號(hào)的T細(xì)胞的增殖和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以證實(shí)共刺激，如通過CD3/TCR復(fù)合物或通過CD2的刺激。

“共刺激信號(hào)”指這樣的信號(hào)，其與初級(jí)信號(hào)(如TCR/CD3結(jié)合)的組合導(dǎo)致T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或特定分子(例如，CD28)的上調(diào)或下調(diào)。

“共刺激配體”指與共刺激分子結(jié)合的分子。共刺激配體可以是可溶的或者提供于表面上。“共刺激分子”指與共刺激配體(例如，抗CD28抗體)特異性結(jié)合的T細(xì)胞上的同源結(jié)合伴侶。

本文使用的“自體同源(autologous)”指來自同一對(duì)象的細(xì)胞。

本文使用的“同種異體(allogeneic)”指與相比較的細(xì)胞在遺傳學(xué)上不同的相同物種的細(xì)胞。

本文使用的“同基因(syngeneic)”指與相比較的細(xì)胞在遺傳學(xué)上相同的不同對(duì)象的細(xì)胞。

本文使用的“異基因(xenogeneic)”指與相比較的細(xì)胞不同物種的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞是同種異體的。

本文使用的術(shù)語“個(gè)體”和“對(duì)象”通常可互換使用，并且指顯現(xiàn)出可用基因療法載體、基于細(xì)胞的治療劑以及本文別處所公開的方法進(jìn)行治療的癌癥的癥狀的任何動(dòng)物。合適的對(duì)象(例如，患者)包括實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物或?qū)櫸?如貓或狗)。包括非人靈長類以及優(yōu)選人患者。典型的對(duì)象包括患有癌癥、已確診患有癌癥或者處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的人患者。

本文使用的術(shù)語“患者”指已被診斷具有特定跡象的對(duì)象，所述特定跡象可以用基因療法載體、基于細(xì)胞的治療劑以及本文別處所公開的方法進(jìn)行治療。

本文使用的“治療(treatment)”或“治療(treating)”包括對(duì)疾病或病理狀態(tài)的癥狀或病狀的任何有益或期望的效果，并且甚至可以包括被治療的疾病或病況(例如，癌癥)的一種或多種可測(cè)量標(biāo)志物的最小減少。治療可以任選地包括疾病或病況的癥狀的減輕或緩解，或者疾病或病況的進(jìn)程的延遲?！爸委煛辈灰欢ㄖ甘炯膊』虿r或者其相關(guān)癥狀的完全根除或治愈。

本文使用的“預(yù)防(prevent)”和類似的單詞如“預(yù)防(prevented)”、“預(yù)防(preventing)”等指用于預(yù)防、抑制或降低疾病或病況(例如，癌癥)發(fā)生或復(fù)發(fā)的可能性的方法。其還指延遲疾病或病況的發(fā)作或復(fù)發(fā)，或者延遲疾病或病況的癥狀的發(fā)生或復(fù)發(fā)。本文使用的“預(yù)防(prevention)”和類似的單詞還包括在疾病或病況發(fā)作或復(fù)發(fā)之前降低疾病或病況的強(qiáng)度、影響、癥狀和/或負(fù)擔(dān)。

本文使用的術(shù)語“數(shù)量”指遺傳修飾的治療性細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)實(shí)現(xiàn)有益或期望的預(yù)防或治療結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的“有效量(an amount effective)”或“有效量(an effective amount)”。

“預(yù)防有效量”指遺傳修飾的治療細(xì)胞有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果的量。通常但不必須，由于預(yù)防劑量是在疾病之前或在疾病的早期階段用于對(duì)象，所以預(yù)防有效量小于治療有效量。

遺傳修飾的治療細(xì)胞的“治療有效量”可以根據(jù)諸如以下的因素而改變：個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及T細(xì)胞在個(gè)體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力。治療有效量也是這樣的量：其中病毒或者所轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療細(xì)胞的任何毒性或有害影響被治療有益效果超過。術(shù)語“治療有效量”包括有效“治療”對(duì)象(例如，患者)的量。當(dāng)指示治療量時(shí)，待施用的本發(fā)明的組合物的精確量可以由醫(yī)師考慮患者(對(duì)象)的年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移的程度以及病況方面的個(gè)體差異來確定。

本文使用的術(shù)語“癌癥”通常涉及異常細(xì)胞不受控制地分裂并且可侵入鄰近的組織的一類疾病或病況。

本文使用的術(shù)語“惡性的”指這樣的癌癥，其中腫瘤細(xì)胞組呈現(xiàn)不受控制的生長(即，分裂超出正常限制)、侵襲(即，侵入并破壞相鄰的組織)和轉(zhuǎn)移(即，經(jīng)淋巴或血液擴(kuò)散至身體的其它位置)中一種或多種。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指癌癥從身體的一部分?jǐn)U散至另外的部分。由擴(kuò)散的細(xì)胞形成的腫瘤叫做“轉(zhuǎn)移性腫瘤”或“轉(zhuǎn)移”。轉(zhuǎn)移性腫瘤含有與原始(原發(fā))腫瘤中的那些細(xì)胞相同的細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“良性”或“非惡性的”指可以長大但不擴(kuò)散至身體的其它部分的腫瘤。良性腫瘤自我限制并且通常不會(huì)侵襲或轉(zhuǎn)移。

“癌細(xì)胞”或“腫瘤細(xì)胞”指癌性生長物或組織的個(gè)體細(xì)胞。腫瘤通常指由細(xì)胞的異常生長形成的腫脹或損傷，其可以是良性的、惡變前的或惡性的。大多數(shù)癌癥形成腫瘤，但是一些癌癥(例如，白血病)不一定形成腫瘤。對(duì)于形成腫瘤的那些癌癥，術(shù)語癌癥(癌細(xì)胞)和腫瘤(腫瘤細(xì)胞)可互換使用。個(gè)體的腫瘤的量是“腫瘤負(fù)擔(dān)”，其可以測(cè)量為腫瘤數(shù)、腫瘤體積或腫瘤重量。

“感染性疾病”指可以在人之間或在有機(jī)體之間傳播，且由微生物物質(zhì)(microbial agent)引起的疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如肝炎、性傳播疾病(例如，衣原體、淋病)、肺結(jié)核、HIV/AIDS、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍亂和流行性感冒。

“自身免疫病”指身體對(duì)其自身組織的某些組分產(chǎn)生免疫原性(即，免疫系統(tǒng))應(yīng)答的疾病。換句話說，免疫系統(tǒng)喪失了其將身體內(nèi)的某些組織或系統(tǒng)識(shí)別為“自身”的能力，并且靶向和攻擊所述組織或系統(tǒng)，仿佛它們是外來的。自身免疫病可被分類為其中主要是一種器官受影響的自身免疫病(例如，溶血性貧血和自身免疫性甲狀腺炎(anti-immune thyroiditis))，以及其中自身免疫病的過程通過許多組織擴(kuò)散的自身免疫病(例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡)。例如，多發(fā)性硬化癥被認(rèn)為是由T細(xì)胞攻擊圍繞腦和脊髓神經(jīng)纖維的鞘所引起的。這導(dǎo)致協(xié)調(diào)性喪失、虛弱以及視力模糊。自身免疫病在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、狼瘡、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、溶血性貧血、自身免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乳糜瀉、克羅恩氏病(Crohn's disease)、結(jié)腸炎、糖尿病、硬皮病、銀屑病等。

“免疫缺陷”意指免疫系統(tǒng)被疾病或化學(xué)物質(zhì)的施用損傷的患者的狀態(tài)。該病況使系統(tǒng)缺乏防御抵抗外來物質(zhì)所需的血細(xì)胞的數(shù)目和類型。免疫缺陷病況或疾病在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)、SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷病)、選擇性IgA缺乏癥、常見變異型免疫缺陷病、X連鎖無丙種球蛋白血癥、慢性肉芽腫病、高IgM綜合征以及糖尿病。

“增強(qiáng)”或“促進(jìn)”或者“增加”或“擴(kuò)大”通常指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物產(chǎn)生、引發(fā)或引起較強(qiáng)的生理學(xué)應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力。除了從本領(lǐng)域的理解和本文的描述顯而易見的之外，可測(cè)量的生理學(xué)應(yīng)答可以包括T細(xì)胞的擴(kuò)增、活化、持續(xù)的增加，和/或癌細(xì)胞死亡殺傷能力的增加?！霸黾拥摹绷炕颉霸鰪?qiáng)的”量通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”量，并且可以包括由媒介物或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的應(yīng)答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括在其間且在1以上的所有整數(shù)和小數(shù)，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

“下降(decrease)”或“降低(lower)”或者“變少(lessen)”或者“減少(reduce)”或者“減輕(abate)”通常指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物產(chǎn)生、引發(fā)或引起較小生理學(xué)應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力?！跋陆怠被颉皽p少的”量通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”量，并且可以包括由媒介物、對(duì)照組合物產(chǎn)生的應(yīng)答(參照應(yīng)答)，或者特定細(xì)胞譜系中的應(yīng)答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如500倍，1000倍)(包括在其間且在1以上的所有整數(shù)和小數(shù)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的減少。

“維持(maintain)”或“保持(preserve)”或“維持(maintenance)”或“無變化(no change)”或“無明顯變化(no substantial change)”或“無明顯減少(no substantial decrease)”通常指與由媒介物、對(duì)照分子/組合物引起的應(yīng)答，或者特定細(xì)胞譜系中的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物在細(xì)胞中產(chǎn)生、引發(fā)或引起較小生理學(xué)應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力?？杀容^的應(yīng)答是與參照應(yīng)答沒有顯著不同或者可測(cè)量的不同的應(yīng)答。

本文使用的術(shù)語“特異性結(jié)合親和力(specific binding affinity)”或“特異性結(jié)合(specifically binds)”或“特異性結(jié)合(specifically bound)”或“特異性結(jié)合(specific binding)”或“特異性靶向(specifically target)”描述了一種分子以高于背景結(jié)合的結(jié)合親和力與另一種分子結(jié)合。如果結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或者包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR或含有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)與靶分子的結(jié)合或聯(lián)合具有例如大于或等于約10⁵M^-1的親和力或K_a(即，具體的結(jié)合相互作用的平衡締合常數(shù)，單位為1/M)，則所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶分子“特異性結(jié)合”。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)與靶標(biāo)的結(jié)合具有大于或等于約10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或10¹³M^-1的K_a。“高親和力”結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其單鏈融合蛋白)指K_a為至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少10¹³M^-1或更高的那些結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

可選地，親和力可以被定義為具體結(jié)合相互作用的平衡解離常數(shù)(K_d)，單位為M(例如，10^-5M至10^-13M或更低)。使用常規(guī)的技術(shù)，可以容易地測(cè)定本公開所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽和CAR蛋白的親和力，例如，通過競(jìng)爭(zhēng)性ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)，或通過結(jié)合締合，或利用標(biāo)記的配體的位移分析(displacement assay)，或者使用表面等離子共振裝置(如Biacore T100，其可獲自Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)或光學(xué)生物傳感器技術(shù)(如可分別獲自Corning和Perkin Elmer的EPIC系統(tǒng)或EnSpire)(還參見，例如，Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美國專利第5,283,173號(hào)、第5,468,614號(hào)或同等物)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合的親和力高于背景結(jié)合約2倍、高于背景結(jié)合約5倍、高于背景結(jié)合約10倍、高于背景結(jié)合約20倍、高于背景結(jié)合約50倍、高于背景結(jié)合約100倍或者高于背景結(jié)合約1000倍或者更多倍。

“抗原(Ag)”指可以刺激動(dòng)物中抗體或T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射進(jìn)或吸收進(jìn)動(dòng)物中的組合物(如包含腫瘤特異性蛋白的組合物)?？乖c特異性體液免疫或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)，所述產(chǎn)物包括由異源抗原(如本公開的抗原)所誘導(dǎo)的產(chǎn)物?！鞍锌乖被蛘摺鞍锌乖蚰繕?biāo)物”是被設(shè)計(jì)以結(jié)合本文所考慮的CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原。

“表位”或“抗原決定簇”指結(jié)合劑結(jié)合的抗原區(qū)域。

本文使用的“分離的肽”或“分離的多肽”等指從細(xì)胞環(huán)境以及從與細(xì)胞其它組分的結(jié)合體外分離和/或純化的肽或多肽分子，即，其不與體內(nèi)的物質(zhì)明顯結(jié)合。類似地，“分離的細(xì)胞”指從體內(nèi)的組織或器官獲得的且基本不含細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞。

本文使用的“分離的多核苷酸”指已從天然狀態(tài)下位于其側(cè)翼的序列純化出的多核苷酸，例如，已從通常與其相鄰的序列移出的DNA片段?！胺蛛x的多核苷酸”也指互補(bǔ)DNA(cDNA)、重組DNA或者自然中不存在且通過人為處理制備的其它多核苷酸。

C.T細(xì)胞制備方法

通過本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞提供改善的過繼性免疫療法組合物。不希望束縛于任何具體理論，據(jù)信，通過本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞組合物具有優(yōu)良的特性，其包括在體內(nèi)增加的存活、相對(duì)缺乏分化的擴(kuò)增以及持續(xù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備T細(xì)胞的方法包括使細(xì)胞與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種或多種物質(zhì)接觸。在不同的實(shí)施方案中，T細(xì)胞可以獲自任何來源，并且在制備方法的活化和/或擴(kuò)增期使其與所述物質(zhì)接觸。得到的T細(xì)胞組合物富含發(fā)育上強(qiáng)有力的T細(xì)胞，所述發(fā)育上強(qiáng)有力的T細(xì)胞具有增殖且表達(dá)以下生物標(biāo)志物中的一種或多種的能力：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。

在一個(gè)實(shí)施方案中，制備具有維持的增殖水平且分化減少的修飾的T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，在存在一種或多種刺激信號(hào)和為PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑的物質(zhì)的情況下，通過刺激T細(xì)胞使其活化和增殖來制備T細(xì)胞。

然后可以對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾以表達(dá)一種或多種工程化的TCR或CAR。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用包含工程化的TCR或CAR的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞來修飾T細(xì)胞。在某一實(shí)施方案中，在存在PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑的情況下進(jìn)行刺激和活化之前，修飾T細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，在存在PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑的情況下進(jìn)行刺激和活化之后，修飾T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，在存在PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑的情況下進(jìn)行刺激和活化12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)或48小時(shí)內(nèi)，修飾T細(xì)胞。

在活化T細(xì)胞之后，培養(yǎng)細(xì)胞以增殖?？梢詫細(xì)胞培養(yǎng)至少1、2、3、4、5、6或7天，至少2周，至少1、2、3、4、5或6個(gè)月或更久，伴隨著1、2、3、4、5、6、7、8、9或10輪或更多輪的擴(kuò)增。

在不同的實(shí)施方案中，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的一種或多種抑制劑的情況下制備T細(xì)胞組合物。抑制劑可以靶向所述通路中的一種或多種活性或者單一活性。不希望束縛于任何具體理論，考慮在制備方法的刺激期、活化期和/或擴(kuò)增期用PI3K/AKT/mTOR通路的一種或多種抑制劑處理或接觸T細(xì)胞，優(yōu)先增加年輕的T細(xì)胞，從而產(chǎn)生優(yōu)良的治療性T細(xì)胞組合物。

在具體實(shí)施方案中，提供增加表達(dá)工程化的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的增殖的方法。此類方法可以包括，例如，從對(duì)象獲得T細(xì)胞來源，在存在PI3K/AKT/mTOR通路的一種或多種抑制劑的情況下刺激并活化T細(xì)胞，對(duì)所述T細(xì)胞進(jìn)行修飾以表達(dá)工程化的TCR或CAR，以及擴(kuò)增培養(yǎng)中的所述T細(xì)胞。

在某一實(shí)施方案中，提供用于產(chǎn)生以下生物標(biāo)志物中的一種或多種豐富表達(dá)的T細(xì)胞群的方法：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。在相關(guān)實(shí)施方案中，提供用于增加表達(dá)CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127且不表達(dá)或表達(dá)低水平的CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3的T細(xì)胞的方法。如本文別處所討論的，年輕T細(xì)胞生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與更加分化的T細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞群中此類標(biāo)志物的表達(dá)水平是相對(duì)的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)用作本文所考慮的T細(xì)胞制備方法中的T細(xì)胞的來源。PBMC形成異種T淋巴細(xì)胞群，其可以是CD4⁺、CD8⁺或者CD4⁺和CD8⁺，并且可以包括其它單個(gè)核細(xì)胞，如單核細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞?？梢詫幋a本文所考慮的工程化的TCR或CAR的多核苷酸的表達(dá)載體引入人供體的T細(xì)胞、NK細(xì)胞或NKT細(xì)胞群中。攜帶表達(dá)載體的成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可以利用流式細(xì)胞術(shù)分選，以分離CD3陽性T細(xì)胞，然后除了利用抗CD3抗體和或抗CD28抗體以及IL-2、IL-7和/或IL-15或者本文別處所描述的本領(lǐng)域已知的任何其它方法進(jìn)行細(xì)胞活化之外還被增殖以增加修飾的T細(xì)胞的數(shù)目。

本文所考慮的制備方法還可以包括低溫保藏修飾的T細(xì)胞以用于儲(chǔ)存和/或制備以在人對(duì)象中使用。對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行低溫保藏，以使細(xì)胞在解凍時(shí)仍然有活力。當(dāng)需要時(shí)，可以將低溫保藏的轉(zhuǎn)化的免疫效應(yīng)細(xì)胞解凍，使其生長并擴(kuò)增出更多的此類細(xì)胞。本文使用的“低溫保藏”指通過使細(xì)胞冷卻至零下溫度(如(通常)77K或-196℃(液氮的沸點(diǎn)))來保存細(xì)胞。在零下溫度通常使用低溫保護(hù)劑，以防止被保藏的細(xì)胞受到由于在低溫下冷凍或者升溫至室溫而導(dǎo)致的損害。低溫保護(hù)劑和優(yōu)化的冷卻速率可以保護(hù)細(xì)胞免受損傷。可以使用的低溫保護(hù)劑包括但不限于二甲基亞砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,Nature,1959；183:1394-1395；Ashwood-Smith,Nature,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(Rinfret,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1960；85:576)以及聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,Nature,1962；196:48)。優(yōu)選的冷卻速率為1℃至3℃/分鐘。在至少兩小時(shí)之后，T細(xì)胞達(dá)到-80℃的溫度，以及可以將其直接放入液氮(-196℃)中以例如在長期低溫保藏容器中永久保藏。

1.T細(xì)胞

本發(fā)明考慮改善的T細(xì)胞組合物的制備。T細(xì)胞可以是自體同源的/自體的(“自己的”)或者非自體同源的(“非自己的”，例如同種異體的、同基因的或異基因的)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，T細(xì)胞獲自哺乳動(dòng)物對(duì)象。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞獲自靈長類對(duì)象。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞獲自人類對(duì)象。

可以從許多來源獲得T細(xì)胞，其包括但不限于：外周血單個(gè)核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在某些實(shí)施方案中，可以利用技術(shù)人員已知的任何數(shù)目的技術(shù)，如沉降(例如，F(xiàn)ICOLL^TM分離)，從收集自對(duì)象的單位血液獲得T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過血漿分離置換法獲得來自個(gè)體的循環(huán)血液的細(xì)胞。血漿分離置換法的產(chǎn)物通常包含淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、其它有核的白細(xì)胞、紅細(xì)胞以及血小板。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以洗滌通過血漿分離置換法收集的細(xì)胞以移除血漿部分并且將細(xì)胞置于合適的緩沖液或介質(zhì)中，用于后續(xù)處理?？梢杂肞BS或者不含鈣、鎂以及大多數(shù)(即使不是全部)其它二價(jià)陽離子的其它合適的溶液洗滌細(xì)胞。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法完成洗滌步驟，如通過使用半自動(dòng)直流離心機(jī)，例如，Cobe 2991細(xì)胞處理器、Baxter CytoMate等。在洗滌之后，可以將細(xì)胞重懸于多種生物相容性緩沖液或者含有或不含緩沖劑的其它鹽水溶液中。在某些實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞直接重懸的培養(yǎng)基中移除血漿分離置換法樣本中的非期望組分。

在具體實(shí)施方案中，在本文所考慮的制備方法中使用包含T細(xì)胞的細(xì)胞群，例如PBMC。在其它實(shí)施方案中，在本文所考慮的制備方法中使用分離的或純化的T細(xì)胞群?？梢酝ㄟ^裂解紅細(xì)胞并耗盡單核細(xì)胞，例如，通過經(jīng)PERCOLL^TM梯度的離心，從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在分離PBMC之后，在活化、擴(kuò)增和/或遺傳修飾之前或之后，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞均可被分選為初始T細(xì)胞亞群、記憶T細(xì)胞亞群和效應(yīng)T細(xì)胞亞群。

可以通過陽性或陰性選擇技術(shù)進(jìn)一步分離表達(dá)以下標(biāo)志物中的一種或多種的特定T細(xì)胞亞群：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127和HLA-DR。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過陽性或陰性選擇技術(shù)進(jìn)一步分離表達(dá)選自以下標(biāo)志物中的一種或多種的特定T細(xì)胞亞群：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。在不同的實(shí)施方案中，制備的T細(xì)胞組合物不表達(dá)或不明顯表達(dá)以下標(biāo)志物中的一種或多種：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與在無PI3K/AKT/mTOR抑制劑的情況下活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞群相比，選自CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127的標(biāo)志物中的一種或多種的表達(dá)增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或者更多倍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與在存在PI3K/AKT/mTOR抑制劑的情況下活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞群相比，選自CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3的標(biāo)志物中的一種或多種的表達(dá)降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍或者更多倍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所考慮的制備方法增加了包含初始T細(xì)胞或發(fā)育上強(qiáng)有力的T細(xì)胞的一種或多種標(biāo)志物的T細(xì)胞的數(shù)目。不希望束縛于任何具體理論，本發(fā)明的發(fā)明人相信，用一種或多種PI3K/AKT/mTOR抑制劑處理包含T細(xì)胞的細(xì)胞群將T細(xì)胞的增殖信號(hào)和分化信號(hào)分開，從而導(dǎo)致發(fā)育上強(qiáng)有力的T細(xì)胞的擴(kuò)增增加，并提供比既有的T細(xì)胞療法更穩(wěn)健且更有效的過繼性免疫療法。

在利用本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞中增加的初始T細(xì)胞或發(fā)育上強(qiáng)有力的T細(xì)胞的標(biāo)志物的示例性實(shí)例包括但不限于CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD95、CD122和CD127。在具體實(shí)施方案中，初始T細(xì)胞不表達(dá)或不明顯表達(dá)以下標(biāo)志物中的一種或多種：CD57、CD244、CD160、PD-1、BTLA、CD45RA、CTLA4、TIM3和LAG3。

關(guān)于T細(xì)胞，由本文所考慮的多種擴(kuò)增方法產(chǎn)生的T細(xì)胞群可以具有多種特定的表型特征，這取決于所采用的條件。在不同的實(shí)施方案中，擴(kuò)增的T細(xì)胞群包含以下表型標(biāo)志物中的一種或多種：CCR7、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD62L、CD95、CD122、CD127和HLA-DR。

在一個(gè)實(shí)施方案中，此類表型標(biāo)志物包括表達(dá)增加的CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127中的一種或多種或者全部。在具體實(shí)施方案中，擴(kuò)增特征為表達(dá)初始T細(xì)胞的表型標(biāo)志物的CD8⁺T淋巴細(xì)胞，所述表型標(biāo)志物包括CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。

在具體實(shí)施方案中，擴(kuò)增特征為表達(dá)中央記憶型T細(xì)胞的表型標(biāo)志物且顆粒酶B陰性的T細(xì)胞，所述表型標(biāo)志物包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。在一些實(shí)施方案中，中央記憶型T細(xì)胞是CD45RO⁺、CD62L⁺、CD8⁺T細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增特征為表達(dá)初始CD4⁺細(xì)胞的表型標(biāo)志物(包括CD62L)且CD45RA和/或CD45RO表達(dá)陰性的CD4⁺T淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增特征為表達(dá)中央記憶型CD4⁺細(xì)胞的表型標(biāo)志物(包括CD62L)且CD45RO陽性的CD4⁺細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)CD4⁺細(xì)胞是CD62L陽性且CD45RO陰性的。

在某些實(shí)施方案中，從個(gè)體分離T細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行修飾，而無需進(jìn)一步離體或體外操作。然后可以將此類細(xì)胞直接重新施用回所述個(gè)體。在其它實(shí)施方案中，在進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)工程化的TCR或CAR之前，首先對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行活化和刺激以在體外增殖。就這點(diǎn)而言，可以在進(jìn)行遺傳修飾(即，轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染以表達(dá)本文所考慮的工程化的TCR或CAR)之前和/或之后，培養(yǎng)T細(xì)胞。

2.活化和擴(kuò)增

為了得到足夠的治療劑量的T細(xì)胞組合物，通常使T細(xì)胞經(jīng)歷一輪或多輪刺激、活化和/或擴(kuò)增。通常可以使用如例如在以下中所描述的方法活化和擴(kuò)增T細(xì)胞：美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041，將其各自通過引用整體并入本文?？梢栽谛揎桾細(xì)胞之前和/或之后，活化和擴(kuò)增被修飾以表達(dá)工程化的TCR或CAR的T細(xì)胞。此外，可以在活化和/或擴(kuò)增之前、期間和/或之后，使T細(xì)胞與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種或多種物質(zhì)接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，使通過本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞經(jīng)歷一輪、兩輪、三輪、四輪或五輪或者更多輪的活化和擴(kuò)增，各輪活化和擴(kuò)增可以包括調(diào)控PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種或多種物質(zhì)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，共刺激配體存在于抗原遞呈細(xì)胞(例如aAPC、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞等)上，其與T細(xì)胞上的同源共刺激分子特異性結(jié)合，從而提供除由例如TCR/CD3復(fù)合物的結(jié)合所提供的初級(jí)信號(hào)之外介導(dǎo)期望的T細(xì)胞應(yīng)答的信號(hào)。合適的共刺激配體包括但不限于，CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導(dǎo)的共刺激配體(ICOS-L)、細(xì)胞間粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、ILT3、ILT4、與Toll配體受體結(jié)合的激動(dòng)劑或抗體以及與B7-H3特異性結(jié)合的配體。

在具體實(shí)施方案中，共刺激配體包括與T細(xì)胞上存在的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括但不限于CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、1COS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83特異性結(jié)合的配體。

合適的共刺激配體還包括靶抗原，所述靶抗原可以以可溶的形式提供或者在APC或aAPC上表達(dá)，其與在修飾的T細(xì)胞上表達(dá)的工程化的TCR或CAR結(jié)合。

在不同的實(shí)施方案中，本文所考慮的制備T細(xì)胞的方法包括活化包含T細(xì)胞的細(xì)胞群并擴(kuò)增所述T細(xì)胞群。可以通過經(jīng)T細(xì)胞TCR/CD3復(fù)合物或者經(jīng)CD2表面蛋白的刺激提供初級(jí)刺激信號(hào)以及通過經(jīng)輔助分子(例如，CD28)提供次級(jí)共刺激信號(hào)來實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的活化。

可以通過使T細(xì)胞與合適的CD3結(jié)合劑(例如，CD3配體或抗CD3單克隆抗體)接觸來刺激TCR/CD3復(fù)合物。CD3抗體的示例性實(shí)例包括但不限于，OKT3、G19-4、BC3和64.1。

在另一實(shí)施方案中，可將CD2結(jié)合劑用于向T細(xì)胞提供初級(jí)刺激信號(hào)。CD2結(jié)合劑的示例性實(shí)例包括但不限于，CD2配體和抗CD2抗體，例如，與T11.1或T11.2抗體組合的T11.3抗體(Meuer,S.C.等人(1984)Cell 36:897-906)以及與9-1抗體組合的9.6抗體(其與T11.1識(shí)別相同的表位)(Yang,S.Y.等人(1986)J.Immunol.137:1097-1100)。也可以使用與以上所述的抗體中的任一種結(jié)合相同表位的其它抗體?？梢酝ㄟ^如本文別處所公開的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備和鑒定另外的抗體或抗體的組合。

除通過TCR/CD3復(fù)合物或者經(jīng)CD2提供的初級(jí)刺激信號(hào)之外，T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)需要次級(jí)共刺激信號(hào)。在具體實(shí)施方案中，CD28結(jié)合劑可以用來提供共刺激信號(hào)。CD28結(jié)合劑的示例性實(shí)例包括但不限于：天然的CD28配體，例如，CD28的天然配體(例如，B7蛋白家族的成員，如B7-1(CD80)和B7-2(CD86))；以及能夠交聯(lián)CD28分子的抗CD28單克隆抗體或其片段，例如，單克隆抗體9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10.

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供初級(jí)刺激信號(hào)的分子(例如通過TCR/CD3復(fù)合物或CD2提供刺激的分子)與共刺激分子連接至同一表面。

在某些實(shí)施方案中，提供刺激和共刺激信號(hào)的結(jié)合劑位于細(xì)胞表面。這可以通過用編碼結(jié)合劑的核酸以適于其在細(xì)胞表面表達(dá)的形式轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或者可選地通過將結(jié)合劑與細(xì)胞表面偶聯(lián)來實(shí)現(xiàn)。

在另一實(shí)施方案中，提供初級(jí)刺激信號(hào)的分子(例如通過TCR/CD3復(fù)合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子展示于抗原遞呈細(xì)胞上。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供初級(jí)刺激信號(hào)的分子(例如通過TCR/CD3復(fù)合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子存在于不同的表面上。

在某一實(shí)施方案中，提供刺激和共刺激信號(hào)的結(jié)合劑之一是可溶的(以溶液的形式提供)，以及其它試劑存在于一個(gè)或多個(gè)表面上。

在具體實(shí)施方案中，提供刺激和共刺激信號(hào)的結(jié)合劑均以可溶的形式提供(以溶液的形式提供)。

在不同的實(shí)施方案中，本文所考慮的制備T細(xì)胞的方法包括用抗CD3和抗CD28抗體活化T細(xì)胞。

通過本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞組合物包含在存在抑制PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種或多種物質(zhì)的情況下活化和/或擴(kuò)增的T細(xì)胞?？梢栽谛揎桾細(xì)胞之前和/或之后，活化和擴(kuò)增被修飾以表達(dá)工程化的TCR或CAR的T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，對(duì)T細(xì)胞群進(jìn)行活化、修飾，以表達(dá)工程化的TCR或CAR，以及然后進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞包含增加數(shù)目的表達(dá)指示高增殖潛能和自我更新能力的標(biāo)志物但不表達(dá)或表達(dá)基本上檢測(cè)不到的T細(xì)胞分化的標(biāo)志物的T細(xì)胞?？梢砸苑€(wěn)健的形式重復(fù)活化和擴(kuò)增這些T細(xì)胞，從而提供改善的治療性T細(xì)胞組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與在無PI3K/AKT/mTOR抑制劑的情況下活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞群相比，在存在抑制PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種或多種物質(zhì)的情況下活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞群擴(kuò)增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或者更多倍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，與在無PI3K/AKT/mTOR抑制劑的情況下活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞群相比，在存在抑制PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一種或多種物質(zhì)的情況下活化和擴(kuò)增的以表達(dá)年輕T細(xì)胞的標(biāo)志物為特點(diǎn)的T細(xì)胞群擴(kuò)增至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍或者更多倍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增通過本文所考慮的方法活化的T細(xì)胞還包括將包含T細(xì)胞的細(xì)胞群培養(yǎng)數(shù)小時(shí)(約3小時(shí))至約7天至約28天或者之間任意小時(shí)的整數(shù)值。在另一實(shí)施方案中，可以將T細(xì)胞組合物培養(yǎng)14天。在具體實(shí)施方案中，將T細(xì)胞培養(yǎng)約21天。在另一實(shí)施方案中，將T細(xì)胞組合物培養(yǎng)約2-3天。也可以期望數(shù)個(gè)刺激/活化/擴(kuò)增循環(huán)，以使T細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間可以為60天或更多天。

在具體實(shí)施方案中，適合于T細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括合適的培養(yǎng)基(例如，最低必需培養(yǎng)基或RPMI培養(yǎng)基1640或者X-vivo 15(Lonza))以及增殖和生存所必需的一種或多種因子，所述因子包括但不限于血清(例如，胎牛血清或人血清)，白介素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或者技術(shù)人員已知的適于細(xì)胞生長的任何其它添加劑。

細(xì)胞培養(yǎng)基的其它示例性實(shí)例包括但不限于RPMI 1640，Clicks，AIM-V，DMEM，MEM，a-MEM，F(xiàn)-12，X-Vivo 15以及X-Vivo 20、Optimizer，所述培養(yǎng)基含有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素，不含血清或者補(bǔ)充有適量的血清(或血漿)或者一組確定的激素和/或足夠用于T細(xì)胞的生長和擴(kuò)增的量的細(xì)胞因子。

用于T細(xì)胞擴(kuò)增的其它添加劑的示例性實(shí)例包括但不限于，表面活性劑、piasmanate、pH緩沖液(如HEPES)和還原劑(如N-乙酰-半胱氨酸和2-巰基乙醇)。

諸如青霉素和鏈霉素的抗生素僅包含在試驗(yàn)性培養(yǎng)物中，而不包含在待輸注進(jìn)對(duì)象的細(xì)胞培養(yǎng)物中。在支持生長所需的條件下維持靶細(xì)胞，例如，合適的溫度(例如，37℃)和環(huán)境(例如，空氣加5％CO₂)。

在具體實(shí)施方案中，在含有合適的細(xì)胞因子(如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培養(yǎng)基中，使PBMC或分離的T細(xì)胞與通常與珠或其它表面連接的刺激劑和共刺激劑(如抗CD3抗體和抗CD28抗體)接觸。

在其它實(shí)施方案中，通過工程化K562、U937、721.221、T2和C1R細(xì)胞制備人工APC(aAPC)以引導(dǎo)多種共刺激分子和細(xì)胞因子的穩(wěn)定表達(dá)和分泌。在具體實(shí)施方案中，將K32或U32aAPC用于引導(dǎo)一種或多種基于抗體的刺激分子在AAPC細(xì)胞表面上的展示?？梢酝ㄟ^表達(dá)多種共刺激分子的aAPC擴(kuò)增T細(xì)胞群，所述共刺激分子包括但不限于，CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC提供了擴(kuò)增遺傳修飾的T細(xì)胞并且維持CD8T細(xì)胞上的CD28表達(dá)的有效平臺(tái)。將WO 03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC在此通過引用整體并入。

3.物質(zhì)

在不同的實(shí)施方案中，提供制備T細(xì)胞的方法，所述方法對(duì)未分化的或發(fā)育上強(qiáng)有力的T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，其包括使T細(xì)胞與調(diào)節(jié)細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR通路的物質(zhì)接觸?？梢栽诨罨蛿U(kuò)增之前、期間和/或之后，使所述細(xì)胞進(jìn)行接觸。T細(xì)胞組合物保有足夠的T細(xì)胞效力以使它們可以經(jīng)歷多輪擴(kuò)增，而分化無明顯增加。

本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”、“調(diào)節(jié)劑”或“調(diào)節(jié)物質(zhì)”或者相當(dāng)?shù)男g(shù)語指物質(zhì)引發(fā)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的變化的能力。調(diào)節(jié)劑可以增加或減少通路組分的量、活性或者增加或減少細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的期望效應(yīng)或輸出。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是抑制劑。在另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是激活劑。

“物質(zhì)(agent)”指用于調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路的化合物、小分子，例如，小的有機(jī)分子，核酸，多肽或者它們的片段、同種型、變體、類似物或衍生物。

“小分子”指分子量小于約5kD、小于約4kD、小于約3kD、小于約2kD、小于約1kD或者小于約0.5kD的組合物。小分子可以包括核酸、肽、多肽、模擬肽、類肽、碳水化合物、脂質(zhì)或它們的組分或者其它有機(jī)或無機(jī)分子?；瘜W(xué)和/或生物混合物(如真菌、細(xì)菌或海藻的提取物)的文庫在本領(lǐng)域是已知的，并且可以用本發(fā)明的分析中的任何分析進(jìn)行篩選。合成分子文庫的方法的實(shí)例可見于：(Carell等人,1994a；Carell等人,1994b；Cho等人,1993；DeWitt等人,1993；Gallop等人,1994；Zuckermann等人,1994)。

“類似物”指與具有本發(fā)明的期望活性的化合物、核苷酸、蛋白或多肽或化合物具有類似或相同的活性或功能，但不一定包含與優(yōu)選實(shí)施方案中的序列或結(jié)構(gòu)類似或相同的序列或結(jié)構(gòu)的小的有機(jī)化合物、核苷酸、蛋白或多肽。

“衍生物”指這樣的化合物、蛋白或多肽，其包含的親本蛋白或多肽的氨基酸序列已通過引入氨基酸殘基置換、缺失或添加被改變，或者包含的核酸或核苷酸已通過引入核苷酸置換或缺失、添加或突變被修飾。衍生的核酸、核苷酸、蛋白或多肽與親本多肽具有類似或相同的功能。

在不同的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路的物質(zhì)激活所述通路的組分?！凹せ顒被颉凹?dòng)劑”指促進(jìn)、增加或誘導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR通路中的分子的一種或多種活性的物質(zhì)，其包括不限于，抑制PI3K、Akt或mTOR(或者mTORC1、mTORC2復(fù)合物)的一種或多種活性的分子。

在不同的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路的物質(zhì)抑制所述通路的組分?！耙种苿被颉稗卓箘敝敢种啤p少或降低PI3K/AKT/mTOR通路中的分子的一種或多種活性的物質(zhì)，所述分子包括不限于，PI3K、Akt或mTOR(或者mTORC1、mTORC2復(fù)合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑是雙分子抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑阻止蛋白復(fù)合物(如mTORCl或相關(guān)復(fù)合物)的形成。在具體實(shí)施方案中，抑制劑可以抑制具有相同活性或基本上類似活性的一類分子(pan-抑制劑)或者可以特異性地抑制分子的活性(選擇性或特異性抑制劑)。抑制還可以是不可逆或可逆的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑的IC50為至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少10μM、至少50μM或至少100μM?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何常規(guī)技術(shù)完成IC50的測(cè)定。例如，可以通過測(cè)量在存在一定濃度范圍的所研究的抑制劑的情況下給定酶的活性來測(cè)定IC50。然后針對(duì)所使用的抑制劑濃度繪制實(shí)驗(yàn)獲得的酶活性數(shù)值。將顯示50％酶活性(與不存在任何抑制劑的情況下的活性相比)的抑制劑濃度作為“IC50”值。類似地，可以通過適當(dāng)?shù)幕钚詼y(cè)定來限定其它抑制濃度。

在不同的實(shí)施方案中，用PI3K/AKT/mTOR通路的一種或多種調(diào)節(jié)劑以至少1nM、至少2nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM、至少200nM、至少500nM、至少1μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM或至少1M的濃度接觸或處理或培養(yǎng)T細(xì)胞。

在具體實(shí)施方案中，可以用PI3K/AKT/mTOR通路的一種或多種調(diào)節(jié)劑接觸或處理或培養(yǎng)T細(xì)胞至少12小時(shí)、18小時(shí)，至少1、2、3、4、5、6或7天，至少2周，至少1、2、3、4、5或6個(gè)月或者更多個(gè)月，伴隨著1、2、3、4、5、6、7、8、9或10輪或更多輪擴(kuò)增。

a.PI3K/AKT/mTOR通路

磷脂酰-肌醇-3激酶/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路作為整合生長因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞的增殖、分化、新陳代謝和存活的管道發(fā)揮作用。PI3K是高度保守的胞內(nèi)脂質(zhì)激酶家族。通過生長因子受體酪氨酸激酶(RTK)直接或者經(jīng)與銜接分子的胰島素受體底物家族的相互作用來激活I(lǐng)A類PI3K。該活性導(dǎo)致磷脂酰-肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)(絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt的調(diào)節(jié)物)的產(chǎn)生。mTOR通過經(jīng)典的PI3K通路經(jīng)2種不同的復(fù)合物起作用，所述復(fù)合物各自通過賦予不同活性的不同結(jié)合伴侶來表征。mTORC1(與PRAS40、raptor和mLST8/GbL復(fù)合的mTOR)作為PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)子發(fā)揮作用，其將生長因子信號(hào)與蛋白翻譯、細(xì)胞生長、增殖和存活相連。mTORC2(與rictor、mSIN1、protor和mLST8復(fù)合的mTOR)作為Akt的上游激活劑發(fā)揮作用。

基于生長因子受體介導(dǎo)的PI3K的激活，Akt通過其普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域與PIP3的相互作用被招募至膜，從而暴露其活化環(huán)并且能夠通過組成型激活的磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)使蘇氨酸308(Thr308)磷酸化。為了激活最大化，還通過mTORC2使Akt在其C-末端疏水基序的絲氨酸473(Ser473)處磷酸化。也顯示DNA-PK和HSP在Akt活性的調(diào)控中是重要的。Akt通過TSC2的抑制性磷酸化激活mTORC1，所述TSC2與TSC1一起通過抑制Rheb GTPase(mTORC1的正調(diào)節(jié)物)負(fù)調(diào)控mTORC1。mTORC1具有兩種定義明確的底物，p70S6K(以下稱為S6K1)和4E-BP1，這二者均嚴(yán)格調(diào)控蛋白的合成。因此，mTORC1是PI3K的重要下游效應(yīng)子，其將生長因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與蛋白翻譯和細(xì)胞增殖相連。

b.mTOR抑制劑

術(shù)語“mTOR抑制劑”或“抑制mTOR的物質(zhì)”指抑制mTOR蛋白的至少一種活性(如，例如對(duì)其底物中的至少一種(例如，p70S6激酶1、4E-BP1、AKT/PKB和eEF2)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性)的核酸、肽、化合物或小的有機(jī)分子。mTOR抑制劑能夠直接結(jié)合并抑制mTORC1、mTORC2或者mTORC1和mTORC2二者。

可以通過PI3K/Akt/mTOR通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的減弱來確定mTORC1和/或mTORC2活性的抑制。可以利用多種讀出確定此類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的輸出的減弱。一些非限制性的示例性讀出包括(1)在包括但不限于5473和T308殘基處Akt磷酸化的減少；(2)如例如通過Akt底物(包括但不限于Fox01/O3a T24/32，GSK3a/β；S21/9和TSC2T1462)的磷酸化的減少所證實(shí)的Akt激活的減少；(3)mTOR下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(包括但不限于核糖體S6S240/244、70S6K T389和4EBP1T37/46)的磷酸化的減少；以及(4)癌性細(xì)胞增殖的抑制。

在一個(gè)實(shí)施方案中，mTOR抑制劑是活性位點(diǎn)抑制劑。這些是與mTOR的ATP結(jié)合位點(diǎn)(也被稱為ATP結(jié)合口袋)結(jié)合并抑制mTORC1和mTORC2二者的催化活性的mTOR抑制劑。適合用于本文所考慮的T細(xì)胞制備方法的一類活性位點(diǎn)抑制劑是靶向并直接抑制PI3K和mTOR二者的雙特異性抑制劑。雙特異性抑制劑與mTOR和PI3K二者的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。此類抑制劑的示例性實(shí)例包括但不限于：咪唑喹唑啉、渥曼青霉素、LY294002、PI-103(Cayman Chemical)、SF1126(Semafore)、BGT226(Novartis)、XL765(Exelixis)和NVP-BEZ235(Novartis)。

適合用于本文所考慮的方法的另一類mTOR活性位點(diǎn)抑制劑相對(duì)于一種或多種I型磷脂酰肌醇3-激酶(例如，PI3激酶α、β、γ或δ)選擇性地抑制mTORC1和mTORC2的活性。這些活性位點(diǎn)抑制劑與mTOR而非PI3K的活性位點(diǎn)結(jié)合。此類抑制劑的示例性實(shí)例包括但不限于：吡唑并嘧啶、Torin1(Guertin和Sabatini)、PP242(2-(4-氨基-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-1H-吲哚-5-醇)、PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)以及AZD8055(Liu等人,Nature Review,8,627-644,2009)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇性mTOR抑制劑指關(guān)于mTORC1和/或mTORC2呈現(xiàn)這樣的50％抑制濃度(IC50)的物質(zhì)，所述IC50比所述抑制劑關(guān)于一種、兩種、三種或更多種I型PI3-激酶或者關(guān)于全部I型PI3-激酶的IC50低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或者更多倍。

用于本發(fā)明的另一類mTOR抑制劑在本文被稱為“雷帕霉素類似物(rapalog)”。本文使用的術(shù)語“雷帕霉素類似物”指這樣的化合物，其與mTOR FRB結(jié)構(gòu)域(FKBP雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)特異性結(jié)合，與雷帕霉素在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，并保留mTOR的抑制特性。術(shù)語雷帕霉素類似物不包括雷帕霉素。雷帕霉素類似物包括雷帕霉素的酯類、醚類、肟、腙和羥胺，以及其中雷帕霉素核心結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)已經(jīng)例如通過還原或氧化被修飾的化合物。此類化合物的藥學(xué)可接受的鹽也被認(rèn)為是雷帕霉素的衍生物。適合用于本文所考慮的方法的雷帕霉素類似物的示例性實(shí)例包括但不限于，坦西莫斯(temsirolimus)(CC1779)、依維莫司(RAD001)、deforolimus(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和OSI-027(OSI)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是mTOR抑制劑雷帕霉素(西羅莫司(sirolimus))。

在具體實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的示例性mTOR抑制劑抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2二者，其中IC50(抑制50％活性的濃度)為約200nM或更小、優(yōu)選約100nm或更小、甚至更優(yōu)選約60nM或更小、約25nM、約10nM、約5nM、約1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小。在一個(gè)方面，用于本發(fā)明的mTOR抑制劑抑制mTORC1、mTORC2或mTORC1和mTORC2二者，其中IC50為約2nM至約100nm，更優(yōu)選約2nM至約50nM，甚至更優(yōu)選約2nM至約15nM。

在一個(gè)實(shí)施方案中，示例性的mTOR抑制劑抑制PI3K和mTORC1或mTORC2或者mTORC1和mTORC2二者以及PI3K，其中IC50(抑制50％活性的濃度)為約200nM或更小、優(yōu)選約100nm或更小、甚至更優(yōu)選約60nM或更小、約25nM、約10nM、約5nM、約1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小。在一個(gè)方面，用于本發(fā)明的mTOR抑制劑抑制PI3K和mTORC1或mTORC2或者mTORC1和mTORC2二者以及PI3K，其中IC50為約2nM至約100nm，更優(yōu)選約2nM至約50nM，甚至更優(yōu)選為約2nM至約15nM。

適合用于本文所考慮的具體實(shí)施方案中的mTOR抑制劑的其它示例性實(shí)例包括但不限于AZD8055、INK128、雷帕霉素、PF-04691502和依維莫司。

如在蛋白質(zhì)印跡中通過磷光體-特異性抗體(phosphor-specific antibody)所測(cè)量的，已顯示mTOR顯示出針對(duì)生理學(xué)底物蛋白(p70S6核糖體蛋白激酶I(p70S6K1)和eIF4E結(jié)合蛋白1(4EBP1))的穩(wěn)健且特異的催化活性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，PI3K/AKT/mTOR通路的抑制劑是選自BI-D1870、H89、PF-4708671、FMK和AT7867的s6激酶抑制劑。

c.PI3K抑制劑

本文使用的術(shù)語“PI3K抑制劑”指結(jié)合并抑制PI3K的至少一種活性的核酸、肽、化合物或小的有機(jī)分子。可將PI3K蛋白分為三類：1類PI3K、2類PI3K和3類PI3K。1類PI3K以異二聚體的形式存在，所述異二聚體由四個(gè)p110催化亞基(p110α、p110β、p110δ和p110γ)之一和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基家族之一組成。本發(fā)明的PI3K抑制劑優(yōu)選靶向1類PI3K抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，PI3K抑制劑顯示出針對(duì)1類PI3K抑制劑的一種或多種同種型的選擇性(即，針對(duì)p110α、p110β、p110δ和p110γ或者p110α、p110β、p110δ和p110γ中的一種或多種的選擇性)。在另一方面，PI3K抑制劑不呈現(xiàn)同種型選擇性并且被認(rèn)為是“pan-PI3K抑制劑”。在一個(gè)實(shí)施方案中，PI3K抑制劑將與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PI3K的催化結(jié)構(gòu)域。

在某些實(shí)施方案中，PI3K抑制劑可以例如靶向PI3K以及PI3K-AKT-mTOR通路中的其它蛋白。在具體實(shí)施方案中，靶向mTOR和PI3K二者的PI3K抑制劑可被稱為mTOR抑制劑或PI3K抑制劑。只靶向PI3K的PI3K抑制劑可被稱為選擇性PI3K抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇性PI3K抑制劑可被理解為指關(guān)于PI3K呈現(xiàn)這樣的50％抑制濃度的物質(zhì)，所述50％的抑制濃度比所述抑制劑關(guān)于mTOR和/或通路中的其它蛋白的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。

在具體實(shí)施方案中，示例性的PI3K抑制劑抑制PI3K，其中IC50(抑制50％活性的濃度)為約200nM或更小、優(yōu)選約100nm或更小、甚至更優(yōu)選約60nM或更小、約25nM、約10nM、約5nM、約1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小。在一個(gè)實(shí)施方案中，PI3K抑制劑抑制PI3K，其中IC50為約2nM至約100nm，更優(yōu)選約2nM至約50nM，甚至更優(yōu)選約2nM至約15nM。

適合用于本文所考慮的T細(xì)胞制備方法的PI3K抑制劑的示例性實(shí)例包括但不限于，BKM120(1類PI3K抑制劑，Novartis)、XL147(1類PI3K抑制劑，Exelixis)、(pan-PI3K抑制劑，GlaxoSmithKline)和PX-866(1類PI3K抑制劑；p110α、p110β和p110γ同種型，Oncothyreon)。

選擇性PI3K抑制劑的其它示例性實(shí)例包括但不限于BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、ZSTK474和IPI-145。

pan-PI3K抑制劑的其它示例性實(shí)例包括但不限于BEZ235、LY294002、GSK1059615和GDC-0941。

d.AKT抑制劑

本文使用的術(shù)語“AKT抑制劑”指抑制AKT的至少一種活性的核酸、肽、化合物或小的有機(jī)分子。AKT抑制劑可被分為數(shù)種類型，包括基于脂質(zhì)的抑制劑(例如，靶向AKT的普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域的抑制劑，其阻止AKT定位至質(zhì)膜)、ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑以及變構(gòu)抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，AKT抑制劑通過與AKT催化位點(diǎn)結(jié)合而起作用。在具體實(shí)施方案中，Akt抑制劑通過抑制下游AKT靶標(biāo)(如mTOR)的磷酸化而起作用。在另一實(shí)施方案中，通過抑制例如DNA-PK激活A(yù)KT、PDK-1激活A(yù)KT和/或mTORC2激活A(yù)kt而抑制激活A(yù)kt的輸入信號(hào)，從而抑制AKT活性。

AKT抑制劑可以靶向所有三種AKT同種型：AKT1、AKT2、AKT3或者可以是同種型選擇性的，并且僅靶向AKT同種型中的一種或兩種。在一個(gè)實(shí)施方案中，AKT抑制劑可以靶向AKT以及PI3K-AKT-mTOR通路中的其它蛋白。僅靶向AKT的AKT抑制劑可以被稱為選擇性AKT抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇性AKT抑制劑可以被理解為指關(guān)于AKT呈現(xiàn)這樣的50％抑制濃度的物質(zhì)，所述50％抑制濃度比所述抑制劑關(guān)于通路中的其它蛋白的IC50低至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。

在具體實(shí)施方案中，示例性的AKT抑制劑抑制AKT，其中IC50(抑制50％活性的濃度)為約200nM或更小、優(yōu)選約100nm或更小、甚至更優(yōu)選約60nM或更小、約25nM、約10nM、約5nM、約1nM、100μM、50μM、25μM、10μM、1μM或更小。在一個(gè)實(shí)施方案中，AKT抑制劑抑制AKT，其中IC50為約2nM至約100nm，更優(yōu)選為約2nM至約50nM，甚至更優(yōu)選為約2nM至約15nM。

與基于阿里他汀(auristatin)的抗體-藥物偶聯(lián)物組合使用的AKT抑制劑的示例性實(shí)例包括，例如，哌立福辛(Keryx)、MK2206(Merck)、VQD-002(VioQuest)、XL418(Exelixis)、GSK690693、GDC-0068和PX316(PROLX Pharmaceuticals)。

選擇性Akt1抑制劑的示例性非限制性實(shí)例是A-674563。

選擇性Akt2抑制劑的示例性非限制性實(shí)例是CCT128930.

在具體實(shí)施方案中，Akt抑制劑抑制DNA-PK激活A(yù)kt、PDK-1激活A(yù)kt、mTORC2激活A(yù)kt或者HSP激活A(yù)kt。

DNA-PK抑制劑的示例性實(shí)例包括但不限于，NU7441、PI-103、NU7026、PIK-75和PP-121。

D.工程化的T細(xì)胞受體和嵌合抗原受體

所考慮的T細(xì)胞制備方法對(duì)于擴(kuò)增被修飾以表達(dá)高親和力T細(xì)胞受體(工程化的TCR)或嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞，而不同時(shí)增加這些修飾的T細(xì)胞的分化特別有用。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)一種或多種工程化的TCR或CAR。如本文所使用的，被修飾以表達(dá)本文所考慮的工程化的TCR或CAR的T細(xì)胞可被稱為“抗原-特異性重定向T細(xì)胞”。

1.工程化的TCR

天然存在的T細(xì)胞受體包含兩個(gè)亞基，α-亞基和β-亞基，其各自為由各T細(xì)胞基因組中的重組事件產(chǎn)生的獨(dú)特蛋白。可以針對(duì)TCR對(duì)特定靶抗原的選擇性篩選TCR文庫。以該方式，可以對(duì)對(duì)靶抗原具有高親合力和反應(yīng)性的天然TCR進(jìn)行選擇、克隆，以及隨后將其引入T細(xì)胞群用于過繼性免疫療法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過引入編碼具有形成TCR的能力的TCR亞基的多核苷酸對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾，所述TCR賦予T細(xì)胞對(duì)表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞的特異性。在具體實(shí)施方案中，與天然存在的亞基相比，亞基具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失、插入或修飾，只要所述亞基保留形成TCR的能力，其賦予以上轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞靶向靶細(xì)胞，并且參與免疫相關(guān)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。工程化的TCR優(yōu)選地還以高親合力結(jié)合展示相關(guān)腫瘤相關(guān)肽的靶細(xì)胞，并且任選地介導(dǎo)對(duì)在體內(nèi)遞呈相關(guān)肽的靶細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷。

編碼工程化的TCR的核酸優(yōu)選分離自它們?cè)赥細(xì)胞(天然存在的)染色體中的天然環(huán)境，并且可被并入如本文別處所描述的合適的載體中?？蓪⒑怂岷陀行О龊怂岬妮d體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，所述細(xì)胞優(yōu)選為T細(xì)胞。然后修飾的T細(xì)胞能夠表達(dá)由轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸所編碼的TCR的一條或多條鏈(以及優(yōu)選兩條鏈)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，工程化的TCR是外源TCR，因?yàn)槠浔灰胪ǔ２槐磉_(dá)所述特定TCR的T細(xì)胞。工程化的TCR的基本方面是其對(duì)通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)或類似的免疫組分呈遞的腫瘤抗原具有高親合力。與工程化的TCR相比，CAR被工程化以以MHC獨(dú)立的方式結(jié)合靶抗原。

由本發(fā)明的核酸所編碼的蛋白可以與連接至本發(fā)明的TCR的α-鏈或β-鏈的氨基末端或羧基末端部分的其它多肽一起表達(dá)，只要所連接的其它多肽不干擾α-鏈或β-鏈形成功能性T細(xì)胞受體以及MHC依賴性抗原識(shí)別的能力。

被本文所考慮的工程化的TCR識(shí)別的抗原包括但不限于癌癥抗原，包括血液癌和實(shí)體瘤上的抗原。示例性的抗原包括但不限于α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2。

2.嵌合抗原受體(CAR)

本文所考慮的T細(xì)胞制備方法包括對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾以表達(dá)如本文所考慮的一種或多種CAR。在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用載體進(jìn)行遺傳工程化的T細(xì)胞，所述載體被設(shè)計(jì)以表達(dá)將細(xì)胞毒性重定向至腫瘤細(xì)胞的CAR。CAR是這樣的分子：其將基于抗體的對(duì)靶抗原(例如，腫瘤抗原)的特異性與T細(xì)胞受體活化胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生呈現(xiàn)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫活性的嵌合蛋白。本文使用的術(shù)語“嵌合”描述了其由來自不同來源的不同蛋白或DNA的部分組成。

本文所考慮的CAR包含胞外結(jié)構(gòu)域(也被稱作結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域與特定的靶抗原結(jié)合。CAR的主要特性是它們使免疫效應(yīng)細(xì)胞特異性重定向的能力，從而引發(fā)增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、吞噬作用或者能夠以獨(dú)立于主要組織相容性(MHC)的方式介導(dǎo)表達(dá)靶抗原的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的分子的產(chǎn)生，利用單克隆抗體、可溶性配體或細(xì)胞特異性共受體的細(xì)胞特異性靶向的能力。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域或間隔結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及來自CD3ζ或FcRγ的初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括但不限于抗體或其抗原結(jié)合片段、束縛配體或者共受體的胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域與選自以下的靶抗原特異性結(jié)合：α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME，PSCA，PSMA，ROR1，SSX，生存素，TAG72，TEM和VEGFR2；所述跨膜結(jié)構(gòu)域包括但不限于來自CD8α、CD4、CD45、PD-1和CD152的跨膜結(jié)構(gòu)域；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括但不限于來自CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)的胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

a.結(jié)合結(jié)構(gòu)域

在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含與在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的靶標(biāo)多肽(例如，靶抗原)特異性結(jié)合的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“胞外結(jié)構(gòu)域”、“胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗原-特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“胞外抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域”可互換使用，并且提供具有與目的靶抗原特異性結(jié)合的能力的CAR。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含具有特異性識(shí)別并結(jié)合生物分子(例如，細(xì)胞表面受體或腫瘤蛋白、脂質(zhì)、多糖或者其它細(xì)胞表面靶標(biāo)分子或其組分)的能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含任何天然存在的、合成的、半合成的或者重組產(chǎn)生的目的生物分子的結(jié)合伴侶。

在具體實(shí)施方案中，CAR的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體或其抗原結(jié)合片段?！翱贵w”指這樣的結(jié)合劑：其為至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽，所述免疫球蛋白可變區(qū)特異性識(shí)別并結(jié)合靶抗原的表位，如含有抗原決定簇(如通過免疫細(xì)胞所識(shí)別的那些)的肽、脂質(zhì)、多糖或核酸的表位?？贵w包括其抗原結(jié)合片段。該術(shù)語還包括遺傳工程化的形式，如嵌合抗體(例如，人源化的鼠抗體)、異源綴合抗體(heteroconjugate antibody)(如，雙特異抗體)及其抗原結(jié)合片段。還參見，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,第三版.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

在具體實(shí)施方案中，靶抗原是以下的表位：α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽。

輕鏈和重鏈可變區(qū)含有被三個(gè)高變區(qū)間隔的“框架”區(qū)，也被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法，如通過根據(jù)Kabat等人(Wu,TT和Kabat,E.A.,J Exp Med.132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)；(參見,Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991,在此將其通過引用并入)所述的序列，或者通過根據(jù)Chothia等人(Choithia,C.和Lesk,A.M.,J Mol.Biol.,196(4):901-917(1987),Choithia,C.等人,Nature,342:877-883(1989))所述的結(jié)構(gòu)來限定或鑒定CDR。

不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種(如人)內(nèi)相對(duì)保守?？贵w的框架區(qū)(其為組成的輕鏈或重鏈的組合框架區(qū))用于在三維空間中定位和對(duì)齊CDR。CDR主要負(fù)責(zé)與抗原表位結(jié)合。各鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-末端開始順序編號(hào)，并且通常還通過特定CDR所位于的鏈進(jìn)行鑒定。因此，位于抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域上的CDR被稱作CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR被稱作CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特異性(即，針對(duì)不同抗原的不同結(jié)合位點(diǎn))的抗體具有不同的CDR。盡管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內(nèi)只有有限數(shù)量的氨基酸位點(diǎn)直接參與抗原結(jié)合。CDR內(nèi)的這些位點(diǎn)被稱為特異性決定殘基(SDR)。

提及“V_H”或“VH”，指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公開的其它抗體片段的重鏈可變區(qū)。提及“V_L”或“VL”，指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，其包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公開的其它抗體片段的輕鏈可變區(qū)。

“單克隆抗體”是由B淋巴細(xì)胞的單一克隆或者由轉(zhuǎn)染有單一抗體的輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過從骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的融合體制備雜交抗體形成細(xì)胞來產(chǎn)生單克隆抗體。單克隆抗體包括人源化單克隆抗體。

“嵌合抗體”具有來自來自一個(gè)物種(如人)的框架殘基和來自另外物種(如小鼠)的CDR(其通常賦予抗原結(jié)合)。在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榍逗峡贵w或其抗原結(jié)合片段。

在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是與腫瘤細(xì)胞上的表面蛋白特異性結(jié)合的人源化抗體(如人源化單克隆抗體)。“人源化”抗體是包含人框架區(qū)和來自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一種或多種CDR的免疫球蛋白?？梢酝ㄟ^遺傳工程的方法構(gòu)建人源化抗體(參見例如，美國專利第5,585,089號(hào))。

在具體實(shí)施方案中，CAR的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體或其抗原結(jié)合片段，包括但不限于駱駝Ig(駱駝科抗體(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、單鏈Fv抗體(“scFv”)、雙-scFv、(scFv)2、微型抗體(minibody)、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體(triabody)、四功能抗體(tetrabody)、二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)和單域抗體(sdAb，納米抗體)。

本文使用的“駱駝Ig”或“駱駝科VHH”指重鏈抗體的最小已知抗原結(jié)合單元(Koch-Nolte等人,FASEB J.,21:3490-3498(2007))?！爸劓溈贵w”或“駱駝科抗體”指含有兩個(gè)VH結(jié)構(gòu)域且無輕鏈的抗體(Riechmann L.等人,J.Immunol.Methods 231:25–38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美國專利第6,005,079號(hào))。

“免疫球蛋白新抗原受體”的“IgNAR”指來自鯊魚免疫庫的抗體類，其由一個(gè)可變的新抗原受體(VNAR)結(jié)構(gòu)域和五個(gè)恒定的新抗原受體(CNAR)結(jié)構(gòu)域的同源二聚體組成。

抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(叫做“Fab”片段)和剩余的“Fc”片段，所述兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段各自具有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，“Fc”片段的名字反映了其容易結(jié)晶的能力。Fab片段含有重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了幾個(gè)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH是本文對(duì)恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離的硫醇基的Fab’的命名。F(ab’)2抗體片段最初產(chǎn)生為Fab’片段對(duì)，所述Fab’片段對(duì)在其間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)體也是已知的。

“Fv”是最小的抗體片段，其含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以通過柔性肽接頭共價(jià)連接，使得輕鏈或重鏈可以以與雙鏈Fv種類中類似的“二聚”結(jié)構(gòu)的形式結(jié)合。

術(shù)語“雙功能抗體(diabody)”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，所述片段在同一多肽鏈中(VH-VL)包含與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不能使同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，強(qiáng)迫所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙功能抗體可以是二價(jià)的或雙特異性的。雙功能抗體更充分地描述于例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗體和四功能抗體也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。

“單結(jié)構(gòu)域抗體”或“sdAb”或“納米抗體”指由抗體重鏈的可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)或抗體輕鏈的可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)組成的抗體片段(Holt,L.等人，Trends in Biotechnology,21(11):484-490)。

“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上且處于任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)。通常，scFv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，所述接頭使scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。對(duì)于scFv的綜述，參見，例如，Pluckthün,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore編輯,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含與癌細(xì)胞上表達(dá)的抗原結(jié)合的抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閟cFv(小鼠scFv、人scFv或人源化scFv)。在某一實(shí)施方案中，scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2。

b.接頭

在某些實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR可以在各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，(例如在V_H和V_L結(jié)構(gòu)域之間)包含接頭殘基，添加所述接頭殘基為了所述分子的適當(dāng)?shù)拈g距和構(gòu)象。本文所考慮的CAR可以包含1、2、3、4或5個(gè)或者更多個(gè)接頭。在具體實(shí)施方案中，接頭的長度是約1至約25個(gè)氨基酸、約5至約20個(gè)氨基酸或約10至約20個(gè)氨基酸或者任意介于中間長度的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，接頭的長度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個(gè)或者更多個(gè)氨基酸。

接頭的示例性實(shí)例包括甘氨酸聚合物(G)_n；甘氨酸-絲氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少為1、2、3、4或5的整數(shù)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；以及本領(lǐng)域已知的其它柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物相對(duì)非結(jié)構(gòu)化，并且因此可以作為融合蛋白(如本文所描述的CAR)的結(jié)構(gòu)域之間的中性系鏈(neutral tether)。甘氨酸甚至比丙氨酸顯著更大程度地接近phi-psi空間，并且比具有更長側(cè)鏈的殘基受到更少的限制(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。普通技術(shù)人員將理解，在具體實(shí)施方案中，CAR的設(shè)計(jì)可以包含全部或部分柔性的接頭，使得接頭可以包含柔性接頭以及賦予較小柔性結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)部分以提供期望的CAR結(jié)構(gòu)。

其它示例性接頭包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO：X)；TGEKP(SEQ ID NO：X)(參見，例如，Liu等人,PNAS 5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO：X)(Pomerantz等人.1995,同上)；(GGGGS)_n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO：X)(Kim等人,PNAS 93,1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：X)(Chaudhary等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：X)(Bird等人,1988,Science 242:423-426)，GGRRGGGS(SEQ ID NO：X)；LRQRDGERP(SEQ ID NO：X)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO：X)；LRQKd(GGGS)₂ERP(SEQ ID NO：X)?？蛇x地，可以使用能夠模擬DNA-結(jié)合位點(diǎn)和肽自身的計(jì)算機(jī)程序(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS 91:11099-11103(1994))或者通過噬菌體展示方法合理地設(shè)計(jì)柔性接頭。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含還含有可變區(qū)連接序列的scFV?！翱勺儏^(qū)連接序列”是將重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連接的氨基酸序列，并且提供與兩個(gè)亞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用兼容的間隔功能，以使得到的多肽保留針對(duì)與包含相同輕鏈或重鏈可變區(qū)的抗體的靶分子相同的靶分子的特異性結(jié)合親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)連接序列的長度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個(gè)或更多個(gè)氨基酸。在具體實(shí)施方案中，可變區(qū)連接序列包含甘氨酸-絲氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少為1、2、3、4或5的整數(shù)。在另一實(shí)施方案中，可變區(qū)連接序列包含(G₄S)₃氨基酸接頭。

c.間隔結(jié)構(gòu)域

在具體實(shí)施方案中，CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后是一個(gè)或多個(gè)“間隔結(jié)構(gòu)域”，所述“間隔結(jié)構(gòu)域”指這樣的區(qū)域：其使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離效應(yīng)細(xì)胞的表面，使能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞/細(xì)胞接觸、抗原結(jié)合和活化(Patel等人,GeneTherapy,1999；6:412-419)。間隔結(jié)構(gòu)域可以源自天然的、合成的、半合成的或重組來源。在某些實(shí)施方案中，間隔結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于，一個(gè)或多個(gè)重鏈恒定區(qū)，例如，CH2和CH3。間隔結(jié)構(gòu)域可以包含天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔結(jié)構(gòu)域包含IgG1的CH2和CH3。

d.鉸鏈結(jié)構(gòu)域

通常，CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后是一個(gè)或多個(gè)“鉸鏈結(jié)構(gòu)域”，其在將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域定位于遠(yuǎn)離效應(yīng)細(xì)胞表面以能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞/細(xì)胞接觸、抗原結(jié)合和活化方面發(fā)揮作用。CAR通常在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)之間包含一個(gè)或多個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以源自天然的、合成的、半合成的或重組來源。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以包含天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。

適合用于本文所描述的CAR的示例性鉸鏈結(jié)構(gòu)域包括源自1型膜蛋白(如CD8α、CD4、CD28和CD7)胞外區(qū)的鉸鏈區(qū)，其可以是來自這些分子的野生型鉸鏈區(qū)，或者可以是改變了的鉸鏈區(qū)。在另一實(shí)施方案中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含CD8α鉸鏈區(qū)。

e.跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域

“跨膜結(jié)構(gòu)域”是CAR的一部分，其使胞外結(jié)合部分和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域融合，并且使CAR錨定至免疫效應(yīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上。TM結(jié)構(gòu)域可以源自天然的、合成的、半合成的或重組來源。

示例性的TM結(jié)構(gòu)域可以源自(即，至少包括以下的跨膜區(qū))：T細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152和CD154。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含源自CD8α的TM結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含源自CD8α的TM結(jié)構(gòu)域和優(yōu)選長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸的短的寡肽或多肽接頭，所述接頭連接CAR的TM結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。甘氨酸-絲氨酸接頭提供特別合適的接頭。

f.胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。“胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指CAR的一部分，其參與將有效的CAR結(jié)合靶抗原的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)部，以引發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的功能，例如活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增殖和細(xì)胞毒性活性，包括將細(xì)胞毒性因子釋放至CAR結(jié)合的靶細(xì)胞或者用與胞外CAR結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原引發(fā)的其它細(xì)胞應(yīng)答。

術(shù)語“效應(yīng)功能”指細(xì)胞的特化功能。T細(xì)胞的效應(yīng)功能，例如，可以是細(xì)胞溶解活性或者輔助或者包括細(xì)胞因子的分泌在內(nèi)的活性。因此，術(shù)語“胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)并引導(dǎo)細(xì)胞實(shí)施特化功能的蛋白部分。雖然通常可以采用整個(gè)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但是在許多情況下，不必使用整個(gè)結(jié)構(gòu)域。就使用胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，此類截短部分可以用于代替整個(gè)結(jié)構(gòu)域，只要其能轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)。術(shù)語胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域意指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。

已知，單獨(dú)通過TCR產(chǎn)生的信號(hào)不足以完全活化T細(xì)胞，并且還需要次級(jí)信號(hào)或共刺激信號(hào)。因此，T細(xì)胞活化可以說成是由兩種不同類型的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)：初級(jí)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，其通過TCR(例如，TCR/CD3復(fù)合物)起始抗原依賴的初級(jí)活化；和共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其以抗原非依賴性方式起作用以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含含有一個(gè)或多個(gè)“共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”和“初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以刺激的方式或抑制的方式調(diào)控TCR復(fù)合物的初級(jí)活化。以刺激方式起作用的初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含被稱為免疫受體酪氨酸激活基序或ITAM的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序。

在本發(fā)明中特別有用的含有ITAM的初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的示例性實(shí)例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，CAR包含CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以以任意順序串聯(lián)連接至跨膜結(jié)構(gòu)域的羧基末端。

本文所考慮的CAR包含一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)表達(dá)CAR受體的T細(xì)胞的效力和擴(kuò)增。本文使用的術(shù)語“共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或“共刺激結(jié)構(gòu)域”指共刺激分子的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

此類共刺激分子的示例性實(shí)例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM和NKD2C以及CD83。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含選自CD28、CD137和CD134的一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含scFv、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自CD8α；CD4、CD45、PD-1和CD152的多肽；以及所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274和CD278。

在另一實(shí)施方案中，CAR包含scFv，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2；所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域選自IgG1鉸鏈/CH2/CH3和CD8α，以及CD8α；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自CD8α，CD4、CD45、PD-1和CD152的多肽；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

而在另一實(shí)施方案中，CAR包含scFv，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；所述scFv還含有接頭，其結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域選自：IgG1鉸鏈/CH2/CH3和CD8α，以及CD8α；所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含TM結(jié)構(gòu)域和短的寡肽或多肽接頭，所述TM結(jié)構(gòu)域源自選自CD8α；CD4、CD45、PD-1和CD152的多肽，所述短的寡肽或多肽接頭將TM結(jié)構(gòu)域與CAR的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接，其長度優(yōu)選為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸；以及所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

在具體實(shí)施方案中，CAR包含scFv，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；所述scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2多肽；所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含CD8α多肽；所述CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域包含約3個(gè)氨基酸的多肽接頭；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

E.多肽

本發(fā)明部分考慮工程化的TCR和CAR多肽及其片段，包含所述工程化的TCR和CAR多肽及其片段的細(xì)胞和組合物，以及表達(dá)多肽的載體。除非指明相反，根據(jù)常規(guī)含義，“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”可互換使用，即，為氨基酸的序列。多肽不限于特定的長度，例如，它們可以包含全長蛋白序列或者全長蛋白的片段，并且可以包括多肽的翻譯后修飾物(例如，糖基化物、乙?；?、磷酸化物等)以及天然存在和非天然存在的本領(lǐng)域已知的其它修飾物。在不同實(shí)施方案中，本文所考慮的多肽在蛋白的N末端包含信號(hào)(或前導(dǎo))序列，其共翻譯或翻譯后地引導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移。可用于本公開的合適的信號(hào)序列的示例性實(shí)例包括但不限于IgG1重鏈信號(hào)序列和CD8α信號(hào)序列。可以使用多種熟知的重組和/或合成技術(shù)中的任何技術(shù)來制備多肽。具體地，本文所考慮的多肽包含本公開的CAR，或者具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加和/或置換的本文所考慮的多肽的序列。

多肽包括“多肽變體”。多肽變體與天然存在的多肽的不同之處可以在于一處或多處置換、缺失、添加和/或插入。此類變體可以是天然存在的或者例如通過對(duì)上述多肽序列中的一種或多種進(jìn)行修飾而合成產(chǎn)生的。例如，在具體實(shí)施方案中，可以期望通過引入一處或多處置換、缺失、添加和/或插入來改善工程化的TCR或CAR的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包括與其具有至少約65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽。

多肽包括“多肽片段”。多肽片段指天然存在的或重組產(chǎn)生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或內(nèi)部缺失或置換的多肽，其是單體或多體。在某些實(shí)施方案中，多肽片段可以包含至少5個(gè)至約500個(gè)氨基酸長度的氨基酸鏈。將理解，在某些實(shí)施方案中，片段的長度為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450個(gè)氨基酸。

多肽還可以框內(nèi)融合或者與接頭或其它序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，多His)，或者以增強(qiáng)多肽與固體支持物的結(jié)合。

如上所注意到的，可以以多種方式改變本發(fā)明的多肽，包括氨基酸的置換、缺失、截短和插入。此類操作的方法在本領(lǐng)域通常是已知的。例如，可以通過DNA的突變制備參照多肽的氨基酸序列變體。用于突變發(fā)生和核苷酸序列改變的方法在本領(lǐng)域眾所周知。參見，例如，Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)、Kunkel等人(1987,Methods in Enzymol,154:367-382)、美國專利第4,873,192號(hào)、Watson,J.D.等人(《基因的分子生物學(xué)》(Molecular Biology of the Gene))，第四版，Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白的生物學(xué)活性的適當(dāng)氨基酸置換的指導(dǎo)可見于Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模式。

在某些實(shí)施方案中，變體將包含保守性置換。“保守性置換”是這樣的置換，其中氨基酸被置換為具有類似特性的另一氨基酸，使得肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)期所述多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水(hydropathic)性質(zhì)基本上未改變?？梢詫?duì)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，并仍然獲得編碼具有期望特性的變體或衍生多肽的功能分子。

多肽變體還包括糖基化形式、與其它分子的聚集綴合物，以及具有不相關(guān)的化學(xué)部分(例如，聚乙二醇化的分子)的共價(jià)綴合物。如本領(lǐng)域所知，可以通過將官能團(tuán)與存在于氨基酸鏈的基團(tuán)或位于N-末端或C-末端的殘基連接來制備共價(jià)變體。變體還包括等位變體、物種變體和突變蛋白(mutein)。不影響蛋白功能活性的區(qū)域的截短或缺失也是變體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)期望表達(dá)兩種或更多種多肽時(shí)，可以通過如本文別處所討論的IRES序列隔開編碼所述多肽的多核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，兩種或更多種多肽可以表達(dá)為包含一個(gè)或多個(gè)自切割多肽序列的融合蛋白。

本發(fā)明的多肽包括融合多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供融合多肽和編碼融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白指包含至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或十個(gè)或更多個(gè)多肽區(qū)段的多肽。融合多肽通常是C-末端連接至N-末端，但是它們也可以是C-末端連接至C-末端、N-末端連接至N-末端、或者N-末端連接至C-末端。融合蛋白的多肽可以是任意順序或指定的順序。融合多肽或融合蛋白還可以包括保守修飾的變體、多態(tài)變體、等位基因、突變體、子序列以及種間同系物，只要保留融合多肽的期望轉(zhuǎn)錄活性?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成方法或者通過兩個(gè)部分之間化學(xué)鍵合來產(chǎn)生融合多肽，或者通?？梢允褂闷渌鼧?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備融合多肽。將包含融合多肽的連接的DNA序列與如本文別處所討論的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件可操作地連接。

在一個(gè)實(shí)施方案中，融合伴侶包含有助于以比天然重組蛋白更高的產(chǎn)率表達(dá)蛋白的序列(表達(dá)增強(qiáng)子)?？梢赃x擇其它融合伴侶，以增加蛋白的溶解性或者使蛋白能夠靶向期望的胞內(nèi)區(qū)室或者促進(jìn)融合蛋白通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。

融合多肽還可以在本文所描述的各多肽結(jié)構(gòu)域之間包含多肽切割信號(hào)。此外，多肽位點(diǎn)可以位于任何接頭肽序列中。示例性的多肽切割信號(hào)包括多肽切割識(shí)別位點(diǎn)，如蛋白酶切割位點(diǎn)、核酸酶切割位點(diǎn)(例如，罕見限制性酶識(shí)別位點(diǎn)、自切割核酶識(shí)別位點(diǎn))和自切割病毒寡肽(參見deFelipe and Ryan,2004.Traffic,5(8)；616-26)。

合適的蛋白酶切割位點(diǎn)和自切割肽對(duì)技術(shù)人員來說是已知的(參見，例如，Ryan等人,1997.J.Gener.Virol.78,699-722；Scymczak等人(2004)Nature Biotech.5,589-594)。示例性的蛋白酶切割位點(diǎn)包括但不限于以下的切割位點(diǎn)：馬鈴薯Y病毒NIa蛋白酶(例如，煙草蝕紋病毒蛋白酶)、馬鈴薯Y病毒HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus NIa蛋白酶、byovirus RNA-2-編碼的蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、腸病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小RNA病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花葉病毒24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻東格魯球狀病毒)3C-樣蛋白酶、PYVF(歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒)3C-樣蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和腸激酶。由于其高的切割嚴(yán)格性，在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選TEV(煙草蝕紋病毒)蛋白酶切割位點(diǎn)，例如，EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO：)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO：)和ENLYFQS(SEQ ID NO：)，其中X代表任何氨基酸(TEV切割發(fā)生在Q和G或者Q和S之間)。

在具體實(shí)施方案中，自切割肽包括獲自以下的那些多肽序列：馬鈴薯Y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫疾病病毒)、馬鼻炎病毒A、明脈扁刺蛾β四體病毒和豬捷申病毒。

在某些實(shí)施方案中，自切割多肽位點(diǎn)包含2A或2A-樣位點(diǎn)、序列或結(jié)構(gòu)域(Donnelly等人,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。

F.多核苷酸

在具體實(shí)施方案中，提供編碼本文所考慮的一種或多種工程化的TCR或CAR多肽的多核苷酸。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸”指信使RNA(mRNA)、RNA、基因組RNA(gRNA)、正鏈RNA(RNA(+))、負(fù)鏈RNA(RNA(-))、基因組DNA(gDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)或重組DNA。多核苷酸包括單鏈和雙鏈多核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸包括與本文所描述的任何參照序列(參見，例如，序列表)具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或變體，通常，其中所述變體維持參照序列的至少一種生物學(xué)活性。在不同的示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明部分考慮包含多核苷酸的表達(dá)載體、病毒載體、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和組合物，以及包含所述包含多核苷酸的表達(dá)載體、病毒載體、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和組合物的細(xì)胞。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明多肽的至少約5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000個(gè)或者更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，以及所有中間長度的連續(xù)氨基酸殘基的多核苷酸。將容易理解，本背景中的“中間長度”意指引用的數(shù)值之間的任意長度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。

本文使用的術(shù)語“多核苷酸變體”和“變體”等，指與參照多核苷酸序列呈現(xiàn)基本的序列同一性的多核苷酸，或者在其后所定義的嚴(yán)格條件下與參照序列雜合的多核苷酸。這些術(shù)語包括與參照多核苷酸相比，添加或缺失了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，或者用不同核苷酸替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸的多核苷酸。在這點(diǎn)上，在本領(lǐng)域眾所周知的是，可以對(duì)參照多核苷酸進(jìn)行某些改變，包括突變、添加、缺失和置換，以使改變的多核苷酸保留參照多核苷酸的生物學(xué)功能或活性。

本文使用的敘述“序列同一性”或者例如，包含“與…50％相同的序列”，指在比較窗口中以逐個(gè)核苷酸或逐個(gè)氨基酸為基礎(chǔ)的序列相同的程度。因此，可以通過以下步驟計(jì)算“序列同一性百分比”：對(duì)比較窗口中兩個(gè)最佳對(duì)齊的序列進(jìn)行比較，確定兩個(gè)序列中均存在的相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位點(diǎn)數(shù)以得到匹配位點(diǎn)的數(shù)目，將匹配的位點(diǎn)數(shù)除以比較窗口中的總位點(diǎn)數(shù)(即，窗口大小)，并且將結(jié)果乘以100，以產(chǎn)生序列同一性的百分比。包括與本文所描述的任何參照序列具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽變體維持參照多肽的至少一種生物學(xué)活性。

用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參照序列”、“比較窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“基本相同”?！皡⒄招蛄小钡拈L度為至少12個(gè)，但經(jīng)常為15至18個(gè)，以及通常至少25個(gè)單體單元，所述單體單元包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可以各自包含(1)兩個(gè)多核苷酸之間類似的序列(即，僅完整多核苷酸序列的一部分)和(2)兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列，所以通常通過比較“比較窗口”中的兩個(gè)多核苷酸的序列來進(jìn)行兩個(gè)(或者更多個(gè))多核苷酸之間的序列比較，從而鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性?！氨容^窗口”指至少6個(gè)連續(xù)位點(diǎn)，通常約50至約100個(gè)，更通常約100至約150個(gè)連續(xù)位點(diǎn)的概念上的區(qū)段，其中在將兩個(gè)序列最佳對(duì)齊后，將序列與相同連續(xù)位點(diǎn)數(shù)的參照序列進(jìn)行比較。為了兩個(gè)序列的最佳對(duì)齊，比較窗口可以包含與參照序列(其不包含添加或缺失)相比約20％或更少的添加或缺失(即，空位)。可以通過算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(威斯康星遺傳學(xué)軟件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通過檢驗(yàn)和由所選擇的各種方法中的任何方法所產(chǎn)生的最佳對(duì)齊(即，在比較窗口中產(chǎn)生最高百分比同源性)，進(jìn)行對(duì)齊比較窗口的序列的最佳比對(duì)。還可以參考如例如由Altschul等人,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公開的BLAST程序家族。序列分析的詳細(xì)討論可見于Ausubel等人編著的《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章)第19.3單元。

本發(fā)明的多核苷酸(不考慮編碼序列本身的長度)可以與本文別處所公開的或者本領(lǐng)域已知的其它DNA序列組合，使得它們的總長度可以大大改變，所述其它DNA序列如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，非翻譯區(qū)(UTR)，Kozak序列，聚腺苷酸化信號(hào)，另外的限制性酶位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，重組酶識(shí)別位點(diǎn)(例如LoxP、FRT和Att位點(diǎn))，終止密碼子，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及編碼自切割多肽、表位標(biāo)簽的多核苷酸。因此考慮，可以采用幾乎任意長度的多核苷酸片段，其中總長度優(yōu)選受制備的容易性和在預(yù)期的重組DNA方案中的用途的限制。

可以使用本領(lǐng)域已知且可用的各種很好建立的技術(shù)中的任一種來制備、操作和/或表達(dá)多核苷酸。為了表達(dá)期望的多肽，可以將編碼多肽的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)妮d體中。載體的實(shí)例是質(zhì)粒、自主復(fù)制序列和轉(zhuǎn)座元件。另外的示例性載體包括但不限于，質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、人工染色體(如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC))、細(xì)菌噬菌體(如λ噬菌體或M13噬菌體)以及動(dòng)物病毒。可用作載體的動(dòng)物病毒類的實(shí)例包括但不限于：逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒和乳頭多瘤空泡病毒(例如SV40)。表達(dá)載體的實(shí)例是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pClneo載體(Promega)；用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的pLenti4/V5-DEST^TM、pLenti6/V5-DEST^TM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在具體實(shí)施方案中，可以將本文所公開的嵌合蛋白的編碼序列連接進(jìn)此類表達(dá)載體中，以用于嵌合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。

存在于表達(dá)載體中的“控制元件”或“調(diào)控序列”是載體的那些非翻譯區(qū)-復(fù)制起點(diǎn)、選擇盒、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、翻譯起始信號(hào)(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)內(nèi)含子、聚腺苷酸化序列、5’和3’非翻譯區(qū)-其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類元件在強(qiáng)度和特異性方面可以不同。根據(jù)所利用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括普遍存在的啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

在具體實(shí)施方案中，用于實(shí)踐本發(fā)明的載體(包括但不限于表達(dá)載體和病毒載體)將包含外源、內(nèi)源或異源控制序列，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。“內(nèi)源”控制序列是與基因組中的指定的基因天然連接的序列?！巴庠础笨刂菩蛄惺峭ㄟ^遺傳操作的方法(即，分子生物學(xué)技術(shù))與基因并列放置，以使所述基因的轉(zhuǎn)錄由連接的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子引導(dǎo)的序列。“異源”控制序列是來自與進(jìn)行遺傳操作的細(xì)胞不同物種的外源序列。

本文使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”指RNA聚合酶所結(jié)合的多核苷酸(DNA或RNA)的識(shí)別位點(diǎn)。RNA聚合酶起始并轉(zhuǎn)錄與啟動(dòng)子可操作地連接的多核苷酸。在具體實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子包含位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約25至30個(gè)堿基處的富含AT的區(qū)域和/或存在于轉(zhuǎn)錄開始上游70至80個(gè)堿基處的另一序列，CNCAAT區(qū)域，其中N可以是任意核苷酸。

術(shù)語“增強(qiáng)子”指這樣的DNA區(qū)段：其含有能夠提供增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄且在某些情況下可以獨(dú)立于其與另一控制序列相對(duì)的方向而起作用的序列。增強(qiáng)子可以與啟動(dòng)子和/或其它增強(qiáng)子元件合作地或疊加地起作用。術(shù)語“啟動(dòng)子/增強(qiáng)子”指含有能夠提供啟動(dòng)子和增強(qiáng)子功能的序列的DNA區(qū)段。

術(shù)語“可操作地連接”指并列，其中所描述的組分處于允許其以它們預(yù)期的方式起作用的關(guān)系中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語指核酸表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)和第二多核苷酸序列(例如，目的多核苷酸)之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列引導(dǎo)與第二序列對(duì)應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄。

本文使用的術(shù)語“組成型表達(dá)控制序列”指連續(xù)地或連續(xù)不斷地允許可操作地連接的序列的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。組成型表達(dá)控制序列可以分別是允許在多種細(xì)胞和組織類型中表達(dá)的“普遍存在的”啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，或者是允許在有限種類的細(xì)胞和組織類型中表達(dá)的“細(xì)胞特異性”、“細(xì)胞類型特異性”、“細(xì)胞譜系特異性”或“組織特異性”的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。

適合用于本發(fā)明的具體實(shí)施方案中的示例性的普遍存在的表達(dá)控制序列包括但不限于：巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子，病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR啟動(dòng)子，Rous肉瘤病毒(RSV)LTR，單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動(dòng)子，來自牛痘病毒的H5、P7.5和P11啟動(dòng)子，延伸因子1-α(EF1a)啟動(dòng)子，早期生長應(yīng)答因子1(EGR1)，鐵蛋白H(FerH)，鐵蛋白L(FerL)，甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，真核翻譯起始因子4A1(EIF4A1)，熱休克70kDa蛋白5(HSPA5)，熱休克蛋白90kDaβ成員1(HSP90B1)，熱休克蛋白70kDa(HSP70)，β-驅(qū)動(dòng)蛋白(β-KIN)，人ROSA26基因座(Irions等人,Nature Biotechnology 25,1477-1482(2007))，泛素C啟動(dòng)子(UBC)，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白(CAG)啟動(dòng)子，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及骨髓增殖肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)增強(qiáng)子負(fù)控制區(qū)缺失的dl587rev引物-結(jié)合位點(diǎn)取代的(MND)啟動(dòng)子(Challita等人,J Virol.69(2):748-55(1995))。

在具體實(shí)施方案中，可以期望由在T細(xì)胞中提供穩(wěn)定且長期表達(dá)的啟動(dòng)子表達(dá)包含工程化的TCR或CAR的多核苷酸，并且表達(dá)水平足以使T細(xì)胞重定向至表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是EF1α啟動(dòng)子或MND啟動(dòng)子。

本文使用的“條件性表達(dá)”可以指任何類型的條件性表達(dá)，包括但不限于可誘導(dǎo)的表達(dá)；可阻遏的表達(dá)；在具有特定生理學(xué)、生物學(xué)或疾病狀態(tài)等的細(xì)胞或組織中的表達(dá)。該定義并非意圖排除細(xì)胞類型或組織的特異性表達(dá)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供目的多核苷酸的條件性表達(dá)，例如通過使細(xì)胞、組織、有機(jī)體等經(jīng)歷引起多核苷酸表達(dá)或者引起由目的多核苷酸編碼的多核苷酸的表達(dá)增加或減少的處理或條件來控制表達(dá)。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/系統(tǒng)的示例性實(shí)例包括但不限于，類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如用于編碼糖皮質(zhì)激素或雌激素受體的基因的啟動(dòng)子(可通過用對(duì)應(yīng)的激素處理來誘導(dǎo)))、金屬硫蛋白啟動(dòng)子(metallothionine promoter)(可通過用不同的重金屬處理來誘導(dǎo))、MX-1啟動(dòng)子(可通過干擾素誘導(dǎo))、“GeneSwitch”米非司酮調(diào)控系統(tǒng)(Sirin等人,2003,Gene,323:67)、cumate誘導(dǎo)型基因開關(guān)(WO 2002/088346)、四環(huán)素依賴性調(diào)控系統(tǒng)等。

也可以通過使用位點(diǎn)特異性DNA重組酶實(shí)現(xiàn)條件性表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，載體包含至少一個(gè)(通常兩個(gè))位點(diǎn)用于通過位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)的重組。本文使用的術(shù)語“重組酶”或“位點(diǎn)特異性重組酶”包括參與重組反應(yīng)的分割的或整合的蛋白、酶、輔因子或相關(guān)蛋白，所述重組反應(yīng)涉及一個(gè)或多個(gè)(例如，2個(gè)，3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè)、12個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、50個(gè)等)重組位點(diǎn)，其可以是野生型蛋白(參見Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993))，或者其突變體、衍生物(例如，含有重組蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和變體。適合用于本發(fā)明具體實(shí)施方案中的重組酶的示例性實(shí)例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解離酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1以及ParA。

G.病毒載體

在具體實(shí)施方案中，用編碼本文所考慮的工程化的TCR或CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如，慢病毒載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞引發(fā)穩(wěn)定、長期且持久的T-細(xì)胞應(yīng)答。

本文使用的術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒”指將其基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為線性雙鏈DNA拷貝并使其基因組DNA隨后共價(jià)整合進(jìn)宿主基因組的RNA病毒。適合用于具體實(shí)施方案中的示例性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend鼠白血病病毒、鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)和Rous肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。

本文使用的術(shù)語“慢病毒”指復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒組(或?qū)?。示例性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；維斯納-梅迪病毒(visna-maedi virus)(VMV)；山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)；馬傳染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選基于HIV的載體骨架(即，HIV順式作用序列元件)。

術(shù)語“載體”在本文用來指能夠轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)運(yùn)另外的核酸分子的核酸分子。轉(zhuǎn)移的核酸通常被連接至例如插入載體的核酸分子中。載體可以包含引導(dǎo)在細(xì)胞中的自主復(fù)制的序列，或者可以包含足以允許整合進(jìn)宿主細(xì)胞DNA的序列。有用的載體包括，例如，質(zhì)粒(例如，DNA質(zhì)?；騌NA質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)座子、粘粒、細(xì)菌人工染色體和病毒載體。有用的病毒載體包括，例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。

如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，術(shù)語“病毒載體”廣泛用于指包含通常促進(jìn)核酸分子的轉(zhuǎn)移或整合進(jìn)細(xì)胞基因組的病毒來源的核酸元件的核酸分子(例如，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒)，或者指介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)移的病毒顆粒。病毒顆粒通常包含各種病毒組分，并且有時(shí)還包含除核酸之外的宿主細(xì)胞組分。

術(shù)語病毒載體可以指能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的病毒或病毒顆粒，或者指轉(zhuǎn)移的核酸本身。病毒載體和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒含有主要源自病毒的結(jié)構(gòu)和/或功能性遺傳元件。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”指含有主要源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)和功能性遺傳元件或其部分的病毒載體或質(zhì)粒。術(shù)語“慢病毒載體”指含有主要源自慢病毒的結(jié)構(gòu)和功能性遺傳元件或者其部分(包括LTR)的病毒載體或質(zhì)粒。術(shù)語“雜合載體”指含有逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)序列和非慢病毒序列的載體、LTR或其它核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜合載體指包含用于逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、整合和/或包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒)序列的載體或轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。

在具體實(shí)施方案中，術(shù)語“慢病毒載體”、“慢病毒表達(dá)載體”可以用來指慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和/或感染性慢病毒顆粒。當(dāng)在本文提及諸如克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控元件、異源核酸等的元件時(shí)，應(yīng)理解，這些元件的序列以RNA形式存在于本發(fā)明的慢病毒顆粒中，以及以DNA形式存在于本發(fā)明的DNA質(zhì)粒中。

在原病毒的各端是叫做“長末端重復(fù)序列”或“LTR”的結(jié)構(gòu)。術(shù)語“長末端重復(fù)序列(LTR)”指位于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA端的堿基對(duì)結(jié)構(gòu)域，在其天然序列背景中，所述堿基對(duì)結(jié)構(gòu)域是直接的重復(fù)并且含有U3、R和U5區(qū)域。LTR通常對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的表達(dá)(例如，基因轉(zhuǎn)錄本的促進(jìn)、起始和聚腺苷酸化)以及病毒復(fù)制提供基本功能。LTR含有眾多調(diào)控信號(hào)，包括轉(zhuǎn)錄控制元件、聚腺苷酸化信號(hào)以及病毒基因組的復(fù)制和整合所需的序列。將病毒LTR分為叫做U3、R和U5的三個(gè)區(qū)域。U3區(qū)含有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件。U5區(qū)是引物結(jié)合位點(diǎn)和R區(qū)之間的序列，并且含有聚腺苷酸化序列。R(重復(fù))區(qū)的側(cè)翼是U3和U5區(qū)。LTR由U3、R和U5區(qū)構(gòu)成，并且出現(xiàn)在病毒基因組的5’端和3’端。鄰近5’LTR的是基因組反轉(zhuǎn)錄所需的序列(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))以及病毒RNA有效包裝成顆粒所需的序列(Psi位點(diǎn))。

本文使用的術(shù)語“包裝信號(hào)”或“包裝序列”指位于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組內(nèi)的序列，其是將病毒RNA插入病毒衣殼或顆粒所必需的，參見例如，Clever等人,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4；pp.2101–2109。數(shù)種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體利用病毒基因組衣殼化所需的最小包裝信號(hào)(也被稱作psi[Ψ]序列)。因此，本文使用的術(shù)語“包裝序列”、“包裝信號(hào)”、“psi”和符號(hào)“Ψ”被用來提及病毒顆粒形成期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA鏈衣殼化所需的非編碼序列。

在不同實(shí)施方案中，載體包含修飾的5’LTR和/或3’LTR。所述LTR的任一者或二者可以包含一種或多種修飾，包括但不限于，一處或多處缺失、插入或置換。通常對(duì)3’LTR進(jìn)行修飾以通過使病毒復(fù)制缺陷，來改善慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性。本文使用的術(shù)語“復(fù)制缺陷”指不能夠完全有效復(fù)制以致于不能產(chǎn)生感染性病毒顆粒(例如，復(fù)制缺陷型慢病毒子代)的病毒。術(shù)語“可復(fù)制(replication-competent)”指能夠復(fù)制以致于病毒的病毒復(fù)制能夠產(chǎn)生感染性病毒顆粒(例如，可復(fù)制的慢病毒子代)的野生型病毒或突變病毒。

“自失活”(SIN)載體指復(fù)制缺陷型載體，例如被稱作U3區(qū)的右端(3’)LTR增強(qiáng)子-啟動(dòng)子區(qū)被修飾(例如，通過缺失或置換)以阻止除第一輪病毒復(fù)制之外的病毒轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體。這是因?yàn)?，在病毒?fù)制期間右端(3’)LTR U3區(qū)被用作左端(5’)LTR U3區(qū)的模板，因此在無U3增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的情況下不能形成病毒轉(zhuǎn)錄本。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，對(duì)3’LTR進(jìn)行修飾以使U5區(qū)被例如理想的聚(A)序列替換。應(yīng)當(dāng)注意到，本發(fā)明也包括對(duì)LTR的修飾，如對(duì)3’LTR、5’LTR或者3’和5’LTR二者的修飾。

通過用異源啟動(dòng)子替換5’LTR的U3區(qū)以在病毒顆粒產(chǎn)生期間驅(qū)動(dòng)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄來提供另外的安全性增強(qiáng)?？梢允褂玫漠愒磫?dòng)子的實(shí)例包括，例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、Rous肉瘤病毒(RSV)和單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動(dòng)子。典型的啟動(dòng)子能夠以Tat獨(dú)立型方式驅(qū)動(dòng)高水平的轉(zhuǎn)錄。該替換降低了重組以產(chǎn)生可復(fù)制的病毒的可能性，因?yàn)樵诓《井a(chǎn)生系統(tǒng)中不存在完整的U3序列。在某些實(shí)施方案中，異源啟動(dòng)子在控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄方式方面具有另外的優(yōu)勢(shì)。例如，異源啟動(dòng)子可以是可誘導(dǎo)的，使得僅當(dāng)誘導(dǎo)因子存在時(shí)，發(fā)生病毒基因組的全部或部分轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)因子包括但不限于，培養(yǎng)宿主細(xì)胞的一種或多種化合物或者生理?xiàng)l件，如溫度或pH。

在一些實(shí)施方案中，病毒載體包含TAR元件。術(shù)語“TAR”指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R區(qū)的“反式激活反應(yīng)因子”遺傳元件。該元件與慢病毒反式激活因子(tat)遺傳元件相互作用以增強(qiáng)病毒復(fù)制。然而，在5’LTR的U3區(qū)被異源啟動(dòng)子替換的實(shí)施方案中，該元件不是必需的。

“R區(qū)”指逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR內(nèi)的區(qū)域，其開始于加帽基團(tuán)起點(diǎn)處(即，轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn))并結(jié)束于緊接PolyA序列段(tract)的起點(diǎn)之前。R區(qū)也被限定為側(cè)翼為U3和U5區(qū)。在反轉(zhuǎn)錄期間，R區(qū)在允許新生DNA從基因組的一端轉(zhuǎn)移至另一端中發(fā)揮作用。

本文使用的術(shù)語“FLAP元件”指這樣的核酸，其序列包含逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，HIV-1或HIV-2)的中央聚嘌呤序列段和中央終止序列(cPPT和CTS)。合適的FLAP元件描述于美國專利第6,682,907號(hào)和Zennou等人,2000,Cell,101:173。在HIV-1反轉(zhuǎn)錄期間，位于中央聚嘌呤序列段(cPPT)的正鏈DNA的中央起始和在中央終止序列(CTS)處的中央終止導(dǎo)致三鏈DNA結(jié)構(gòu)：HIV-1中央DNA瓣(DNA flap)的形成。雖然不希望被任何理論束縛，DNA瓣可以作為慢病毒基因組核輸入的順式作用決定子發(fā)揮作用和/或可以增加病毒的滴度。在具體實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體骨架在載體中目的異源基因的上游或下游包含一個(gè)或多個(gè)FLAP元件。例如，在具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒包含F(xiàn)LAP元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含分離自HIV-1的FLAP元件。

在一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)移載體包含一個(gè)或多個(gè)輸出元件。術(shù)語“輸出元件”指順式作用轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，其調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄物從細(xì)胞的核至細(xì)胞胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA輸出元件的實(shí)例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev應(yīng)答元件(RRE)(參見例如，Cullen等人,1991.J.Virol.65:1053；和Cullen等人,1991.Cell 58:423)和乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)。通常，RNA輸出元件置于基因的3’UTR內(nèi)，并且可以作為一個(gè)或多個(gè)拷貝插入。

在具體實(shí)施方案中，通過將轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件、高效的聚腺苷酸化位點(diǎn)以及任選地轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)引入載體來增加病毒載體中異源序列的表達(dá)。多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以在蛋白水平增加異源核酸的表達(dá)，例如，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE；Zufferey等人,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)(Huang等人,Mol.Cell.Biol.,5:3864)等(Liu等人,1995,Genes Dev.,9:1766)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含諸如WPRE或HPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體缺乏或者不包含諸如WPRE或HPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，因?yàn)樵谝恍┣闆r下，這些元件增加了細(xì)胞轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)和/或不會(huì)大幅度或顯著增加mRNA轉(zhuǎn)錄本的量或者增加mRNA的穩(wěn)定性。因此，在一些實(shí)施方案中，作為添加的安全度量，本發(fā)明的載體缺乏或者不包含WPRE或HPRE。

引導(dǎo)異源核酸轉(zhuǎn)錄本的有效終止和聚腺苷酸化的元件增加了異源基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)通常存在于聚腺苷酸化信號(hào)的下游。在具體實(shí)施方案中，載體在編碼待表達(dá)多肽的多核苷酸的3’處包含聚腺苷酸化序列。本文使用的術(shù)語“polyA位點(diǎn)”或“polyA序列”表示通過RNA聚合酶II引導(dǎo)新生RNA轉(zhuǎn)錄本終止和聚腺苷酸化的DNA序列。通過將polyA尾巴添加至編碼序列的3’端，聚腺苷酸化序列可以促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性，并且因此有助于翻譯效率的提高。重組轉(zhuǎn)錄本的高效聚腺苷酸化是所希望的，因?yàn)槿狈olyA尾巴的轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定且被快速降解?？梢杂糜诒景l(fā)明的載體中的polyA信號(hào)的示例性實(shí)例包括理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生長激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)或者本領(lǐng)域已知的其它合適的異源或內(nèi)源polyA序列。

在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含與編碼工程化的TCR或CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子。載體可以含有一個(gè)或多個(gè)LTR，其中任一LTR包含一種或多種修飾，如一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或缺失。載體還可以包含增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的多種輔助元件之一(例如，cPPT/FLAP)、病毒包裝信號(hào)(例如，Psi(Ψ)包裝信號(hào)、RRE)和/或增加治療性基因表達(dá)的其它元件(例如，poly(A)序列))，并且可以任選地包含WPRE或HPRE。技術(shù)人員將理解，許多其它不同的實(shí)施方案可以改變自本發(fā)明的既有實(shí)施方案。

“宿主細(xì)胞”包括用本發(fā)明的重組載體或多核苷酸在體內(nèi)、離體或者在體外轉(zhuǎn)染、感染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以包括包裝細(xì)胞、生產(chǎn)細(xì)胞和用病毒載體感染的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，向需要治療的對(duì)象施用用本發(fā)明的病毒載體感染的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“靶細(xì)胞”可與宿主細(xì)胞互換使用，并且指期望的細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染的、感染的或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是T細(xì)胞。

大規(guī)模病毒顆粒的產(chǎn)生通常是達(dá)到合理的病毒滴度所必需的。通過將轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染至包含病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因的包裝細(xì)胞系中產(chǎn)生病毒顆粒，所述病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或者其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。

本文使用的術(shù)語“包裝載體”指缺乏包裝信號(hào)，并包含編碼一種、兩種、三種、四種或者更多種病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因的多核苷酸的表達(dá)載體或病毒載體。通常，包裝載體包含于包裝細(xì)胞中，并經(jīng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染被引入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？梢越?jīng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染將本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒轉(zhuǎn)移載體引入包裝細(xì)胞系，以產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞或細(xì)胞系。可以通過標(biāo)準(zhǔn)的方法將本發(fā)明的包裝載體引入人細(xì)胞或細(xì)胞系，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。在一些實(shí)施方案中，將包裝載體與顯性選擇標(biāo)志物基因一同引入細(xì)胞，隨后在存在合適的藥物的情況下進(jìn)行選擇，并分離克隆，所述顯性選擇標(biāo)記物如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素(blastocidin)、zeocin、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA?？梢岳缤ㄟ^IRES或自切割的病毒肽將選擇標(biāo)志物基因與由包裝載體編碼的基因物理連接。

病毒包膜蛋白(env)決定了最終可被由細(xì)胞系產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的范圍。在慢病毒如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV的情況下，env蛋白包括gp41和gp120。優(yōu)選地，由本發(fā)明的包裝細(xì)胞表達(dá)的病毒env蛋白在與病毒gag和pol基因不同的載體上編碼，正如之前所描述的。

可用于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的env基因的示例性實(shí)例包括但不限于：MLV包膜，10A1包膜，BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉病毒、仙臺(tái)病毒、FPV(雞瘟病毒)和流感病毒的包膜。類似地，可以使用編碼來自RNA病毒(例如，小RNA病毒科、杯狀病毒科(Coronaviridae)、星狀病毒科、披膜病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科、副粘液病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒家族)包膜以及來自DNA病毒(嗜肝DNA病毒科、圓環(huán)病毒科、小DNA病毒科、乳頭多瘤空泡病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科(Poxyiridae)以及虹彩病毒科的家族)包膜的基因。代表性的實(shí)例包括：FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。

在其它實(shí)施方案中，用于假型包裝(pseudotyping)本發(fā)明的病毒的包膜蛋白包括但不限于任何下述病毒的包膜蛋白：A型流感病毒(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感病毒))、B型流感病毒、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、輪狀病毒、諾瓦克病毒組的任何病毒、腸道腺病毒、細(xì)小病毒、登革熱病毒、猴痘病毒、單股負(fù)鏈病毒、狂犬病毒屬(如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文黑基病毒、歐洲蝙蝠病毒1型&2型以及澳大利亞蝙蝠病毒)、暫時(shí)熱病毒屬、水泡病毒屬、水泡性口炎病毒(VSV)、皰疹病毒(如單純皰疹病毒類型1和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人皰疹病毒(HHV)、人皰疹病毒6型和8型)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭瘤病毒、鼠γ皰疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、薩比亞相關(guān)出血熱病毒(Sabia-associated hemorrhagic fever virus)、委內(nèi)瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬丘波病毒)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、布尼亞病毒科(Bunyaviridiae)(如克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、引起腎綜合征出血熱的病毒、裂谷熱病毒)、絲狀病毒科(線狀病毒)(包括埃博拉出血熱病毒和馬爾堡出血熱病毒)、黃病毒科(包括卡薩諾爾森林病病毒、鄂木斯克出血熱病毒、引起蜱傳腦炎的病毒)和副粘液病毒科(如亨德拉病毒和立百病毒)、大天花和小天花(天花)、甲病毒(如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒)、SARS相關(guān)的冠狀病毒(SARS-CoV)、西尼羅病毒、任何引起腦炎的病毒。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用VSV-G糖蛋白假型包裝的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)的包裝細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“假型(pseudotype)”或“假型包裝(pseudotyping)”指病毒包膜蛋白已被具有更優(yōu)特征的其它病毒的包膜蛋白替代的病毒。例如，可用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白對(duì)HIV進(jìn)行假型包裝，這允許HIV感染更廣范圍的細(xì)胞，因?yàn)镠IV包膜蛋白(由env基因編碼)通常使病毒靶向CD4+遞呈細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用VSV-G對(duì)慢病毒包膜蛋白進(jìn)行假型包裝。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用VSV-G包膜糖蛋白進(jìn)行假型包裝的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)的包裝細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“包裝細(xì)胞系”用于指這樣的細(xì)胞系：其不包含包裝信號(hào)，但是穩(wěn)定或者瞬時(shí)表達(dá)病毒顆粒正確包裝所必需的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制酶(例如gag、pol和env)?？蓪⑷魏魏线m的細(xì)胞系用于制備本發(fā)明的包裝細(xì)胞。通常，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生包裝細(xì)胞系的細(xì)胞是人細(xì)胞。可以使用的合適的細(xì)胞系包括，例如，CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、C3H 10T1/2細(xì)胞、FLY細(xì)胞、Psi-2細(xì)胞、BOSC 23細(xì)胞、PA317細(xì)胞、WEHI細(xì)胞、COS細(xì)胞、BSC 1細(xì)胞、BSC 40細(xì)胞、BMT 10細(xì)胞、VERO細(xì)胞、W138細(xì)胞、MRC5細(xì)胞、A549細(xì)胞、HT1080細(xì)胞、293細(xì)胞、293T細(xì)胞、B-50細(xì)胞、3T3細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、W163細(xì)胞、211細(xì)胞以及211A細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，包裝細(xì)胞為293細(xì)胞、293T細(xì)胞或者A549細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“生產(chǎn)細(xì)胞系”指能夠產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的細(xì)胞系，包括包裝細(xì)胞系和包含包裝信號(hào)的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體。感染性病毒顆粒和病毒儲(chǔ)液的產(chǎn)生可以利用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。制備病毒儲(chǔ)液的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113闡明。可以利用常規(guī)技術(shù)從包裝細(xì)胞中收集感染性病毒顆粒。例如，如本領(lǐng)域所知的，可以通過細(xì)胞裂解或者收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液來收集感染性顆粒。任選地，如果需要，可將收集的病毒顆粒進(jìn)行純化。合適的純化技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知。

使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體，通過病毒感染而非轉(zhuǎn)染的手段遞送基因或其它多核苷酸序列被稱為“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過感染和原病毒整合將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，如果靶細(xì)胞(例如T細(xì)胞)包含使用病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過感染被遞送至細(xì)胞的基因或其它多核苷酸序列，則其被“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在其細(xì)胞基因組中包含通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體遞送的一種或多種基因或者其它多核苷酸序列。

在具體實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯糜帽磉_(dá)一種或多種多肽的本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，以治療和/或預(yù)防B細(xì)胞惡性腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案可被使用的涉及病毒載體在基因療法中的應(yīng)用的其它方法可見于，例如Kay,M.A.(1997)Chest 111(6Supp.):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81；Shiratory,Y.等人(1999)Liver 19:265-74；Oka,K.等人(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)Expert Opin.Investig.Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49；以及Lee,H.C.等人(2000)Nature 408:483-8。

H.組合物和制劑

本文所考慮的組合物可以包含如本文所考慮的一種或多種多肽、多核苷酸、包含多核苷酸的載體以及T細(xì)胞組合物。組合物包括但不限于藥物組合物。“藥物組合物”指在藥學(xué)可接受的或生理學(xué)可接受的溶液中配制的組合物，其用于向細(xì)胞或動(dòng)物單獨(dú)施用或者與一種或多種其它治療形式組合施用。也將理解，如果需要，也可將本發(fā)明的組合物與其它物質(zhì)組合施用，所述其它物質(zhì)如例如細(xì)胞因子、生長因子、激素、小分子、化學(xué)治療劑、前藥、藥物、抗體或其它各種藥學(xué)活性劑。對(duì)于也可包含于組合物中的其它組分幾乎無限制，條件是另外的組分不會(huì)不利地影響組合物提供預(yù)期療法的能力。

短語“藥學(xué)可接受的”在本文用來指這樣的化合物、材料、組合物和/或劑型：在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，其適于與人和動(dòng)物的組織接觸使用而無過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或者其它問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比相對(duì)應(yīng)。

本文使用的“藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”包括但不限于已經(jīng)美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)為可接受用于人或家養(yǎng)動(dòng)物的任何佐劑、載體、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、等張劑、溶劑、表面活性劑或者乳化劑。示例性的藥學(xué)可接受的載體包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動(dòng)物和植物油脂、石蠟、硅酮、膨潤土、硅酸、氧化鋅；油類，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，如丙二醇；多元醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；磷酸鹽緩沖液；以及藥學(xué)制劑中采用的任何其它相容的物質(zhì)。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含一定量的由本文所考慮的方法制備的修飾的T細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥學(xué)T細(xì)胞組合物包含具有以下標(biāo)志物中的一種或多種或者全部的強(qiáng)有力的T細(xì)胞：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122和CD127。

通?？梢砸?guī)定，含有由本文所考慮的方法制備的T細(xì)胞的藥物組合物可以以10²至10¹⁰個(gè)細(xì)胞/kg體重、10⁵至10⁹個(gè)細(xì)胞/kg體重、10⁵至10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重、10⁵至10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重、10⁷至10⁹個(gè)細(xì)胞/kg體重或者10⁷至10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量，包括這些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值的劑量施用。細(xì)胞數(shù)將取決于組合物預(yù)期的最終用途以及其內(nèi)將包括的細(xì)胞類型。對(duì)于本文提供的用途，細(xì)胞的體積通常是升或更少，可以是500mL或更少，甚至是250mL或100mL或者更少。因此期望的細(xì)胞的密度通常大于10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，以及通常大于10⁷個(gè)細(xì)胞/ml，通常為10⁸個(gè)細(xì)胞/ml或更大?？梢詫⑴R床相關(guān)數(shù)目的免疫細(xì)胞分配成多次輸注，所述多次輸注累積等于或超過10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面，特別是由于所有的輸注細(xì)胞將被重定向至特定的靶抗原(例如，BCMA)，可以施用范圍為10⁶/千克的較低數(shù)目的細(xì)胞(每例患者10⁶-10¹¹個(gè))?？梢砸赃@些范圍內(nèi)的劑量多次施用被修飾以表達(dá)工程化的TCR或CAR的T細(xì)胞。所述細(xì)胞相對(duì)于經(jīng)歷治療的患者可以是同種異體的、同基因的、異基因的或自體同源的。若需要，治療還可以包括施用如本文所描述的有絲分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、細(xì)胞因子和/或趨化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增強(qiáng)輸注的T細(xì)胞的移植和功能。

通常，包含如本文所述活化或擴(kuò)增的細(xì)胞的組合物可以用于治療和預(yù)防在免疫受損的個(gè)體中發(fā)生的疾病。具體而言，將包含通過本文所考慮的方法制備的修飾T細(xì)胞的組合物用于癌癥的治療。本發(fā)明的修飾的T細(xì)胞可以單獨(dú)施用，或者可以作為與載體、稀釋劑、賦形劑和/或與其它組分(如IL-2、IL-7和/或IL-15)或其它細(xì)胞因子或細(xì)胞群組合的藥物組合物施用。在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的藥物組合物包含一定量的與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合的遺傳修飾的T細(xì)胞。

包含本文所考慮的修飾的T細(xì)胞的藥物組合物還可以包含緩沖劑，如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；以及防腐劑。優(yōu)選地，將本發(fā)明的組合物配制為腸胃外施用，例如血管內(nèi)(靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi))施用、腹膜內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用。

液體藥物組合物，無論其為溶液、懸液或其它類似形式，均可以包含下述中的一種或多種：無菌稀釋劑，如用于注射的水、鹽溶液(優(yōu)選生理鹽水)、林格氏液、等張氯化鈉、固定油(如可作為溶劑或懸浮介質(zhì)的合成的甘油單酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張度的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。可將腸胃外制劑包封在由玻璃或塑料制得的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。可注射的藥物組合物優(yōu)選是無菌的。

在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的組合物包含單獨(dú)地或與一種或多種治療劑組合的有效量的擴(kuò)增的修飾的T細(xì)胞組合物。因此，T細(xì)胞組合物可以單獨(dú)施用或者與其它已知的癌癥療法組合施用，所述其它已知的癌癥療法如放療、化療、移植、免疫療法、激素療法、光動(dòng)力療法等。還可將組合物與抗生素組合施用。在本領(lǐng)域，可以接受此類治療劑作為如本文所述的具體疾病狀態(tài)(如特定的癌癥)的標(biāo)準(zhǔn)治療?？紤]的示例性的治療劑包括細(xì)胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、治療性抗體或者其它活性劑和輔助劑。

在某些實(shí)施方案中，可將包含本文所考慮的T細(xì)胞的組合物與任何數(shù)目的化療劑聯(lián)合施用。化療劑的示例性實(shí)例包括：烴化劑，如噻替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烴基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮雜環(huán)丙烷(aziridine)，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和trimethylolomelamine resume；氮芥類(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽甾醇對(duì)苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌菌素、色霉素、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素、地拖比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲佐菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺類，如氨魯米特、米托坦、曲洛斯坦；葉酸補(bǔ)充物，如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；硝氨丙吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-ethylhydrazide；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；西左喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2、2’,2”-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫衫烷，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫衫醇(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；視黃酸衍生物，如Targretin^TM(蓓薩羅丁)、Panretin^TM(阿利維a酸)；ONTAK^TM(地尼白介素-2(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他濱；以及上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包含調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素藥物，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑類、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。

可將多種其它治療劑與本文所述的組合物聯(lián)合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含T細(xì)胞的組合物與抗炎劑一同施用?？寡讋┗蚩寡姿幇ǖ幌抻冢侯惞檀己吞瞧べ|(zhì)激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍)；非甾類抗炎藥(NSAID)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、來氟米特、抗TNF藥物、環(huán)磷酰胺以及麥考酚酯。

其它示例性NSAID選自布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑(如(羅非昔布)和(塞來考昔))以及唾液酸化劑(sialylate)。示例性的鎮(zhèn)痛藥選自醋氨酚、羥考酮、曲馬朵(tramadol)或鹽酸丙氧吩(proporxyphene hydrochloride)。示例性的糖皮質(zhì)激素選自：可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍或者潑尼松。示例性的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包括針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物(例如，CD4、CD5等)的分子，細(xì)胞因子抑制劑如TNF拮抗劑(例如依那西普阿達(dá)木單抗和英夫利昔單抗)，趨化因子抑制劑和粘附分子抑制劑。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包括單克隆抗體以及重組形式的分子。示例性的DMARD包括咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、Gold(口服(金諾芬)和肌肉內(nèi)施用)以及米諾環(huán)素。。

適于與本文所考慮的CAR修飾的T細(xì)胞組合的治療性抗體的示例性實(shí)例包括但不限于：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿托珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗、阿麥妥昔(amatuximab)、anatumomab、阿西莫單抗、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗、貝伐單抗、比伐單抗(bivatuzumab)、blinatumomab、本妥昔單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他土珠、西妥木單抗(cixutumumab)、clivatuzumab、可那木單抗(conatumumab)、達(dá)雷木單抗(daratumumab)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、杜昔妥單抗(dusigitumab)、地莫單抗(detumomab)、達(dá)西珠單抗(dacetuzumab)、達(dá)妥珠單抗(dalotuzumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠(etaracizumab)、farietuzumab、ficlatuzumab、figitumumab、弗蘭托單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、蓋尼塔單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英達(dá)妥昔單抗(indatuximab)、奧英妥珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、lorvotuzumab、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉圖珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、moxetumomab、納那妥單抗(narnatumab)、那妥莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、諾非單抗(nofetumomab)、ocaratuzumab、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉珠單抗(olaratumab)、奧納珠單抗(onartuzumab)、oportuzumab、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、巴薩妥珠單抗(parsatuzumab)、帕曲土單抗(patritumab)、pemtumomab、帕妥珠單抗(pertuzumab)、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、雷妥莫單抗(racotumomab)、雷得妥單抗(radretumab)、rilotumumab、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、simtuzumab、索利托單抗(solitomab)、他珠單抗(tacatuzumab)、taplitumomab、替妥莫單抗(tenatumomab)、替妥木單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西莫白介素單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、伏司妥珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、CC49以及3F8。

在某些實(shí)施方案中，將本文所述的組合物與細(xì)胞因子聯(lián)合施用。本文使用的“細(xì)胞因子”意為這樣的蛋白的通用術(shù)語：其由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間的介質(zhì)作用于另一細(xì)胞。此類細(xì)胞因子的實(shí)例為淋巴因子、單核因子、趨化因子和常規(guī)的多肽類激素。所述細(xì)胞因子包括：生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白類激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成素(LH)；肝細(xì)胞生長因子(hepatic growth factor)；成纖維細(xì)胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和-β；繆勒管抑制物質(zhì)；鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子，如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子如TNFα或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。本文使用的術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或者來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白，以及天然序列的細(xì)胞因子的生物活性等同物。

I.靶細(xì)胞和抗原

本發(fā)明部分考慮重定向至靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞)并包含工程化的T細(xì)胞受體或CAR的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，所述工程化的T細(xì)胞受體或CAR具有與細(xì)胞上的靶抗原結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。癌細(xì)胞也可通過血液和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至身體的其它部分。存在幾種主要類型的癌癥。惡性上皮腫瘤(Carcinoma)是開始于皮膚或者襯于或覆蓋內(nèi)臟器官的組織的癌癥。肉瘤是開始于骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管或者其它結(jié)締組織或支持性組織的癌癥。白血病是開始于造血組織(如骨髓)，并引起大量異常的血細(xì)胞產(chǎn)生并進(jìn)入血液的癌癥。淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤是開始于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的癌癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥是開始于腦和脊髓的組織的癌癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞表達(dá)在其它正常(期望的)細(xì)胞表面基本上不存在的抗原，例如靶抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胰管細(xì)胞、肝細(xì)胞(hepatic cell)、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、色素細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞(fat cell)、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胰島細(xì)胞、CNS細(xì)胞、PNS細(xì)胞、肝細(xì)胞(liver cell)、脂肪細(xì)胞(adipose cell)、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是下述組織的一部分：胰腺組織、神經(jīng)組織、心臟組織、骨髓、肌肉組織、骨組織、皮膚組織、肝組織、毛囊、血管組織、脂肪組織、肺組織以及腎組織。

在具體實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是癌細(xì)胞，如患有癌癥的患者中的細(xì)胞?？捎帽竟_的方法殺死的示例性的細(xì)胞包括下述腫瘤的細(xì)胞：液體瘤，如白血病，包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病以及成髓細(xì)胞白血病、早幼粒細(xì)胞白血病、粒單核細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)；真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈疾病)。

在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞，所述實(shí)體瘤如肉瘤和惡性上皮腫瘤(carcinoma)、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌(例如胰腺、結(jié)腸、卵巢、肺、乳腺、胃、前列腺、宮頸或食道的腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌(papillary adenocarcinomas)、髓樣癌、支氣管原癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸瘤、膀胱癌、CNS腫瘤(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自：如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥選自：維爾姆斯瘤、尤文肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、皮膚癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、肺癌、膽管癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺髓樣癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為肝臟、胰腺、肺、乳腺、膀胱、腦、骨、甲狀腺、腎、皮膚和造血系統(tǒng)的惡性細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，靶細(xì)胞為肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、甲狀腺癌、腎癌、皮膚癌或者血液癌癥(hematological cancer)中的細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是被病毒感染的細(xì)胞，例如，癌細(xì)胞，所述病毒包括但不限于CMV、HPV和EBV。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶抗原是下述的表位：α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CMV、EBV、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、HPV、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2。

J.治療方法

通過本文所考慮的方法制備的修飾的T細(xì)胞提供改善的過繼免疫療法，用于治療多種病況，所述病況包括但不限于癌癥、感染性疾病、自身免疫病、炎癥性疾病和免疫缺陷。在具體實(shí)施方案中，通過用本文所考慮的工程化的TCR或CAR遺傳修飾初始T細(xì)胞，使初始T細(xì)胞的特異性重定向至腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括這種類型的細(xì)胞療法:其中對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行修飾，以表達(dá)靶向表達(dá)靶抗原的癌細(xì)胞的工程化的TCR或CAR，以及將修飾的T細(xì)胞輸注進(jìn)需要的接受者中。輸注的細(xì)胞能夠殺死接受者中的腫瘤細(xì)胞。與抗體療法不同，工程化的TCR或CAR修飾的T細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，從而有助于可以導(dǎo)致持續(xù)的癌癥治療的長期持續(xù)性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的TCR和CAR T細(xì)胞可以經(jīng)歷穩(wěn)健的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增，并且能夠堅(jiān)持延長的時(shí)間。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的工程化的TCR或CAR T細(xì)胞發(fā)展為能夠再活化以抑制任何其它腫瘤的形成或生長的特異性記憶T細(xì)胞。

在具體實(shí)施方案中，將包含用載體進(jìn)行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于實(shí)體瘤或?qū)嶓w癌的治療，所述載體包含與編碼CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子，所述實(shí)體瘤或?qū)嶓w癌包括但不限于：肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、甲狀腺癌、腎癌或者皮膚癌。

在具體實(shí)施方案中，將包含用載體進(jìn)行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于多種癌癥包括但不限于胰腺癌、膀胱癌和肺癌的治療，所述載體包含與編碼工程化的TCR或CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子，所述工程化的TCR或CAR包含與PSCA或MUC1的表位結(jié)合的抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在具體實(shí)施方案中，將包含用載體進(jìn)行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于液體瘤的治療，所述載體包含與編碼工程化的TCR或CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子，所述液體瘤包括但不限于白血病，包括急性白血病(例如ALL、AML以及成髓細(xì)胞白血病、早幼粒細(xì)胞白血病、粒單核細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(例如CLL、SLL、CML、HCL)；真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥以及重鏈疾病。

在具體實(shí)施方案中，將包含用載體進(jìn)行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于B細(xì)胞惡性腫瘤的治療，所述載體包含與編碼工程化的TCR或CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子，所述B細(xì)胞惡性腫瘤包括但不限于多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)。

多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞的成熟漿細(xì)胞的惡性腫瘤，其形態(tài)學(xué)特征為這些類型的細(xì)胞的單克隆的致瘤性轉(zhuǎn)化。這些漿細(xì)胞在BM中增殖，并且可能侵襲鄰近的骨，以及有時(shí)侵襲血液。多發(fā)性骨髓瘤的變體形式包括：明顯的多發(fā)性骨髓瘤、冒煙型多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細(xì)胞瘤和髓外漿細(xì)胞瘤(參見，例如Braunwald等人(eds),Harrison’s Principles of Internal Medicine，第15版(McGraw-Hill 2001))。

非霍奇金淋巴瘤包含一大組淋巴細(xì)胞(白細(xì)胞)的癌癥。非霍奇金淋巴瘤可以發(fā)生于任何年齡，并且通常具有淋巴結(jié)大于正常淋巴結(jié)、發(fā)熱和體重減輕的特點(diǎn)。存在多種不同類型的非霍奇金淋巴瘤。例如，非霍奇金淋巴瘤可以分為侵略型(生長快速)和惰性型(生長緩慢)。盡管非霍奇金淋巴瘤可以來源于B細(xì)胞和T細(xì)胞，但是本文使用的術(shù)語“非霍奇金淋巴瘤”與“B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤”可互換使用。B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性大細(xì)胞淋巴瘤、前體B淋巴母細(xì)胞淋巴瘤以及套細(xì)胞淋巴瘤。發(fā)生于骨髓或干細(xì)胞移植之后的淋巴瘤通常為B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。

慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)為引起未成熟的白細(xì)胞(稱為B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞)緩慢增加的惰性(生長緩慢)癌癥。癌細(xì)胞經(jīng)血液和骨髓擴(kuò)散，并且也可影響淋巴結(jié)和其它器官，如肝臟和脾臟。CLL最終引起骨髓衰竭。有時(shí)，在疾病晚期，該疾病被稱為小淋巴細(xì)胞淋巴瘤。

在具體實(shí)施方案中，提供方法，所述方法包括將治療有效量的本文所考慮的修飾的T細(xì)胞或者包含本文所考慮的修飾的T細(xì)胞的組合物，單獨(dú)或者與一種或多種治療劑組合施用于需要的患者。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)胞用于治療處于發(fā)展為癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的患者。因此，本發(fā)明提供治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括向需要的對(duì)象施用治療有效量的本發(fā)明的修飾的T細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，治療需要的對(duì)象中的癌癥的方法包括施用有效量(例如治療有效量)的組合物，所述組合物包含本文所考慮的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。施用的量和頻率將由諸如患者的情況以及患者疾病的類型和嚴(yán)重性的因素決定，盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗(yàn)確定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯玫慕M合物中的T細(xì)胞的量為至少0.1x10⁵個(gè)細(xì)胞、至少0.5x10⁵個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁵個(gè)細(xì)胞、至少5x10⁵個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁶個(gè)細(xì)胞、至少0.5x10⁷個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁷個(gè)細(xì)胞、至少0.5x10⁸個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁸個(gè)細(xì)胞、至少0.5x10⁹個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁹個(gè)細(xì)胞、至少2x10⁹個(gè)細(xì)胞、至少3x10⁹個(gè)細(xì)胞、至少4x10⁹個(gè)細(xì)胞、至少5x10⁹個(gè)細(xì)胞或至少1x10¹⁰個(gè)細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯眉s1x10⁷個(gè)CAR T細(xì)胞至約1x10⁹個(gè)CAR T細(xì)胞、約2x10⁷個(gè)CAR T細(xì)胞至約0.9x10⁹個(gè)CAR T細(xì)胞、約3x10⁷個(gè)CAR T細(xì)胞至約0.8x10⁹個(gè)CAR T細(xì)胞、約4x10⁷個(gè)CAR T細(xì)胞至約0.7x10⁹個(gè)CAR T細(xì)胞、約5x10⁷個(gè)CAR T細(xì)胞至約0.6x10⁹個(gè)CAR T細(xì)胞或者約5x10⁷個(gè)CAR T細(xì)胞至約0.5x10⁹個(gè)CAR T細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯玫慕M合物中的T細(xì)胞的量為至少0.1x10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少0.5x10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少1x10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少5x10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少1x10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少0.5x10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少1x10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少0.5x10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少1x10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少0.5x10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少1x10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少2x10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少3x10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少4x10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重、至少5x10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重或至少1x10⁹個(gè)細(xì)胞/kg體重。在具體實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯眉s1x10⁶個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重至約1x10⁸個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重、約2x10⁶個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重至約0.9x10⁸個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重、約3x10⁶個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重至約0.8x10⁸個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重、約4x10⁶個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重至約0.7x10⁸個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重、約5x10⁶個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重至約0.6x10⁸個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重或者約5x10⁶個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重至約0.5x10⁸個(gè)CAR T細(xì)胞/kg體重。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可能需要多次施用本發(fā)明的組合物以實(shí)現(xiàn)期望的療法。例如可以在1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年、5年、10年或更長時(shí)間的時(shí)間跨度內(nèi)施用組合物1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或者更多次。

在某些實(shí)施方案中，下述是可取的：向?qū)ο笫┯没罨腡細(xì)胞，然后隨后再次抽血(或者實(shí)施血漿分離置換法)，根據(jù)本發(fā)明活化由此得到的T細(xì)胞，以及使患者再輸注這些活化并擴(kuò)增的T細(xì)胞?？梢悦扛魩字芏啻螌?shí)施該過程。在某些實(shí)施方案中，可以使來自10cc至400cc血液抽取物的T細(xì)胞活化。在某些實(shí)施方案中，使來自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或者400cc或者更多血液抽取物的T細(xì)胞活化。未受理論束縛，可將該多次抽血/多次再輸注方案用于選出某些T細(xì)胞群。

可以以任何方便的方式進(jìn)行本文所考慮的組合物的施用，包括通過氣霧劑吸入、注射、攝取、輸注、植入或者移植的方式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，腸胃外施用組合物。本文使用的短語“腸胃外施用(parenteral administration)”和“腸胃外施用(administered parenterally)”指不同于腸內(nèi)和局部施用的施用模式，通常通過注射施用，并且包括但不限于：血管內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、囊內(nèi)注射、眶內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射、心臟內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)氣管注射、皮下注射、表皮下注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、囊下注射、蛛網(wǎng)膜下注射、脊柱內(nèi)注射和胸骨內(nèi)注射以及輸注。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過直接注射至腫瘤、淋巴結(jié)或者感染部位將本文所考慮的組合物施用于對(duì)象。

在一個(gè)實(shí)施方案中，向需要的對(duì)象施用有效量的組合物，以增加對(duì)象中針對(duì)癌癥的細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括由能夠殺死感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及輔助性T細(xì)胞的應(yīng)答。也可誘導(dǎo)主要由能夠活化B細(xì)胞從而導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生的輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答?？蓪⒍喾N技術(shù)用于分析由本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型，其在本領(lǐng)域被充分描述：例如，由John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober編著的Current Protocols in Immunology，(2001)John Wiley&Sons,NY,N.Y。

在T細(xì)胞介導(dǎo)的死亡的情況下，CAR配體的結(jié)合起始CAR至T細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致多種T細(xì)胞信號(hào)通路的活化，所述信號(hào)通路誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生或者釋放能夠通過多種機(jī)制誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的蛋白。這些T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)制包括(但不限于)胞內(nèi)細(xì)胞毒性顆粒由T細(xì)胞至靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、T細(xì)胞分泌能夠直接誘導(dǎo)(或者經(jīng)其它殺傷效應(yīng)細(xì)胞的募集間接誘導(dǎo))靶細(xì)胞死亡的促炎性細(xì)胞因子以及T細(xì)胞表面上的死亡受體配體(例如FasL)的上調(diào)，所述死亡受體配體在與靶細(xì)胞上的其同源死亡受體(例如Fas)結(jié)合之后誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療確診患有癌癥的對(duì)象的方法，所述方法包括從所述對(duì)象中移出免疫效應(yīng)細(xì)胞，用包含編碼如本文所考慮的工程化的TCR或CAR的核酸的載體對(duì)所述免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，從而產(chǎn)生修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞群，以及將所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞群施用于所述對(duì)象。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包含T細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)對(duì)象中的靶細(xì)胞群的免疫調(diào)節(jié)物應(yīng)答(immune modulator response)的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯帽磉_(dá)核酸構(gòu)建體的免疫效應(yīng)細(xì)胞群的步驟，所述核酸構(gòu)建體編碼工程化的TCR或CAR分子。

施用本文所述的細(xì)胞組合物的方法包括有效導(dǎo)致再引入離體遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞或者再引入遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞祖細(xì)胞的任何方法，所述離體遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞在對(duì)象中直接表達(dá)工程化的TCR或CAR，所述遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞祖細(xì)胞在被引入對(duì)象時(shí)分化為表達(dá)工程化的TCR或CAR的成熟的免疫效應(yīng)細(xì)胞。一種方法包括用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體離體轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血T細(xì)胞，并使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞返回至所述對(duì)象。

將本說明書中引用的所有出版物、專利申請(qǐng)和授權(quán)專利通過引用并入本文，如同明確且單獨(dú)地指示將各單獨(dú)的出版物、專利申請(qǐng)或者授權(quán)專利通過引用并入。

盡管出于清楚理解的目的，通過示例和實(shí)例的方式一定程度上詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在不脫離所附的權(quán)利要求的精神或范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明作出某些改變和修改，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。僅通過示例性的方式且不通過限制性的方式提供下述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識(shí)別可被改變或修改以得到基本相類似的結(jié)果的多個(gè)非關(guān)鍵參數(shù)。

實(shí)施例

實(shí)施例1

用AKT抑制劑培養(yǎng)的T細(xì)胞的增殖

該實(shí)驗(yàn)的目的是確定Akt抑制劑對(duì)T細(xì)胞增殖的作用。通過測(cè)量T細(xì)胞的分裂來評(píng)估MK-2206(Selleckchem)對(duì)T細(xì)胞增殖的影響。

外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)是含有T細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群。從正常供體獲得PBMC并用熒光染料(Violet,Molecular Probes)進(jìn)行標(biāo)記，其強(qiáng)度隨著每次細(xì)胞分裂被逐步地稀釋兩倍。將標(biāo)記的PBMC用作用于T細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞來源。通過在含有IL-2的培養(yǎng)基(CellGenix)中，用CD3和CD28抗體(Miltenyi Biotec)培養(yǎng)標(biāo)記的PBMC來活化并擴(kuò)增T細(xì)胞。

在第0天，在向T細(xì)胞培養(yǎng)物中添加0.025μM、0.074μM、0.222μM、0.67μM或2.0μM的MK-2206之后，通過用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)CellTrace Violet稀釋液來評(píng)估MK-2206對(duì)細(xì)胞分裂的影響。每兩天至三天，向T細(xì)胞培養(yǎng)物添加新鮮的含有IL-2和MK-2206的基于XVIVO-15的培養(yǎng)基，持續(xù)總共七天，以允許T細(xì)胞的生長和擴(kuò)增。在培養(yǎng)起始之后三天，MK-2206處理未顯著減少T細(xì)胞的分裂(圖1A)。此外，與媒介物或未處理的對(duì)照相比，在存在MK-2206的情況下培養(yǎng)七天的T細(xì)胞在T細(xì)胞分裂方面未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(圖1B)。對(duì)第七天的所有培養(yǎng)物進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)；(將各濃度的MK-2206與0μM MK-2206相比較：培養(yǎng)物在p≤0.05水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)不同)。

實(shí)施例2

用MK-2206處理的T細(xì)胞上CD62L的表達(dá)

該實(shí)驗(yàn)的目的是確定Akt抑制劑對(duì)關(guān)于T細(xì)胞效力的T細(xì)胞標(biāo)志物的作用。通過測(cè)量在實(shí)施例1中制備的T細(xì)胞培養(yǎng)物中CD62L的表達(dá)來評(píng)估MK-2206(Selleckchem)對(duì)T細(xì)胞效力的影響。

小鼠模型顯示，CD62L的表達(dá)鑒定了發(fā)育強(qiáng)有力的T細(xì)胞；在過繼性轉(zhuǎn)移之后具有較強(qiáng)抗腫瘤功效的T細(xì)胞。然而，在體外用IL-2培養(yǎng)的T細(xì)胞顯示CD62L的表達(dá)降低，并且因此與腫瘤特異性T細(xì)胞的抗腫瘤效力的降低相關(guān)聯(lián)。意外地，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)七天之后，且在存在IL-2的情況下，在所測(cè)試的MK-2206的所有濃度下，AKT抑制劑MK-2206顯著增加了CD62L的表達(dá)，圖2。對(duì)第七天的所有培養(yǎng)物進(jìn)行成對(duì)T檢驗(yàn)(將各濃度的MK-2206與0μM MK-2206相比較：*p<.05，**p<.01)。

實(shí)施例3

用Mk-2206或ZSTK474處理的CAR T細(xì)胞上CD62L的表達(dá)

用MK-2206或曲西立濱磷酸酯-TCN(AKT抑制劑)或ZSTK474(PI3K抑制劑)培養(yǎng)CAR T細(xì)胞。在這些實(shí)驗(yàn)組中，使用B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)特異的CAR T細(xì)胞。利用可直接擴(kuò)展為大的臨床制備過程的系統(tǒng)進(jìn)行CAR T細(xì)胞的培養(yǎng)。簡言之，在靜置的燒瓶中，在含有IL-2(CellGenix)以及CD3和CD28特異的抗體(Miltenyi Biotec)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。在培養(yǎng)起始之后一天，添加2x10⁸個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的編碼抗BCMA CAR的慢病毒。通過添加含IL-2和優(yōu)化劑量的抑制劑的新鮮培養(yǎng)基，將抗BCMA CAR T細(xì)胞維持在對(duì)數(shù)期，共培養(yǎng)十天。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，查詢抗BCMA CAR T細(xì)胞的表型。

在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估抗BCMA CAR T細(xì)胞上CD62L的表達(dá)。利用與PE綴合的重組人BCMA-IgG Fc特異性鑒定抗BCMA CAR T細(xì)胞。利用CD62L特異的抗體，用共染色確定CD62L的表達(dá)。與用單獨(dú)的IL-2培養(yǎng)的培養(yǎng)物相比，用IL-2和MK2206培養(yǎng)的來自三個(gè)正常供體的抗BCMA CAR T細(xì)胞具有顯著較高的CD62L表達(dá)。為表達(dá)抗BCMA CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)未減少M(fèi)K2206引起的改善的表型。在培養(yǎng)期間，利用ZST474觀察到了類似的改善，但是用TCN，未觀察到類似的改善，(圖3)。

實(shí)施例4

用Mk-2206或ZSTK474處理的CAR T細(xì)胞顯示改善的治療活性

對(duì)如實(shí)施例3中所描述的用MK-2206、TCN或ZSTK474處理的抗BCMA CAR T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，以評(píng)價(jià)增加的CD62L表達(dá)是否與增加的抗腫瘤活性相關(guān)。在用IL-2以及MK2206、TCN或ZSTK474培養(yǎng)之后，產(chǎn)生表達(dá)抗BCMA CAR的T細(xì)胞。還將等份的CAR T細(xì)胞在補(bǔ)充有之前所說明的劑量的IL-7和IL-15的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以改善CAR T細(xì)胞的治療功效。用相等的CAR T細(xì)胞劑量(1x10⁶個(gè)CAR陽性細(xì)胞)輸注具有100mm³皮下多發(fā)性骨髓瘤腫瘤(RPMI-8226)的動(dòng)物。

用IL-2培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞足以引起完全的腫瘤消退。在該多發(fā)性骨髓瘤動(dòng)物模型中，與用標(biāo)準(zhǔn)的IL-2培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞相比，用IL-7和IL-15、MK-2206或ZST747培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞顯示類似水平的抗腫瘤活性。相比之下，用TCN培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞完全廢除了任何抗腫瘤應(yīng)答。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖4中。

實(shí)施例5

用Mk-2206或ZSTK474處理的CAR T細(xì)胞在侵略性腫瘤模型中顯示改善的治療活性

使用更具侵略性且難以處理的腫瘤模型來確定用IL-2、MK-2206、TCN、ZSTK474、IL7/15或媒介物處理的CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性。Daudi腫瘤細(xì)胞表達(dá)低水平的BCMA蛋白，并且可以使用抗BCMA CAR T細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行有效處理。在用IL-2或IL7/15培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理之后，Daudi腫瘤的進(jìn)展未受影響。顯著地，用MK-2206或ZST474培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞引起完全的腫瘤消退。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖5中。

實(shí)施例6

用Mk-2206或ZSTK474處理的CAR T細(xì)胞顯示改善的持久性

用CAR T細(xì)胞處理的患者的臨床數(shù)據(jù)提示，持久性與目標(biāo)腫瘤應(yīng)答相關(guān)。通過再激發(fā)具有完全消退的小鼠中的腫瘤來評(píng)價(jià)抗BCMA CAR T細(xì)胞的持久性。隨后，用RPMI-8226，在另一側(cè)，對(duì)用IL-2-、MK-2206-或ZSTK474-培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理的100mm³RPMI-8226腫瘤已完全消退的動(dòng)物進(jìn)行再激發(fā)，持續(xù)13天。用IL-2培養(yǎng)的CAR T細(xì)胞處理的動(dòng)物不能阻止腫瘤長出。相反，用ZSTK474培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞處理的動(dòng)物均不具有腫瘤移植的任何跡象。這些數(shù)據(jù)顯示，治療有效的抗BCMA CAR T細(xì)胞在ZSTK474-培養(yǎng)的抗BCMA CAR T細(xì)胞中存留。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖6中。

一般而言，在下述權(quán)利要求中，所使用的術(shù)語不應(yīng)當(dāng)被解釋為將權(quán)利要求限制于說明書和權(quán)利要求中所公開的具體實(shí)施方案，而應(yīng)當(dāng)被解釋為包括所有可能的實(shí)施方案以及此類權(quán)利要求授予的等同物的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開的限制。