發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及生物細胞的檢測、處理和操作領(lǐng)域，且特別是涉及用于哺乳動物卵母細胞或胚胎的玻璃化的系統(tǒng)和方法。

發(fā)明背景

哺乳動物生殖細胞的低溫保存在ivf(體外人工受精)診所中是一項重要的技術(shù)。卵母細胞和胚胎通常被冷凍并保存，以供在稍后的時間使用。經(jīng)受可將其生育力置于風(fēng)險中的治療程序(如化學(xué)療法)的患者，具有保留其卵母細胞以供將來通過ivf技術(shù)使用的選項。此外，受精胚胎往往更需要ivf處理的一個周期。剩下的受精胚胎通常冷凍保存，以供將來使用。

卵母細胞/胚胎低溫保存的技術(shù)分為兩類，緩慢冷凍和快速冷凍(即，玻璃化)。緩慢冷凍是在二十世紀七十年代早期開發(fā)的一種確立的成熟技術(shù)，其利用可編程序列，或控制冷卻速率。玻璃化或快速冷凍是一種更有效的低溫貯藏方法，首次報道于1985年(見w.f.rall和g.m.fahy,“小鼠胚胎于-196℃經(jīng)玻璃化的無冰低溫保存(ice-freecryopreservationofmouseembryosat-196degreescbyvitrification)”,nature,vol.313,no.6003,pp.573-5,1985)。玻璃化被認為優(yōu)于緩慢冷凍，因為在冷凍期間，卵母細胞/胚胎被玻璃化而沒有晶體形成。在玻璃化中加入防凍劑增加胚胎粘度，并使玻璃化胚胎呈糖漿狀。當(dāng)在液氮中直接冷凍卵母細胞/胚胎時，細胞內(nèi)的糖漿狀內(nèi)容物形成無定形冰而不是冰晶，這使得在冷凍期間對細胞的活力損害最小化。

卵母細胞/胚胎玻璃化在ivf診所是手工進行的。操作員通過顯微鏡目鏡觀察并使用微量吸液管操作卵母細胞/胚胎。首先將卵母細胞/胚胎從培養(yǎng)皿中取出并用平衡溶液(es)和一系列玻璃化溶液(vs)洗滌。在每一個步驟中，控制時間已被證明是至關(guān)重要的。在洗滌步驟后，將處理的卵母細胞/胚胎放置到玻璃化吸管上或放置到冷凍-吸液管中。保留在吸管上的卵母細胞/胚胎周圍的溶液體積必須最少，以確保高的冷卻速率。然后將玻璃化吸管插入液氮中以供冷凍和長期低溫保存。存在一些不同的市售玻璃化溶液和方案；然而，核心步驟在很大程度上是相同的。所有方案涉及使用es和vs的多個洗滌步驟，將玻璃化卵母細胞/胚胎放置到玻璃化吸管上，并在液氮中冷凍玻璃化吸管。

針對卵母細胞/胚胎玻璃化的手動操作由于以下理由是一個要求很高但卻乏味的任務(wù)：(1)用高度粘性vs洗滌卵母細胞/胚胎導(dǎo)致細胞滲透壓休克，而滲透壓休克可能是細胞損傷的主要原因；(2)大多數(shù)防凍溶質(zhì)(如，dmso)對卵母細胞/胚胎是有毒的。因此，在有毒的vs中的洗滌時間是至關(guān)重要的，但可能難以嚴格控制；(3)由于卵母細胞/胚胎的小尺寸(約150μm)，它們可能難以檢測和操作，尤其是當(dāng)圍繞細胞的介質(zhì)在微量吸液管抽吸和分發(fā)期間動態(tài)變化時；(4)手動過程具有嚴格的技術(shù)要求，而成功率和細胞存活率會因不同的操作員而變化。

heo等開發(fā)了一種微流體平臺以控制用于卵母細胞低溫保存的防凍劑的加載(見y.heo,h.lee,b.hassell,etal.,“在微流體平臺上防凍劑(cpas)以線性和復(fù)雜的cpa特性對卵母細胞的控制加載(controlledloadingofcryoprotectants(cpas)tooocytewithlinearandcomplexcpaprofilesonamicrofluidicplatform)”,labonachip,vol.11,no.20,pp.3530-7,2011)。當(dāng)卵母細胞/胚胎“停泊”在微流體平臺的一個位置時，卵母細胞/胚胎的一側(cè)直接面向玻璃化溶液，而另一側(cè)則不如此。因此，卵母細胞/胚胎不如在標準手動方案中那樣均勻地暴露于vs。在實踐中，在容器或預(yù)設(shè)的位置停泊胚胎，在vs中洗滌后，對于取回胚胎可能帶來顯著的困難。將卵母細胞/胚胎施加于vs的時間設(shè)置是至關(guān)重要的，因為在vs中的防凍劑可強加給胚胎有毒的影響，如果它們不能及時取回的話。

geneabiomedxinc.開發(fā)了一種用于卵母細胞/胚胎玻璃化的自動化器械(美國專利申請公布號2013/0137080)。genea系統(tǒng)需要用戶手動轉(zhuǎn)移卵母細胞/胚胎至稱為“豆莢(pods)”的陣列孔中，每孔一個卵母細胞/胚胎。在ivf診所使用的本玻璃化方案中，卵母細胞/胚胎被移進和移出不同的玻璃化溶液。不同地，genea系統(tǒng)中的卵母細胞/胚胎保持在孔中，而玻璃化溶液被分發(fā)到各孔中及從各孔中吸出。由于卵母細胞/胚胎總是位于孔底，與孔底接觸的細胞表面不能如在細胞表面的其余部分那樣均勻地暴露于玻璃化溶液。而且，genea系統(tǒng)基于體積控制來分發(fā)和抽吸液體，而不監(jiān)測細胞位置；因此，該技術(shù)不能滿足最小的體積需要以實現(xiàn)高的冷卻速率。

類似于geneabiomedx的自動玻璃化系統(tǒng)，samuels.kim等的專利申請公布號wo2013020032、fredburbank等的us2011/0207112，和amirarav的wo2013098825也公開了將卵母細胞/胚胎停泊在預(yù)設(shè)位置并改變vs的方法。samuels.kim等的wo2013020032描述了一種自動化裝置，其包含防凍劑儲存器、防凍劑分配器，和經(jīng)定位以允許樣本與來自所述防凍劑分配器的防凍劑接觸的樣本儲存器。在這種裝置中，卵母細胞或胚胎在整個程序過程被保持在樣本儲存器(如，電子顯微鏡網(wǎng)格)中，同時vs被分發(fā)和排出以供洗滌樣本。

在fredburbank等的美國專利申請公布號2011/0207112中，一個或多個卵母細胞或胚胎被定位在處理容器中，處理容器被配置為允許流體流入和流出處理容器，其中兩種或更多種流體流入和流出容器。

amirarav的wo2013098825公開一種包括引流區(qū)和毛細管引流元件的裝置。引流區(qū)被配置為容納生殖生物樣本。毛細管引流元件，其開口在引流區(qū)內(nèi)，被配置為從引流區(qū)排出液體，同時生殖細胞部分的生殖細胞成分保留在引流區(qū)中。

與將玻璃化卵母細胞/胚胎放置在吸管-樣載體的目前使用的玻璃化方案不同，fuliangdu等的美國專利公布號2013/0157362、xiangzhongyang等的2002/0009704，和utkandemirci等的2012/0251999公開了生成包含生物樣本的vss的微米/納米液滴，和直接在液氮中冷凍液滴的方法。

miltonchin在美國專利申請公布號2009/0186405和2009/0123996中公開了為提高在液氮中的冷卻率并實現(xiàn)在液氮中貯藏玻璃化樣本的自-密封功能的裝置設(shè)計。

ru等在中國專利申請公布號202918907u中公開了用于胚胎玻璃化的半-自動系統(tǒng)。該系統(tǒng)需要手動輸入幾個關(guān)鍵步驟進行胚胎拾起并定位(pick-and-place)。在第0056段落中，系統(tǒng)需要操作員通過從顯微鏡觀察，獲得微量吸液管頂端的位置，并將位置信息輸入計算機。類似的人工輸入是必需的(見第0062、0070和0072段)。自動化部分僅是使用機器人的機械手去拾起一個胚胎，移動到預(yù)設(shè)的位置，并將胚胎放入玻璃化溶液中。沒有計算機視覺算法來自動檢測胚胎和微量吸液管尖端。而且，使用機器人系統(tǒng)的單一細胞拾起并定位的技術(shù)是公開的知識，例如由z.lu,c.moraes,g.ye,c.a.simmons，和y.sun在“使用機器人系統(tǒng)的單一細胞沉積和模式(singlecelldepositionandpatterningwitharoboticsystem)”,plosone,vol.5,e13542,2010中公開。此外，在cn202918907u中公開的系統(tǒng)只能使用特定的cryotip^?方法操作(見第0086段)，其對于通用應(yīng)用是有限的。不在玻璃化溶液中洗滌胚胎，該系統(tǒng)不能用于需要洗滌胚胎至少一次的其它方案(如，kitazato的cryotop方法，和irvine玻璃化方案)。

需要的是自動玻璃化系統(tǒng)，其設(shè)計為用玻璃化處理溶液自動處理卵母細胞/胚胎和其它細胞類型，將玻璃化卵母細胞/胚胎自動放置于玻璃化裝置(如，cryotop、cryotip^?、cryoloop等)，從在裝置上的玻璃化卵母細胞/胚胎除去過多的介質(zhì)，在密封機上用蓋自動密封玻璃化裝置，并在自動液氮儲罐/系統(tǒng)中冷凍。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在此提供一種用于自動化低溫保存和解凍生物材料，例如細胞、卵母細胞和胚胎的系統(tǒng)。在一個實施方案中，自動化系統(tǒng)包括(a)載板，其具有(i)容納或加載生物材料的區(qū)域，(ii)容納處理溶液的多孔區(qū)，和(iii)容納一個或多個玻璃化吸管的吸管區(qū)；(b)連接于操作生物材料和處理溶液的機械手的第一機器人或機器人機械手；(c)操作玻璃化吸管的第二機器人或機器人機械手；(d)顯微鏡和可操作地連接于顯微鏡以捕獲生物材料的圖像的圖像捕獲裝置、機械手和吸管；(e)具有可執(zhí)行的指令的計算機可讀介質(zhì)；和(f)執(zhí)行計算機可讀介質(zhì)的可執(zhí)行指令的處理器；所述可執(zhí)行指令包括以下自動化的指令：(i)處理捕獲的圖像，和(ii)可操作地控制顯微鏡、圖像捕獲裝置、第一機器人，和第二機器人。

根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案的一個方面，所述系統(tǒng)還包括吸管-密封機和自動低溫貯藏裝置，和可執(zhí)行指令包括自動化控制吸管-密封機和自動低溫貯藏裝置的指令。

根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的另一方面，可執(zhí)行指令還包括以下指令：(i)當(dāng)生物材料是細胞、胚胎或卵母細胞時，從捕獲的圖像檢測處于不同發(fā)育階段的細胞、胚胎或卵母細胞；(ii)跟蹤三維空間中的生物材料；(iii)監(jiān)測生物材料的體積；(iv)生成處理溶液的濃度梯度；(v)將生物材料置于吸管上；和(vi)從置于吸管上的生物材料除去過多的處理溶液。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，顯微鏡與包括用于改變放大倍率和焦距的驅(qū)動器的控制器通信連通。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，顯微鏡包括用于接受載板的x-y載物臺，x-y載物臺包括x-軸線性移動系統(tǒng)和y-軸線性移動系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個方面，可執(zhí)行指令包括可操作地控制x-y載物臺的指令。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，顯微鏡與包括x和y軸線性移動系統(tǒng)的每一個的驅(qū)動器的控制器通信連通。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，x-軸線性移動系統(tǒng)和y-軸線性移動系統(tǒng)是獨立可控的。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，載板與加熱板集成為一體以使載板的生物材料容納區(qū)維持適當(dāng)?shù)臏囟?例如約37℃)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，機械手是具有適合于操作生物材料的尖端直徑(例如約100-200微米)的微量吸液管。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管連接于微量吸液管儲存器，并連接于電動注射器。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，將微量吸液管以尖端側(cè)朝下的傾斜角度置于x-z平面(即，垂直于y軸)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)還包括與包括控制線性移動的驅(qū)動器的控制器通信連通的電動注射器，和可執(zhí)行的指令包括自動控制電動注射器的指令。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管儲存器連接于第一機器人機械手。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，第一機器人機械手具有沿著x、y和z的至少三個自由度。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，第一機器人機械手與包括用于x、y和z軸線性移動系統(tǒng)的每一個的驅(qū)動器的控制器通信連通。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，以每秒30幀或更高的幀速率，從顯微鏡和圖像捕獲裝置捕獲實時圖像，以提供具有連續(xù)的視覺信息的系統(tǒng)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，當(dāng)生物材料是胚胎時，系統(tǒng)能夠從捕獲的圖像自動檢測在不同發(fā)育階段的胚胎(如，2-細胞、4-細胞，和胚泡)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)還包括生物材料檢測算法。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)能夠通過最大化聚焦測量，自動對焦于對象。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，生物材料檢測算法還包括自適應(yīng)閾值算法以使灰度圖像二值化。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，生物材料檢測算法還檢測二值化圖像中的所有對象的輪廓。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，具有在特定范圍內(nèi)的輪廓區(qū)域的對象被視為潛在的生物材料目標。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，為了避免錯誤的檢測，潛在的生物材料目標的輪廓通過使用霍夫變換算法(houghtransformalgorithm)進一步擬合圓，且圓的中心點被認為是生物材料位置。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)能夠從捕獲的圖像自動檢測微量吸液管尖端。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管尖端檢測算法還包括兩個沿著x和y軸的索貝爾過濾器(sobelfilters)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，沿著y-軸的索貝爾過濾器被用來確定微量吸液管的外壁，而沿著x-軸的sobel被用來確定尖端位置。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管的外壁通過使用霍夫線性變換算法(houghlinetransformalgorithm)進一步檢測。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，當(dāng)生物材料被抽吸到微量吸液管中時，微量吸液管尖端的外壁被用來確定用于生物材料檢測的感興趣的區(qū)域(roi)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管尖端和生物材料之間沿著z軸的相對距離通過一種接觸檢測算法確定，該檢測算法基于當(dāng)微量吸液管尖端接觸容納生物材料的基層(例如培養(yǎng)皿)時檢測水平滑行移動。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，機器人機械手經(jīng)由閉環(huán)視覺伺服控制，將微量吸液管尖端移近目標生物材料。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，電動注射器被用來在尖端移近生物材料后，生成將目標生物材料抽吸到微量吸液管尖端中的負壓。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，電動注射器也被用來生成將目標生物材料從微量吸液管尖端分發(fā)到所需位置的正壓。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，計算機視覺算法被用來檢測生物材料在微量吸液管內(nèi)的位置。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，通過控制電動注射器，將生物材料經(jīng)由閉環(huán)視覺伺服控制，精確定位于微量吸液管內(nèi)的所需位置。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，生物材料自動從一個位置移動到另一個位置(如，從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到多-孔板)。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，通過重復(fù)生物材料抽吸和分發(fā)，在玻璃化溶液中自動洗滌生物材料。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，當(dāng)生物材料從es轉(zhuǎn)移到vs時，系統(tǒng)能夠自動跟蹤在3d空間中的生物材料。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)能夠通過按坐標移動微量吸液管尖端并分發(fā)低濃度的es，自動生成在vs中的濃度梯度。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)能夠自動監(jiān)測生物材料的體積的實時變化，以提供在不同類型的溶液中優(yōu)化洗滌時間的一個標準。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，玻璃化生物材料當(dāng)它達到最小體積時，經(jīng)由微量吸液管抽吸從vs自動取出。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，生物材料在vs中洗滌后被自動放置在玻璃化吸管上。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，玻璃化吸管位置經(jīng)計算機視覺算法自動檢測。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，玻璃化吸管檢測還包括霍夫線性變換算法，以檢測吸管的兩個水平邊緣。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管尖端和玻璃化吸管之間的垂直距離通過接觸檢測來檢測，該檢測基于由微量吸液管尖端的接觸引起的玻璃化吸管尖端偏差移動。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，微量吸液管尖端自動移到玻璃化吸管的中心并接觸吸管表面。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，玻璃化生物材料通過控制電動注射器施加正壓被分發(fā)到吸管上。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，生物材料周圍的過多的介質(zhì)通過微量吸液管在離開分發(fā)生物材料的位置的距離(如，300微米)的位置被自動抽吸掉。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，當(dāng)在吸管上的生物材料液滴體積沒有進一步的變化時，過多的介質(zhì)的抽吸會自動停止。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，在尖端上具有玻璃化生物材料的玻璃化吸管由機器人從載板拾起。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，機器人將在尖端上具有玻璃化生物材料的玻璃化吸管插入子容器的液氮中以供快速冷凍。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，玻璃化吸管在冷凍后被放置在密封機的滑動部分上。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，預(yù)加載了玻璃化吸管蓋的密封機，通過移動滑行部分給吸管加蓋。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，將用蓋密封的玻璃化吸管插入含有液氮的子容器的孔中。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，子容器自動轉(zhuǎn)移到自動液氮貯藏系統(tǒng)以供長期低溫保存。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，洗滌溶液類型和浸泡時間可容易地通過系統(tǒng)的軟件界面，根據(jù)不同的玻璃化試劑盒和方案指定。

根據(jù)這個實施方案的另一方面，系統(tǒng)能夠用節(jié)省總的處理時間的優(yōu)化程序處理多個生物材料。

本發(fā)明的實施方案也提供使用本發(fā)明的系統(tǒng)，低溫保存和解凍生物材料，特別是卵母細胞、胚胎，和其它細胞材料的自動方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，處理生物材料的方法包括，(a)將生物材料自動(即不是人類操作員協(xié)助)和均勻地暴露于一系列玻璃化處理溶液，從而獲得玻璃化生物材料，(b)自動放置玻璃化生物材料在玻璃化吸管的表面，(c)將攜帶玻璃化生物材料的玻璃化吸管自動浸漬或插入低溫保存溶液中，(d)自動密封攜帶玻璃化生物材料的玻璃化吸管，(e)自動貯藏密封的玻璃化吸管于低溫保存溶液中，從而冷凍含有玻璃化生物材料的玻璃化吸管，以供長期低溫保存。

在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，該方法還包括從低溫保存溶液自動取回冷凍的密封玻璃化吸管，并將冷凍玻璃化生物材料自動和均勻地暴露于一系列處理溶液，從而解凍生物材料。

附圖簡述

以下各圖舉例說明本發(fā)明的各個方面和優(yōu)選和備選的實施方案。

圖1說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的自動機器人玻璃化系統(tǒng)。

圖2說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的承載胚胎培養(yǎng)皿、多-孔板，和多個玻璃化吸管的載板的頂視圖。

圖3是圖示說明玻璃化和解凍過程的實施例方案的圖。es：平衡溶液，vs：玻璃化溶液，ts：解凍溶液，ds：稀釋溶液，ws：洗滌溶液。

圖4是圖示說明本發(fā)明的機器人系統(tǒng)的平行玻璃化的實施例進度表的圖。在該實施例中，處理時間按照得自kitazatocompany的方案(kitazatoinc.,cryotopsafetykitprotocol,2014)。

圖5是顯示通過使用在圖像中包含的對象的面積和形狀信息，用于微量吸液管檢測的實施例算法的圖像。(a)矩形是檢測結(jié)果。(b)二值化的圖像顯示檢測的前景對象。(c)輪廓圖像顯示微量吸液管形狀：霍夫線性變換被應(yīng)用于拒絕微量吸液管的虛假檢測。

圖6是圖示說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，確定微量吸液管的z位置的接觸檢測算法的圖。(a)圖示說明微量吸液管尖端當(dāng)接觸胚胎培養(yǎng)皿基層時，產(chǎn)生水平滑行移動的前視圖。微量吸液管相對于培養(yǎng)皿底的z位置通過檢測這種水平滑行移動來確定。(b)顯示微量吸液管尖端當(dāng)接觸吸管尖端表面時使玻璃化吸管尖端變形的前視圖。微量吸液管尖端相對于玻璃化吸管尖端的z位置通過檢測吸管尖端的變形確定。

圖7是圖示說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用于胚胎檢測的實施例方法的圖。(a)圈顯示檢測結(jié)果。(b)二值化的圖像顯示檢測的前景對象。(c)輪廓圖像顯示形狀信息：霍夫圓變換被應(yīng)用于將圈擬合于潛在的胚胎目標，以避免錯誤的檢測。

圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，將胚胎定位于微量吸液管內(nèi)的控制圖。

圖9是圖示說明當(dāng)系統(tǒng)將胚胎從玻璃化溶液1(vs1)轉(zhuǎn)移至vs2時，生成濃度梯度的實施例方法的圖。

圖10是圖示說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在將胚胎放置于玻璃化吸管尖端后，自動除去過多的介質(zhì)的圖像。(a)將含有胚胎的相對較大的介質(zhì)沉積在吸管表面。(b)通過機器人拖動微量吸液管尖端至左邊，在吸管表面上形成介質(zhì)的薄膜。(c)通過施加負壓，自動抽吸掉將過多的介質(zhì)。胚胎由于摩擦力停留在初始的位置。

圖11示意顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，將蓋置于玻璃化吸管的吸管蓋密封機的實例。

圖12是圖示說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的自動液氮貯藏系統(tǒng)的實施例設(shè)計的圖。

圖13說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用于玻璃化樣本貯藏的具有孔的液氮子容器的實施例設(shè)計：左區(qū)具有冷凍玻璃化吸管的開放空間，而右區(qū)具有許多用于貯藏冷凍樣本的孔。蓋子可放置于子容器上以保持玻璃化吸管在正確的位置。

發(fā)明詳述

定義

除非另外定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。而且，除非另外指明，除了在權(quán)利要求書內(nèi)，“或”的使用包括“和”，并且反之亦然。非限制性術(shù)語不應(yīng)視為限制，除非明確地聲明或文中另外清楚地指明(例如“包括”、“具有”和“包含”通常表示“包括但不限制”)。權(quán)利要求書中包括的單數(shù)形式例如“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非另外清楚地指明。引用的所有文件通過引用以其全文結(jié)合到本文中。為幫助理解和準備本發(fā)明，提供以下示例性的、非限制性實例。

如本文所用的“自動的/自動化”意指無操作人員的控制(例如手動和/或基于操縱桿的控制(joy-stickbasedcontrol))或其中人工干預(yù)僅限于鍵入輸入數(shù)據(jù)。軟件(圖像處理和移動控制)和硬件被集成在計算機機器內(nèi)以減少或消除操作員的干預(yù)。

如本文所用的“電動的”意指裝置例如定位裝置、注射器等配備有經(jīng)由控制算法和策略控制的一個或多個馬達。

概述

本發(fā)明涉及硬件元件和計算機視覺算法以使玻璃化過程自動化，包括全自動化。本發(fā)明可被用來實施玻璃化試劑盒/方案。例如，kitazato的試劑盒/方案(kitazatoinc.,cryotopsafetykitprotocol,2014)和origio玻璃化方案(origiomedicultmedia,medicultvitrificationcoolingprotocol,2014)可在本發(fā)明的機器人系統(tǒng)中，通過簡單改變卵母細胞/胚胎在玻璃化溶液中的洗滌時間進行。

本發(fā)明的機器人系統(tǒng)被設(shè)計為全自動化的，包括自動生物材料加載和取回。系統(tǒng)監(jiān)控單個細胞在玻璃化溶液(vs)中的反應(yīng)，以確定在vs中的最適洗滌時間。在vs中洗滌細胞后，玻璃化胚胎自動放置于玻璃化吸管上。然后于蓋-密封機上用蓋密封吸管。拾起密封的吸管并在低溫保存子容器，例如液氮子容器中冷凍。最后將含有冷凍玻璃化吸管的子容器放置于自動液氮系統(tǒng)中以供長期低溫保存。機器人系統(tǒng)以優(yōu)化的并行方式執(zhí)行任務(wù)，以處理多個細胞或細胞系。該系統(tǒng)也允許用戶容易地指定每一步驟的操作時間，以實現(xiàn)不同的玻璃化方案或開發(fā)新的方案。

a.自動玻璃化系統(tǒng)

本發(fā)明的實施方案涉及包括在兩條軸上可移動的、用于在x-y平面上移動樣本的電動x-y載物臺顯微鏡，用于捕獲圖像的照相機，用于定位機械手、例如微量吸液管的機器人，用于抽吸和分發(fā)胚胎/卵母細胞/細胞(生物材料)的與微量吸液管連接的電動注射器，用于容納生物材料培養(yǎng)皿的載板，用于容納處理溶液、例如玻璃化和解凍溶液和多個玻璃化吸管的多-孔板，用于處理玻璃化吸管的第二機器人，和用于長期低溫保存玻璃化樣本的自動液氮貯藏系統(tǒng)的系統(tǒng)。本章節(jié)描述了硬件系統(tǒng)、系統(tǒng)工作流程，和技術(shù)細節(jié)的實施方案。

玻璃化吸管可被描述為容納胚胎，以供在例如液氮中冷凍和低溫保存的物理載體。玻璃化吸管可分類為3類：基于開放的條狀吸管(如，cryotop)、基于微量吸液管的吸管(如，cryopipette)，和基于cpa(防凍劑)膜的吸管(如，cryoloop)。基于開放的條狀吸管通常由一個附接到硬塑料把柄的聚丙烯條桿組成。將玻璃化胚胎直接放置在所述條桿上面。將胚胎放置在條桿上之后，用塑料蓋密封吸管以避免在長期低溫保存中的污染?；谖⒘课汗艿奈苁褂弥苯映槲ＡЩ咛サ奈⒘课汗?。在玻璃化胚胎被抽吸進微量吸液管后，微量吸液管的開口用熱封機密封?；赾pa膜的吸管，例如cryoloop，包括一個可經(jīng)由不銹鋼棒集成到冷凍管的蓋子的塑料環(huán)。在玻璃化期間，將cyroloop^t浸入防凍液中以在環(huán)內(nèi)創(chuàng)立溶液薄膜。然后將玻璃化胚胎轉(zhuǎn)移至膜中并密封冷凍管。在本文中，術(shù)語“玻璃化吸管”指所有3個分類組。在所有的玻璃化吸管中，cryotop是被廣泛接受的方法，因為它涉及最少的圍繞玻璃化胚胎的殘余溶液，以供產(chǎn)生最高的冷卻速率和最高的解凍后細胞存活率。因此，cryotop被用作解釋本發(fā)明的實例。

在一個實施方案中，參考圖1，本發(fā)明的玻璃化系統(tǒng)1可包括可配備有電動放大和電動聚焦功能的顯微鏡100。xy電動載物臺200可固定在顯微鏡上或連接于顯微鏡。自定義設(shè)計的載板300與加熱板400可放置在xy載物臺200上。如在本文下面進一步描述和在圖2中說明的，載板300可被配置為容納生物材料培養(yǎng)皿301，含有生物材料處理溶液的多-孔板302，和多個玻璃化吸管303。第一機器人501或攜帶微量吸液管的機器人機械手510可被用來操作可被容納在培養(yǎng)皿301中的生物材料例如卵母細胞/胚胎/細胞?？煽刂齐妱幼⑸淦?00以抽吸或分發(fā)生物材料進出微量吸液管510。照相機700可耦合至或連接至顯微鏡100，以提供可被用來實現(xiàn)基于視覺的機器人控制的視覺反饋。照相機700可以每秒30幀或更高的幀速率執(zhí)行，以提供具有連續(xù)的視覺信息的系統(tǒng)。第二機器人502可被用來操作玻璃化吸管以在液氮中冷凍。作為系統(tǒng)1的部分，吸管-密封機800，其也可經(jīng)自定義設(shè)計，可被用來用蓋密封玻璃化吸管。此外，液氮(或其它低溫保存溶液)子容器901可被設(shè)計以攜帶冷凍玻璃化吸管并貯藏在自動液氮貯藏系統(tǒng)902中。系統(tǒng)1也可包括一臺具有當(dāng)執(zhí)行時經(jīng)由運行自定義開發(fā)的控制軟件控制所有的前述硬件和功能的指令的中心計算機50。

圖1中所示的系統(tǒng)1可包括正置顯微鏡100。顯微鏡100可包括電動x-y載物臺200。載物臺200可具有厘米級的移行范圍和沿著每一條軸優(yōu)于1μm的分辨率。顯微鏡100可具有一系列的放大倍率(如，0.7×-11.5×)，其可由系統(tǒng)控制程序自動改變。此外，顯微鏡的焦距也可通過系統(tǒng)自動化地經(jīng)由自-聚焦算法而變化。

如圖2中所示的，載板300可包括任何數(shù)目的工作區(qū)，例如3個工作區(qū)：生物材料加載區(qū)301、生物材料處理(即洗滌、平衡、玻璃化、解凍等)區(qū)302，和玻璃化吸管區(qū)304。生物材料加載區(qū)301可用于容納標準生物材料培養(yǎng)皿(如，35mmpetri培養(yǎng)皿)。生物材料處理區(qū)302用于容納可包括處理溶液例如平衡溶液(es)、玻璃化溶液(vs)、洗滌溶液、解凍溶液的多-孔板，其可用來洗滌/浸泡生物材料。玻璃化吸管區(qū)304可包括用于容納玻璃化吸管303的多個孔。具有多于或少于3個工作區(qū)的載板也是可能的。

在培養(yǎng)皿301中的生物材料，例如胚胎、卵母細胞或細胞可通過使用機械手，例如微量吸液管510來操作。微量吸液管可具有適合于抽吸或分發(fā)生物材料的尖端直徑。在胚胎的情況下，微量吸液管可具有在約100-200微米范圍內(nèi)的尖端直徑。微量吸液管可被插入連接于電動注射器600的微量吸液管儲存器511中。微量吸液管儲存器511被夾持到機器人機械手501，其具有厘米級的移行范圍和沿著每一條軸優(yōu)于1μm的分辨率。

在載板300上處理生物材料(即，用一系列vs洗滌生物材料，然后將生物材料放置在玻璃化吸管上)后，在頂部具有玻璃化生物材料的玻璃化吸管303可被將吸管插入或浸漬到子容器901的液氮中，以供快速冷凍的第二機器人502拾起。然后可通過機器人將冷凍玻璃化吸管放置在蓋-密封機800上，以供用塑料蓋密封玻璃化吸管。密封的吸管可最終被插入子容器的貯藏孔中，而子容器被機器人502轉(zhuǎn)移至自動液氮貯藏系統(tǒng)902中。

機器人501和502可以是多個自由度的機器人。在一個實施方案中，機器人501和502可具有至少三個自由度。一個機器人可用來定位微量吸液管以拾起和放置細胞和溶液，而其它機器人可被用來處理玻璃化吸管。

參考圖11，吸管-密封機800可包括固定部分801和移動部分802。固定部分801可包括從固定部分801的一端延伸的肩部803。移動部分802可被配置為在固定部分801的上表面朝向肩部803滑動。在本發(fā)明的一個實施方案中，肩部803可被配置用于接受和容納吸管蓋305。移動部分802可被配置以接受和容納玻璃化-型吸管303。在這種情況下，移動部分802的滑行移動將導(dǎo)致玻璃化吸管303滑入蓋305并密封玻璃化吸管(見圖11(a)和11(b))。在另一個實施方案中，肩部803可接受和容納吸管，而移動部分802可接受和容納蓋，以致于所述蓋朝向吸管移動，從而密封它。

b.自動化胚胎玻璃化工作流程

下述的玻璃化工作流程通過使用作為一個實例的kitazato玻璃化方案的實施來解釋。本發(fā)明的系統(tǒng)也可能夠自動執(zhí)行其它方案，例如執(zhí)行origio玻璃化方案。圖3圖示地顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的自動化生物材料玻璃化方法的主要步驟。該實施例涉及到胚胎，然而應(yīng)該理解，該系統(tǒng)也能夠自動化處理其它類型的生物材料，例如卵母細胞和任何其它生物細胞。在以下實例中，微量吸液管的尖端顯示指向右邊方向。因此，相對于微量吸液管的尖端方向使用術(shù)語“左”和“右”。應(yīng)該理解，系統(tǒng)可能被逆轉(zhuǎn)并使微量吸液管的尖端指向左邊的方向。下述和圖3中所示的實施例過程，參考圖1，可作為機器-可訪問的指令，利用任何不同的存儲在計算機50中的編程代碼執(zhí)行。

步驟0.系統(tǒng)設(shè)置和準備

建立步驟是可包括可涉及操作員的子步驟的唯一步驟。該方法的所有其它步驟是全自動化的。

(a)在開動時，系統(tǒng)1自動移動x-y載物臺至原位置(即，右下角)并打開加熱板。

(b)將胚胎培養(yǎng)皿從孵箱取出并放置于載板300上的胚胎加載區(qū)。培養(yǎng)介質(zhì)可用礦物油覆蓋以防止蒸發(fā)，用于維持恒定的ph。

(c)根據(jù)由玻璃化試劑盒供應(yīng)商提供的方案，將es(平衡溶液)和vs(玻璃化溶液)加入到多-孔板302中。

(d)將玻璃化吸管303放置在載板300的吸管孔304中。

步驟1.從培養(yǎng)皿中自動拾起胚胎

(a)使系統(tǒng)將胚胎加載區(qū)定位進入顯微鏡100下的視野(fov)。

(b)進行自動對焦以聚焦于胚胎。

(c)從捕獲的圖像檢測胚胎。

(d)檢測微量吸液管510尖端并使它定位于顯微鏡下的fov的中心。

(e)通過向培養(yǎng)皿底降低微量吸液管，檢測尖端對培養(yǎng)皿基層的接觸。

(f)通過閉環(huán)視覺伺服控制，經(jīng)移動x-y載物臺200，將目標胚胎移近微量吸液管尖端位置。

(g)將胚胎抽吸進微量吸液管并通過控制電動注射器，使它定位于微量吸液管內(nèi)的所需位置。

(h)在培養(yǎng)皿底表面上方向上移動微量吸液管(如，3000μm)，并移動x-y載物臺至多-孔板302的es區(qū)。

步驟2.在es中自動洗滌胚胎

(a)系統(tǒng)1進行自動對焦以聚焦于多-孔培養(yǎng)皿區(qū)302上的es區(qū)底部。

(b)降低微量吸液管直至檢測到與es區(qū)底部接觸。

(c)通過從電動注射器施加正壓，將胚胎分發(fā)至es中。

(d)通過重復(fù)微量吸液管抽吸和分發(fā)，將胚胎洗滌數(shù)次。

(e)將胚胎保持在es中適當(dāng)?shù)臅r間段(如，按kitazato方案為12min)。胚胎縮小至最小體積，然后逐漸地恢復(fù)到其最初體積，這表明平衡完成。對于每一個胚胎，可根據(jù)它們各自在es中的體積變化，優(yōu)化在es中的洗滌時間，這能夠通過系統(tǒng)不斷監(jiān)測胚胎體積來實現(xiàn)。

(f)通過控制電動注射器，將胚胎抽吸和定位在微量吸液管中。

(g)在培養(yǎng)皿底上方向上移動微量吸液管(如，3000μm)，并移動x-y載物臺至多-孔培養(yǎng)皿302的vs區(qū)。

步驟3.在vs中自動洗滌胚胎

(a)系統(tǒng)進行自動對焦以聚焦于多-孔培養(yǎng)皿區(qū)302上的vs區(qū)底部。

(b)降低微量吸液管直至與檢測到與vs區(qū)底部接觸。

(c)將胚胎分發(fā)到vs中。由于vs的較高濃度，在es中平衡的胚胎在vs中向上漂浮，這造成胚胎的位置沿著z軸改變。系統(tǒng)1通過實時處理2d圖像和向上移動焦平面以保持胚胎處于焦點，檢測在3d空間中的胚胎。如果在vs中的多個洗滌步驟是方案所需要的(如，kitazato方案需要vs1和vs2)，子步驟(a)、(b)和(c)可以重復(fù)。

(d)當(dāng)胚胎被檢測具有其最小體積或由玻璃化方案指定的固定時間時，將胚胎抽吸和定位在微量吸液管中。

(e)在培養(yǎng)皿底上方向上移動微量吸液管(如，3000μm)，并移動x-y載物臺至玻璃化吸管區(qū)304。

步驟4.將胚胎自動放置于玻璃化吸管上

(a)系統(tǒng)1進行x-y載物臺200的視覺伺服控制以定位玻璃化吸管303至fov的中心。

(b)降低微量吸液管直至其尖端接觸玻璃化吸管的表面。

(c)控制電動注射器以注入相對較大的體積(如，5μl)的玻璃化溶液(vs)，以確保胚胎自微量吸液管分發(fā)到玻璃化吸管的表面。

(d)將微量吸液管尖端從其在吸管表面的初始位置移開至fov的左側(cè)。介質(zhì)由于表面張力跟隨微量吸液管尖端。

(f)抽吸掉過多的介質(zhì)直至胚胎液滴在吸管上的體積沒有進一步的變化。

(g)在玻璃化吸管上方向上移動微量吸液管(如，3000μm)，并移動x-y載物臺至原位置。

步驟5.自動冷凍、密封和低溫保存玻璃化吸管

(a)通過第二機器人502拾起在其表面頂部具有玻璃化胚胎的玻璃化吸管303并立即在含有液氮的子容器901中冷凍。

(b)將冷凍吸管放置在蓋密封機800上。

(c)經(jīng)由密封機上的引導(dǎo)機械移動一個塑料蓋以密封吸管尖端。

(d)將密封的冷凍吸管插入液氮子容器901的孔中。

(e)將子容器移入自動液氮貯藏系統(tǒng)中供長期低溫保存。

通常地，一個以上的卵母細胞/胚胎/細胞需要在一批內(nèi)處理。為縮短系統(tǒng)空閑時間，可進行/優(yōu)化任務(wù)程序安排。圖4顯示一個程序安排實例，假定是實施kitazato玻璃化方案。根據(jù)這個程序安排，在第一個胚胎在es內(nèi)時，機器人501開始從培養(yǎng)皿拾起第二個胚胎。

c.解凍過程

建立步驟是可包括可涉及操作員的子步驟的唯一步驟。所有其它步驟是全自動化的。

步驟0.系統(tǒng)設(shè)置和準備

(a)為了解凍過程，打開系統(tǒng)1并將x-y載物臺移至原位置。

(b)根據(jù)所述方案，將預(yù)-溫?zé)岬慕鈨鋈芤?ts)、稀釋溶液(ds)，和洗滌溶液(ws)加入到多-孔培養(yǎng)皿中。

(c)從自動液氮貯藏系統(tǒng)取出含有胚胎的冷凍吸管。由第二機器人502從吸管除去密封蓋。

(d)將吸管插入ts。輕輕地震搖吸管以使胚胎從吸管尖端落下。

步驟1.自動解凍在ts中的胚胎

(a).系統(tǒng)將ts區(qū)移至顯微鏡下的fov的中心。

(b).進行自動對焦以聚焦于胚胎。

(c).從捕獲的圖像檢測和跟蹤胚胎。

(d).根據(jù)所使用的方案，使胚胎保持在es中適當(dāng)?shù)臅r間段(如，如約1min)。

(e).檢測微量吸液管尖端并定位于顯微鏡下的fov的中心。

(f).通過向培養(yǎng)皿底降低微量吸液管，檢測尖端對培養(yǎng)皿基層的接觸。

(g).使解凍的胚胎移近微量吸液管尖端位置。

(h).將胚胎抽吸進微量吸液管并通過控制電動注射器定位于微量吸液管內(nèi)的所需位置。

(i).在培養(yǎng)皿底上方向上移動微量吸液管(如，3000μm)，并移動x-y載物臺至ds區(qū)。

步驟2.將胚胎從ts自動轉(zhuǎn)移至ds

(a).進行自動對焦算法以聚焦在多-孔培養(yǎng)皿上的ds區(qū)底部。

(b).降低微量吸液管直到檢測到接觸。

(c).通過從電動注射器施加正壓，將胚胎溫和地分發(fā)至ds底部。

(d).根據(jù)所述方案，將胚胎保持在es中一定時間段(如，3min)。

(e).通過控制電動注射器，將胚胎抽吸和定位在微量吸液管中。

(f).在培養(yǎng)皿底上方向上移動微量吸液管(如，3000μm)，并移動x-y載物臺至ws區(qū)。

步驟3.自動洗滌胚胎并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)介質(zhì)

(a).根據(jù)要遵循的方案，可重復(fù)如在步驟2中的步驟以將胚胎從ds轉(zhuǎn)移至ws，并將胚胎保持在ws中適當(dāng)?shù)臅r間段(如，5min)。

(b).通過將胚胎抽吸進微量吸液管中，并輕輕地將其放置于ws頂部，在ws中洗滌胚胎數(shù)次，例如2、3、4或更多次?？墒古咛プ杂傻爻两档絯s底部。系統(tǒng)檢測胚胎并在ws中洗滌期間，在3d空間跟蹤它們。

(c).類似于步驟2，將洗滌的胚胎轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)介質(zhì)的培養(yǎng)皿中。

(d).將胚胎培養(yǎng)皿放回到37℃孵箱中以使完全恢復(fù)。

d.用于自動玻璃化的技術(shù)

下文描述用于執(zhí)行在前面章節(jié)中討論的工作流程的技術(shù)。這些技術(shù)包括：微量吸液管/玻璃化吸管檢測，接觸檢測，自動對焦，胚胎檢測/跟蹤，定位在微量吸液管中的胚胎，在vs中產(chǎn)生適度的濃度梯度，從玻璃化吸管除去過多的vs，玻璃化吸管密封機，和自動液氮貯藏系統(tǒng)。下述和參考圖中說明的技術(shù)可作為機器-可訪問的指令，利用任何不同的存儲在計算機50中的編程代碼執(zhí)行。

微量吸液管和玻璃化吸管的檢測

第一步驟可以使微量吸液管或玻璃化吸管的圖像二值化并從背景提取目標對象。在ivf診所中，立體立式顯微鏡通常被用來檢查胚胎的內(nèi)部形態(tài)細節(jié)。立體顯微鏡在捕獲的圖像上產(chǎn)生照明梯度。系統(tǒng)運行一個基于直方圖的閾值算法，以區(qū)分前景對象(如，微量吸液管，或玻璃化吸管)與背景。首先，可計算所有像素的灰度值的直方圖。直方圖可包括兩個峰，其中一個表示背景像素，而另一個表示前景對象的像素。兩個像素的中點可由系統(tǒng)用作圖像二值化的閾值，以提取前景對象，如在圖5(a)(b)中所示。

圖像二值化后，進行形態(tài)轉(zhuǎn)換(即，腐蝕和膨脹)以除去嘈雜的小尺寸對象。由于微量吸液管遠大于胚胎，在二值化的圖像中被系統(tǒng)拍攝的最大對象是微量吸液管。除了使用尺寸作為檢測微量吸液管的標準，形狀信息也被系統(tǒng)使用以確保正確的檢測。微量吸液管的外壁可被建模為兩條線。因此，霍夫線性變換被應(yīng)用于所檢測對象的輪廓(見圖5(c))。如果兩條線是在最大的對象上，微量吸液管檢測就被證實是正確的。否則，它就被認為是錯誤的檢測。

在機器人系統(tǒng)中，微量吸液管尖端指向右側(cè)方向。根據(jù)這個具體的系統(tǒng)設(shè)置，具有距圖像的左邊界的最大距離(在檢測的微量吸液管對象上)的點被系統(tǒng)考慮為微量吸液管尖端位置。在檢測的微量吸液管內(nèi)，提取一個較小的區(qū)域作為檢測在微量吸液管內(nèi)胚胎的感興趣的區(qū)域(roi)。

玻璃化吸管的檢測類似于微量吸液管檢測。差別在于玻璃化吸管的方向(其中尖端指向左側(cè))與微量吸液管相反。

接觸檢測

微量吸液管尖端和培養(yǎng)皿底或玻璃化吸管的表面之間沿著z軸的相對距離對于成功從培養(yǎng)皿或吸管自動拾起/放置胚胎到培養(yǎng)皿或吸管中，可能是至關(guān)重要的。

微量吸液管尖端和培養(yǎng)皿底之間的相對距離可基于檢測微量吸液管尖端在培養(yǎng)皿底上的滑行移動來檢測。系統(tǒng)不斷地視覺跟蹤尖端在x-y平面上的位置，同時降低微量吸液管向下至培養(yǎng)皿底。如在圖6(a)中說明的，當(dāng)微量吸液管510尖端接觸培養(yǎng)皿底601時，進一步向下運動導(dǎo)致尖端在培養(yǎng)皿底上的水平滑行移動，這改變了尖端在x-y平面上的位置。然后將機器人機械手501的檢測的z位置記錄為培養(yǎng)皿底的參考高度。

微量吸液管尖端在玻璃化吸管上的接觸的檢測是基于不同的原理。玻璃化吸管303具有低剛度且當(dāng)接觸微量吸液管尖端時容易偏離。因此，本發(fā)明的機器人系統(tǒng)通過檢測吸管的變形移動，檢測微量吸液管尖端和吸管之間的接觸(見圖6(b))。各種移動檢測算法可被用來檢測吸管的變形，例如幀減法、背景減法、光流，或移動歷史圖像方法。

檢測尖端接觸玻璃化吸管的另一種方法是基于檢測介質(zhì)在吸管上的擴散。當(dāng)微量吸液管尖端接觸吸管時，微量吸液管內(nèi)的介質(zhì)由于表面張力而被動地流出到親水性吸管表面。因此，接觸位置可由檢測擴散到微量吸液管尖端周圍的介質(zhì)確定。當(dāng)對象出現(xiàn)在二值化圖像中的尖端位置的周圍時，接觸被認為檢測到。機器人機械手501然后停止向下運動并記參考z位置。

自動對焦

用于前面提到的檢測過程的一個必須具備的步驟是聚焦于參考表面(即，在培養(yǎng)皿底上或吸管表面上)。因此，系統(tǒng)進行自動-對焦。自動對焦算法使用一個基于tenenbaum梯度的焦點測量，以確定捕獲的圖像的焦點水平。這種算法使圖像與sobel算子卷積，然后求梯度向量分量的平方和。系統(tǒng)調(diào)整顯微鏡焦平面直至聚焦度量達到最大值。聚焦度量的一階導(dǎo)數(shù)被用來確定最大值。當(dāng)焦平面移動至目標對象(如，胚胎或微量吸液管尖端)時，聚焦度量增加且一階導(dǎo)數(shù)是正的。一旦一階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)為負數(shù)，焦平面已到達轉(zhuǎn)折點的最佳位置并開始從目標對象移開。

胚胎檢測/跟蹤

為避免胚胎通過整個玻璃化過程的損失，可靠地檢測和跟蹤胚胎是很重要的。參考圖7，系統(tǒng)檢測胚胎的第一步是圖像二值化[見圖7(a)(b)]。在二值化的圖像中，系統(tǒng)通過使用面積和形狀信息從前景對象檢測胚胎。具有范圍從500至1000像素的面積的對象被認為是潛在的胚胎目標。此外，應(yīng)用霍夫圓變換以擬合潛在目標的圓。具有圓形形狀的對象被視為胚胎。擬合的圓形形狀的數(shù)量表明胚胎發(fā)育階段(如，2-細胞、4-細胞、胚泡階段)。各個胚胎的區(qū)域由系統(tǒng)實時監(jiān)控，以提供一個優(yōu)化在vs中的浸沒時間的標準。當(dāng)在vs中洗滌胚胎時，胚胎在開始時由于滲透壓收縮。然后它們再膨脹至與vs平衡。由于vs的溶質(zhì)是有毒的，用vs平衡理想地應(yīng)該被避免。因此，一旦胚胎達到它們的最小尺寸/體積，則理想地應(yīng)該將它們從vs中取出。然而，在目前的手動操作中，所有的胚胎經(jīng)歷相同的時間選擇。

為了使胚胎快速地定位于相對較大的培養(yǎng)皿中，胚胎檢測算法還涉及顯微鏡放大倍率的變化和x-y載物臺的移動。系統(tǒng)首先在較低的放大倍率(即，較大的fov)下檢測潛在的胚胎對象。然后通過移動x-y載物臺，將潛在的胚胎對象定位于fov的中心。然后系統(tǒng)自動轉(zhuǎn)換顯微鏡至更高的放大倍數(shù)，并再次執(zhí)行胚胎檢測以驗證來自較低放大倍率的檢測結(jié)果并分析胚胎的內(nèi)部形態(tài)。

當(dāng)將胚胎從較低-濃度的es轉(zhuǎn)移至vs或在洗滌步驟期間，由于微量吸液管運動/分發(fā)引起的浮力和/或液流，胚胎可在溶液內(nèi)上下移動。為跟蹤在3d空間中的胚胎，通過動態(tài)地移動焦平面以保持被跟蹤的胚胎(s)在焦點中，胚胎檢測算法與自動對焦算法結(jié)合。

在微量吸液管中定位胚胎

在胚胎抽吸和分發(fā)期間，機器人系統(tǒng)對在微量吸液管中的胚胎快速地和精確地定位。胚胎的位置經(jīng)視覺跟蹤以提供給系統(tǒng)實現(xiàn)閉環(huán)視覺伺服控制的位置反饋。在微量吸液管內(nèi)的所需位置是距尖端一個預(yù)先確定的距離。這個距離不能太長，因為當(dāng)分發(fā)胚胎進入下一個玻璃化溶液中時，它將引入太大體積的溶液。另一方面，距離不能太短，因為胚胎很可能自微量吸液管尖端“逃避”掉，導(dǎo)致卵母細胞/胚胎丟失?；谒栉恢煤蜋z測的位置之間的錯誤，系統(tǒng)運行控制器(如，比例-積分-導(dǎo)數(shù)(proportional-integral-derivative)(pid)或魯棒控制器(robustcontroller))算法以控制電動注射器和抽吸或分發(fā)直至卵母細胞/胚胎達到所需位置。圖8顯示將胚胎定位于微量吸液管中的控制圖。

適度的濃度梯度的生成

在玻璃化中，es通常具有與vs相同的溶質(zhì)，但濃度較低。在es中平衡后，當(dāng)轉(zhuǎn)移到vs中時，由于濃度變化，胚胎遭遇滲透壓休克。為減少細胞損傷，這種滲透壓休克可減少至最低水平。因此，機器人系統(tǒng)可在vs中生成適度的濃度梯度。為生成適度的濃度變化，系統(tǒng)沿著x軸移動微量吸液管至左側(cè)，同時分發(fā)es至vs中。es介質(zhì)以恒定的速率(如，以5μl/sec)分發(fā)，同時微量吸液管運動的速度保持逐漸增加，直至微量吸液管尖端移至fov邊緣。由于es和vs之間的混合速率是恒定的，濃度梯度沿著微量吸液管的移動途徑生成。

當(dāng)胚胎從微量吸液管尖端分發(fā)出來時，它們首先定位在濃度較低的位置(即，類似于es)。然后使胚胎沿著濃度梯度遞增的方向(即，從右到左)溫和地移動。此后，通過抽吸進入微量吸液管和從微量吸液管分發(fā)出來，洗滌胚胎數(shù)次。

圖9說明用于生成濃度梯度的實例方法。vs2通常具有與vs1相同的溶質(zhì)，但濃度較高。為生成一種濃度梯度，將vs1以恒定速率注入vs2，同時機器人使微量吸液管以恒定的加速度加速向左側(cè)方向移動。

最大限度地減少滲透壓休克壓力的另一種方法是采用一系列具有適度的濃度變化的玻璃化溶液。然而，這種方法涉及更多類型的vs和更多步驟的胚胎拾起并定位。

從玻璃化吸管除去過多的vs

在機器人501放置玻璃化胚胎到吸管上后，系統(tǒng)除去過多的介質(zhì)以實現(xiàn)高的冷卻速率。如在圖10(a)(b)中所示，系統(tǒng)首先將在相對大量的vs溶液中的胚胎分發(fā)到玻璃化吸管上。然后機器人501將吸管表面上的微量吸液管從最初的分發(fā)位置移開以形成vs薄膜。機器人系統(tǒng)控制電動注射器抽吸vs，直至胚胎液滴的體積停止改變[圖10(c)]。在vs介質(zhì)被抽吸到微量吸液管中時，摩擦力保持胚胎在其最初的位置。

貫穿該步驟，系統(tǒng)利用圖像處理以監(jiān)測液滴體積變化和微量吸液管尖端位置。通過使用在前面的章節(jié)“胚胎檢測/跟蹤”中描述的方法，也從吸管roi檢測胚胎。由于胚胎被過多的介質(zhì)包圍，檢測的對象的體積與過多的介質(zhì)的體積成正比。因此，當(dāng)檢測的胚胎體積停止變化時，認為所有過多的介質(zhì)已從玻璃化胚胎除去。

玻璃化吸管密封

玻璃化吸管密封機被設(shè)計以自動放置塑料蓋至吸管尖端以避免在長期低溫保存期間的污染。如在圖11中所示，密封機包括機械引導(dǎo)裝置，其允許滑動部分向固定部分移動。玻璃化吸管和塑料蓋(taps)分別安裝在滑動部分和固定部分的預(yù)定孔/位置上。由機器人502將吸管放置在密封機上后，系統(tǒng)控制馬達以驅(qū)動滑動部分移向固定部分，直至觸發(fā)限位開關(guān)，其完成加蓋/密封過程。

自動液氮貯藏系統(tǒng)

作為機器人玻璃化系統(tǒng)的部分，設(shè)計了自動液氮貯藏系統(tǒng)。自動貯藏系統(tǒng)包含液氮罐、內(nèi)置3-軸傳送系統(tǒng)，和液氮子容器。3-軸傳送系統(tǒng)903自動定位子容器901并將其移進或移出含有液氮的儲罐904。如在圖12中所示，傳送系統(tǒng)903可包括3個平移運動軸或2個平移軸加1個轉(zhuǎn)動軸以旋轉(zhuǎn)儲罐內(nèi)的子容器。作為傳送系統(tǒng)的末端效應(yīng)器，機械配對框905夾持子容器的把柄。

如在圖13中所示，子容器901被設(shè)為用于冷凍和貯藏玻璃化吸管的自動貯藏系統(tǒng)902的亞單位。子容器901具有用于傳送系統(tǒng)的末端效應(yīng)器連接的把柄906，玻璃化冷凍區(qū)907，和具有多個用于冷凍吸管插入的孔的貯藏區(qū)908。為防止玻璃化吸管在貯藏區(qū)中的自由移動，子容器還包括蓋909以覆蓋貯藏區(qū)。

e.優(yōu)勢

本發(fā)明的系統(tǒng)自動實施廣泛接受的玻璃化方案。無需改變完全-確立的方案或修飾胚胎處理途徑，本發(fā)明的系統(tǒng)可容易為診所所接受。

在貫穿整個玻璃化過程中實時監(jiān)測胚胎，這可有效地避免胚胎損失。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法是全自動的，包括加載和取回胚胎(對比在微流體玻璃化中的手動加載)，和檢測胚胎在溶液中的位置(與ru等在中國專利申請公布號202918907u的專利中的手動輸入相反)。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可生成一種適度的濃度梯度，其可使?jié)B透壓最小化并且還增加細胞的存活率。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可自動將玻璃化胚胎放置在玻璃化吸管上和除去周圍的過多的溶液以實現(xiàn)“最小的體積”，以獲得用于冷凍的高的冷卻速率。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法能夠用節(jié)省總的處理時間的優(yōu)化程序表處理多個胚胎。

本發(fā)明的系統(tǒng)和方法包括可用來將蓋放置在玻璃化吸管的自動密封機，和可消除在胚胎處理中的人為錯誤的自動低溫貯藏系統(tǒng)。

卵母細胞、胚胎和細胞被暴露于與標準手動方案同樣均勻的不同的處理溶液(即洗滌、平衡、玻璃化、解凍溶液)。

通過說明和描述的實施方案，描述了目前考慮的制備和使用本發(fā)明的最佳模式。無需進一步闡明，認為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于本文提供的描述，充分地利用本發(fā)明。

雖然上面的描述包含許多特殊性，但這些不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍，而是僅僅作為提供某些目前的本發(fā)明實施方案的示例。因此本發(fā)明的范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書及其合法的等價物確定，而不是由給出的實施例確定。

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種自動化生物材料低溫貯藏系統(tǒng)，其包含：

(a)載板，其具有(i)容納生物材料的區(qū)域，(ii)容納生物材料處理溶液的多孔區(qū)，和(iii)容納一個或多個玻璃化吸管的吸管區(qū)；

(b)連接于操作生物材料和處理溶液的機械手的第一機器人；

(c)操作玻璃化吸管的第二機器人；

(d)顯微鏡和可操作地連接于顯微鏡以捕獲生物材料的圖像的圖像捕獲裝置，機械手和玻璃化吸管；

(e)具有可執(zhí)行的指令的計算機可讀介質(zhì)；和

(f)執(zhí)行計算機可讀介質(zhì)的可執(zhí)行指令的處理器；所述可執(zhí)行指令包括以下自動化的指令：(i)處理捕獲的圖像，(ii)可操作地控制顯微鏡、圖像捕獲裝置、第一機器人，和第二機器人，和(iii)跟蹤三維空間的生物材料。

2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中系統(tǒng)還包含吸管-密封機和自動低溫貯藏裝置，和其中可執(zhí)行指令還包括自動化可操作地控制吸管-密封機和自動低溫貯藏裝置的指令。

3.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中可執(zhí)行指令還包括以下指令：

(i)當(dāng)生物材料是細胞、胚胎或卵母細胞時，從捕獲的圖像檢測處于不同發(fā)育階段的細胞、胚胎或卵母細胞；

(ii)監(jiān)測生物材料的體積；

(iiii)生成處理溶液的濃度梯度；

(iv)將生物材料置于玻璃化吸管；和

(v)從置于玻璃化吸管的生物材料除去過多的處理溶液。

4.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中可執(zhí)行指令還包括自動改變顯微鏡的焦距和放大倍率的指令。

5.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述顯微鏡包括用于接受載板的x-y載物臺，x-y載物臺包括x-軸線性移動系統(tǒng)和y-軸線性移動系統(tǒng)，和其中可執(zhí)行指令還包括可操作地控制x-y載物臺的指令。

6.權(quán)利要求5的系統(tǒng)，其中顯微鏡被可操作地連接于具有用于每個所述x和y軸線性移動系統(tǒng)的驅(qū)動器的控制器。

7.權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中所述x-軸線性移動系統(tǒng)和y-軸線性移動系統(tǒng)是獨立可控的。

8.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述第一和第二機器人具有至少三個自由度。

9.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述容納生物材料的區(qū)域與加熱板集成為一體。

10.權(quán)利要求2的系統(tǒng)，其中所述吸管密封機包括預(yù)設(shè)的吸管加載位置，預(yù)設(shè)的吸管蓋加載位置，和將蓋移向玻璃化吸管的機械導(dǎo)引機械裝置。

11.權(quán)利要求2的系統(tǒng)，其中所述自動低溫貯藏系統(tǒng)包括用于容納低溫保存溶液的低溫保存溶液槽，可移動的子容器和自動定位和傳送子容器的3-軸傳送系統(tǒng)。

12.權(quán)利要求11的系統(tǒng)，其中所述可移動的子容器具有至少一個容納至少一個玻璃化吸管的位置。

13.權(quán)利要求11的系統(tǒng)，其中所述可移動的子容器具有帶有直接冷凍玻璃化吸管的開放空間的冷凍區(qū)。

14.權(quán)利要求11的系統(tǒng)，其中所述可移動的子容器具有至少一個連接至內(nèi)置傳送系統(tǒng)的把柄。

15.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中內(nèi)置傳送系統(tǒng)具有至少一個線性移動部分，其中所述線性移動部分受控進行往復(fù)移動，以將子容器從槽中取出，或?qū)⑺湃氩壑小?/p>

16.權(quán)利要求3的系統(tǒng)，其中用于檢測在不同發(fā)育階段的細胞、胚胎或卵母細胞的所述計算機可執(zhí)行指令包括：產(chǎn)生二值化圖像的圖像二值化，從二值化圖像中的前景對象檢測潛在的細胞目標，并對潛在的細胞目標擬合圓。

17.權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中所述檢測涉及自動改變顯微鏡的放大倍率和按坐標移動x-y載物臺。

18.權(quán)利要求17的系統(tǒng)，其中所述檢測開始于以較低放大倍率檢測細胞、胚胎或卵母細胞，然后自動控制x-y載物臺，以移動檢測的細胞、胚胎或卵母細胞至視野的中心。

19.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中用于跟蹤在三維空間中的生物材料的所述計算機可執(zhí)行指令還檢測生物材料的z位置。

20.權(quán)利要求19的系統(tǒng)，其中所述檢測生物材料的z位置涉及顯微鏡的焦平面沿著z軸的自動調(diào)整。

21.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中用于自動放置生物材料至玻璃化吸管的所述計算機可執(zhí)行指令還包括機械手尖端接觸玻璃化吸管尖端的檢測。

22.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中接觸玻璃化吸管尖端的所述檢測是基于檢測因機械手尖端與玻璃化吸管尖端接觸產(chǎn)生的玻璃化吸管尖端的偏差。

23.權(quán)利要求22的系統(tǒng)，其中吸管尖端偏差的所述檢測是經(jīng)由移動檢測。

24.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中機械手是微量吸液管，和系統(tǒng)還包含電動注射器以產(chǎn)生用于微量吸液管抽吸或分發(fā)的壓力。

25.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中生物材料是細胞、卵母細胞和/或胚胎。

26.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中生物材料是細胞、胚胎或卵母細胞，和其中可執(zhí)行指令還包括以下自動化的指令：(i)改變顯微鏡的焦距和放大倍率，(ii)從捕獲的圖像檢測在不同發(fā)育階段的細胞、胚胎或卵母細胞；(iii)聚焦于細胞、胚胎或卵母細胞，(iv)沿著z軸調(diào)整顯微鏡的焦平面，和(v)整合檢測指令和聚焦指令以跟蹤三維空間的生物材料。

27.權(quán)利要求3的系統(tǒng)，其中玻璃化吸管選自基于開放的條狀吸管、基于微量吸液管的吸管和基于防凍劑膜的吸管，和其中將生物材料放置于玻璃化吸管的所述計算機可執(zhí)行指令包括將生物材料放置在基于開放的條狀吸管上，或基于微量吸液管的吸管內(nèi)或基于防凍劑膜的吸管的環(huán)內(nèi)。

28.一種處理生物材料的自動化方法，其包括：(a)通過一系列玻璃化處理溶液，自動和均勻地暴露生物材料，從而獲得玻璃化生物材料，(b)在玻璃化處理溶液內(nèi)自動跟蹤三維空間的生物材料，(c)自動放置玻璃化生物材料在玻璃化吸管的表面，(d)將攜帶玻璃化生物材料的玻璃化吸管自動插入低溫保存溶液中，(e)自動密封攜帶玻璃化生物材料的玻璃化吸管，和(f)在低溫保存溶液中自動貯藏密封的玻璃化吸管，從而冷凍含有玻璃化生物材料的玻璃化吸管，以供長期低溫保存。

29.權(quán)利要求28的自動化方法，其中方法還包括從低溫保存溶液自動取回冷凍的密封玻璃化吸管，并通過一系列處理溶液自動和均勻地暴露冷凍的玻璃化生物材料，從而解凍生物材料。

30.權(quán)利要求28的自動化方法，其中生物材料是細胞、胚胎或卵母細胞，和其中步驟(b)包括(i)使用連接于顯微鏡的照相機以捕獲細胞、胚胎或卵母細胞的圖像，(ii)從捕獲的圖像檢測在不同發(fā)育階段的細胞、胚胎或卵母細胞；(iii)聚焦于細胞、胚胎或卵母細胞，(iv)沿著z軸調(diào)整顯微鏡的焦平面，和(v)整合檢測步驟和聚焦步驟以跟蹤三維空間的生物材料。

31.權(quán)利要求28的方法，其中玻璃化吸管選自基于開放的條狀吸管、基于微量吸液管的吸管和基于防凍劑膜的吸管，和其中步驟(c)包括將生物材料放置在基于開放的條狀吸管上，或基于微量吸液管的吸管內(nèi)和基于防凍劑膜的吸管的環(huán)內(nèi)。