一些實施方案通常涉及某些δ-9去飽和酶，編碼這些酶的核酸，以及在植物細胞中表達該酶的方法。一些實施方案涉及利用某些δ-9去飽和酶的活性降低植物材料(例如種子)中飽和脂肪酸的組成百分比，并增加ω-7脂肪酸的組成百分比。另外的實施方案涉及利用種子特異性啟動子優(yōu)先在種子中表達δ-9去飽和酶。本文還公開了通過特定實施方案中的方法制備的植物和植物材料，以及由那些含有小于3.5％或小于2.7％的飽和脂肪酸的植物產(chǎn)生的油。背景植物源油(vegetable-derivedoils)已逐漸取代了動物來源的油脂作為飲食脂肪攝入的主要來源。然而，大多數(shù)工業(yè)化國家的飽和脂肪攝入量仍然保持在總熱量消耗的15％至20％左右。為了推廣更健康的生活方式，美國農(nóng)業(yè)部(usda)最近建議，飽和脂肪含量低于每日熱量攝入量的10％。為了促進消費者意識，美國農(nóng)業(yè)部頒布的現(xiàn)行標注指南現(xiàn)在要求總飽和脂肪酸水平低于每14克1.0克方可獲得“低飽和”標注，低于每14克0.5克方可獲得“無飽和”標注。這意味著植物油要獲得“低飽和”或“無飽和”標注，飽和脂肪酸含量需要分別低于7％和3.5％。自從這些指南發(fā)布以來，消費者對“低飽和”和“無飽和”油的需求激增。到目前為止，這一需求主要是由卡諾拉油來滿足的，葵花油和紅花油也有貢獻，但小得多。雖然不飽和脂肪(單不飽和及多不飽和)是有益的(特別是在適度消費時)，但飽和脂肪和反式脂肪不是。飽和脂肪和反式脂肪會增加血液中不想要的低密度脂蛋白膽固醇水平。膳食膽固醇即使在不提高低密度脂蛋白的情況下也會增加低密度脂蛋白膽固醇，并可能導(dǎo)致心臟病。因此，建議選擇低飽和脂肪、低反式脂肪和低膽固醇食物作為健康飲食的一部分。油，無論是植物還是動物來源，其特征主要由油分子中的碳原子數(shù)和氫原子數(shù)以及脂肪酸鏈中包含的雙鍵的數(shù)量和位置決定。大多數(shù)來自植物的油是由不同量的棕櫚酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1)，亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)脂肪酸組成的。通常，棕櫚酸和硬脂酸被稱為“飽和的”，因為它們的碳鏈被氫原子飽和，因此沒有雙鍵；它們含有最大可能數(shù)量的氫原子。然而，油酸，亞油酸和亞麻酸分別是具有一個、兩個和三個雙鍵的18碳脂肪酸鏈。油酸通常被認為是單不飽和脂肪酸，而亞油酸和亞麻酸被認為是多不飽和脂肪酸。美國農(nóng)業(yè)部“無飽和”油產(chǎn)品的定義(意思是具有小于3.5％飽和脂肪酸含量的油產(chǎn)品)以組合的飽和脂肪酸重量含量(與脂肪酸總量相比)計算?？ㄖZ拉油的飽和脂肪酸水平是所有植物油中最低的。“卡諾拉”是指這樣的油菜(蕓苔屬)，其芥子酸(c22:1)含量為至多2重量％，基于種子的總脂肪酸含量(優(yōu)選至多0.5重量％，最優(yōu)選基本上為0重量％)，并在破碎后產(chǎn)生在脫脂(無油)粕中含有少于30μmol/g硫代葡萄糖苷的風(fēng)干粕。這些類型的油菜與該物種的傳統(tǒng)品種相比具有優(yōu)異的可食性。據(jù)推測，在油用種子中，脂肪酸合成主要發(fā)生在質(zhì)體中。脂肪酸合成的主要產(chǎn)物是棕櫚酸(16:0)，其似乎被高效地延伸成為硬脂酸(18:0)。然后，當其還在質(zhì)體中時，飽和脂肪酸可以被一種稱為?；?acpδ-9去飽和酶的酶去飽和，從而引入一個或多個碳-碳雙鍵。具體來說，硬脂酸可以被質(zhì)體δ-9去飽和酶快速去飽和而產(chǎn)生油酸(18:1)。事實上，棕櫚酸也可以被質(zhì)體δ-9去飽和酶去飽和而成為棕櫚油酸(16:1)，但在大多數(shù)植物油中，這種脂肪酸僅微量存在(0-0.2％)。因此，質(zhì)體中的脂肪酸合成的主要產(chǎn)物是棕櫚酸、硬脂酸和油酸。在大多數(shù)油中，油酸是合成的主要脂肪酸，因為飽和脂肪酸以低得多的比例存在。新合成的脂肪酸從質(zhì)體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。隨后在細胞質(zhì)中去飽和的植物脂肪酸似乎限于油酸，其可以通過作用于酯化至磷脂酰膽堿(pc)的油?；蚓€基油基底物上的微粒體去飽和酶而被去飽和至亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)。此外，依植物不同，可以通過延伸(至20:1、22:1和/或24:1)或通過添加官能團進一步修飾油酸。然后這些脂肪酸，與棕櫚酸和硬脂酸等飽和脂肪酸一起，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中被組裝成甘油三酯。植物?；?acpδ-9去飽和酶是可溶的。它位于質(zhì)體基質(zhì)中，并使用被酯化到acp的新合成的脂肪酸，主要是硬脂酰-acp，作為底物。這與其他δ-9去飽和酶形成對照：其他δ-9去飽和酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(er或微粒體)中，使用被酯化到co-a的脂肪酸作為底物，并使棕櫚酸和硬脂酸等兩種飽和脂肪酸均飽和。美國專利5,723,595和6,706,950涉及植物去飽和酶。酵母δ-9去飽和酶基因已經(jīng)從釀酒酵母中分離、克隆并測序。stukeyetal.(1989)j.biol.chem.264:16537-44；stukeyetal.(1990)j.biol.chem.265:20144-9。該酵母基因已被引入煙草葉組織(polashcoketal.(1991)fasebj.5:a1157；polashoketal.(1992)plantphysiol.100:894-901)中，并且似乎在該組織中表達。此外，在番茄中表達了該酵母基因。參見wangetal.(1996)j.agric.foodchem.44:3399-402；和wangetal.(2001)phytochemistry58:227-32。盡管在煙草和番茄中使用這種酵母δ-9去飽和酶基因都報告了某些不飽和脂肪酸的某些增加以及某些飽和脂肪酸的某些降低，但煙草和番茄顯然不是油料作物。此酵母基因也已被引入歐洲油菜。美國專利5,777,201。另一種不同的真菌?；o酶aδ-9去飽和酶，來自構(gòu)巢曲霉，已經(jīng)被引入到卡諾拉中，在種子油中實現(xiàn)了降低的飽和脂肪酸水平。美國專利申請公開us2008/0260933a1。構(gòu)巢曲霉?；o酶aδ-9去飽和酶對硬脂酸酯的消耗(61-90％)比對更富的棕櫚酸脂肪酸的消耗(36-49％)更多。公開本文公開了新型真菌δ-9去飽和酶；包含至少一個編碼此類去飽和酶的核苷酸序列的核酸；包含上述任何一種的植物、植物材料(例如種子)、植物部分和植物商品。一些實施方案的方面的例子是從灰色大角間座殼(magnaporthegrisea)，穎枯小球腔菌(leptosphaerianodorum)和美洲棉鈴蟲(helicoverpazea)分離的真菌δ-9去飽和酶。一些實例包括對棕櫚酸或硬脂酸具有底物偏好的天然和合成的δ-9去飽和酶。一些實施方案包括編碼δ-9去飽和酶的分離的核酸分子，其包含與選自seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33的序列至少80％相同的氨基酸序列。在具體實例中，核酸分子包含與選自seqidno:2、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25至少60％相同的序列。這些實施方案和進一步的實施方案可以包括分離的δ-9去飽和酶多肽，其包含與選自seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33的序列至少80％相同的氨基酸序列。還公開了在植物細胞中表達上述核酸和/或多肽中的至少一種的方法。特定的實施方案利用δ-9去飽和酶的活性，使得在包含所述植物細胞的植物、植物材料(例如種子)和/或植物部分、和/或由上述任何一種生產(chǎn)的植物商業(yè)產(chǎn)品中的飽和脂肪酸的組成百分比可以降低。在某些實施方案中，所述植物、植物材料、植物部分和/或植物商業(yè)產(chǎn)品中的ω-7脂肪酸可以同時增加。另外的實施方案利用種子特異性表達來進一步降低種子油中飽和脂肪酸的水平。一些實施方案包括減少植物，植物材料，植物部分和/或植物商業(yè)產(chǎn)品的飽和脂肪酸的量的方法，所述方法包括用編碼δ-9去飽和酶多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細胞本發(fā)明使得該細胞中的飽和脂肪酸的量減少。一些實施方案包括用于產(chǎn)生基因工程化植物的方法，所述植物與相同物種的野生型植物相比在該植物中包含減少量的飽和脂肪酸。這樣的方法可以包括用編碼一種或多種δ-9去飽和酶多肽的核酸分子或本發(fā)明的δ-9去飽和酶多肽的一個或多個拷貝轉(zhuǎn)化植物材料(或植物細胞)，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物材料(或植物細胞)獲得植物。在具體實例中，可以用編碼本發(fā)明的δ-9去飽和酶多肽的核酸分子轉(zhuǎn)化來自擬南芥屬物種的植物細胞和/或植物材料。在其它具體實例中，可以轉(zhuǎn)化δ-9去飽和酶基因的兩個或更多個拷貝，其中每個δ-9去飽和酶基因由一個不同的啟動子控制。在其它具體實例中，所述兩個或更多個啟動子是種子特異性啟動子。從以下參考附圖進行的幾個實施例的詳細描述，上述和其它特征將變得更加清晰。附圖說明圖1顯示pdab7305的質(zhì)粒圖譜。圖2示出了與nexera710tm卡諾拉對照植物和由218-11.30hl轉(zhuǎn)基因卡諾拉植物組成的陽性對照植物相比，分離的t1卡諾拉植物的大批t2種子中tsfa(％)的分布。圖3顯示了與陰性對照nexera710tm卡諾拉植物相比，來自三個選擇的轉(zhuǎn)基因事件的t2種子群體中tsfa的分布。暗點代表tsfa低于3.5％的種子后代(暗線)。如圖所示，tsfa低于3.5％的植物產(chǎn)生不同量的產(chǎn)量，并且具有2至10個拷貝的pat轉(zhuǎn)基因，這些轉(zhuǎn)基因包含在與and9ds轉(zhuǎn)基因相同的t鏈整合體中。圖4示出了卡諾拉單一種子中的tsfa分布和飽和脂肪酸百分比(野生型對照植物被排除，以便該圖表示轉(zhuǎn)基因卡諾拉事件的tsfa值)。序列表使用37c.f.r.§1.822中定義的核苷酸堿基的標準字母縮寫表示所附序列表中列出的核酸序列。僅顯示每個核酸序列的一條鏈，但互補鏈被理解為通過任何提及所顯示的鏈包括。在隨附的序列表中：seqidno:1顯示構(gòu)巢曲霉?；o酶aδ-9去飽和酶(在某些地方稱為and9ds)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。seqidno:2顯示了構(gòu)巢曲霉酰基輔酶aδ-9去飽和酶基因(在某些地方稱為and9ds)的v3的核酸序列。seqidno:3顯示pdab7305的第一植物轉(zhuǎn)錄單位(ptu)的核酸序列。seqidno:4顯示pdab7305的第二ptu的核酸序列。seqidno:5顯示pdab7305的第三ptu的核酸序列。seqidno:6-11顯示了在一些實施方案中可能有用的引物和探針的序列。seqidno:12是通過pcr擴增的灰色大角間座殼?；o酶aδ-9去飽和酶基因(在一些地方稱為mgd9ds)的示例性片段。seqidno:13是示例性的無內(nèi)含子mgd9ds克隆。seqidno:14顯示了編碼第一種穎枯小球腔菌?；o酶aδ-9去飽和酶(在一些地方稱為lnd9ds-1)的示例性核酸序列。seqidno:15顯示了編碼第二種穎枯小球腔菌?；o酶aδ-9去飽和酶(在一些地方稱為lnd9ds-2)的示例性核酸序列。seqidno:16顯示了來自灰色大角間座殼的示例性天然δ-9去飽和酶基因(標記為mgd9dsv1)的編碼區(qū)。seqidno:17顯示了來自美洲棉鈴蟲的示例性天然δ-9去飽和酶基因(標記為hzd9dsv1)的編碼區(qū)。seqidno:18顯示了來自穎枯小球腔菌的示例性天然δ-9去飽和酶(lnd9ds-2v1)基因的編碼區(qū)。seqidno:19顯示了來自灰色大角間座殼(mgd9dsv2)的示例性卡諾拉優(yōu)化的δ-9去飽和酶基因的序列。seqidno:20顯示了來自美洲棉鈴蟲的示例性卡諾拉優(yōu)化的δ-9去飽和酶基因(hzd9dsv2)的序列。seqidno:21顯示了來自穎枯小球腔菌的示例性卡諾拉優(yōu)化的δ-9去飽和酶基因(lnd9ds-2v2)的序列。seqidno:22顯示了來自穎枯小球腔菌的另一示例性卡諾拉優(yōu)化的δ-9去飽和酶基因(lnd9ds-2v3)的序列。seqidno:23顯示了來自美洲棉鈴蟲的另一示例性的卡諾拉優(yōu)化的δ-9去飽和酶基因(hzd9dsv3)的序列。seqidno:24顯示了一種編碼構(gòu)巢曲霉δ-9去飽和酶的示例性核酸序列(在一些地方稱為and9dsv2)。seqidno:25顯示了第二種編碼構(gòu)巢曲霉δ-9去飽和酶的示例性核酸序列(在一些地方稱為and9dsv3)。seqidno:26顯示了來自灰色大角間座殼(mgd9ds)的示例性天然δ-9去飽和酶的氨基酸序列。seqidno:27顯示了來自美洲棉鈴蟲的示例性天然δ-9去飽和酶(hzd9ds)的氨基酸序列。seqidno:28顯示了來自穎枯小球腔菌的示例性天然δ-9去飽和酶(lnd9ds-2)的氨基酸序列。seqidno:29顯示了由seqidno:24-25(and9ds)所例示的核酸編碼的氨基酸序列。seqidno:30顯示另一示例性and9ds去飽和酶的氨基酸序列。seqidno:31顯示來自釀酒酵母的示例性天然δ-9去飽和酶(scole1)的氨基酸序列。seqidno:32顯示了示例性and9ds去飽和酶的n-末端68個殘基(1-68)。seqidno:33顯示了示例性and9ds去飽和酶的c末端175個殘基(281-455)。具體實施方式(s)i.幾個實施例的概述我們以前將來自構(gòu)巢曲霉的真菌?；o酶aδ-9去飽和酶引入油菜籽，從而在種子油中實現(xiàn)降低的飽和脂肪酸水平。美國專利申請公開us2008/0260933a1。構(gòu)巢曲霉δ-9去飽和酶提供的硬脂酸耗竭(61-90％)比種子油中更豐富的棕櫚酸脂肪酸的耗竭(36-49％)更多。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，提供多個拷貝的構(gòu)巢曲霉δ-9去飽和酶能夠?qū)⒖ㄖZ拉中的飽和脂肪酸水平降低到3.5％以下。本文公開了編碼δ-9去飽和酶多肽的核酸分子，其包含與選自seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25的序列至少60％相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，核酸分子還可以包含可操作地連接到δ-9去飽和酶多肽編碼序列的基因調(diào)節(jié)元件。在特定實施方案中，基因調(diào)節(jié)元件可以是菜豆蛋白啟動子、菜豆蛋白5'非翻譯區(qū)、菜豆蛋白3'非翻譯區(qū)(“utr”)、根癌土壤桿菌orf13'非翻譯區(qū)、木薯葉脈花葉病毒啟動子、煙草rb7基質(zhì)附著區(qū)、t鏈邊界序列、lfkcs3啟動子和fae1啟動子。在一些實施方案中，可以存在編碼δ-9去飽和酶多肽的核酸分子的幾個拷貝，并且每個拷貝可能處于一組不同的調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制之下。更具體地說，基因調(diào)節(jié)元件可以是菜豆蛋白啟動子和菜豆蛋白5'utr，和lesquerellafenderilfkcs3啟動子，從而有兩個拷貝的and9ds存在，一個拷貝由菜豆蛋白啟動子和5'utr控制，第二個拷貝由lfkcs3啟動子控制。在其它實施方案中，編碼δ-9去飽和酶多肽(或多個δ-9去飽和酶多肽)的核酸的幾個拷貝可以在其他調(diào)節(jié)元件的控制下，包括釀酒酵母δ-9去飽和酶啟動子、δ-9去飽和酶3'utr/終止子、ole1基因啟動子、菜豆菜豆蛋白3'非翻譯區(qū)、菜豆菜豆蛋白基質(zhì)附著區(qū)，根癌土壤桿菌甘露氨酸合酶啟動子，根癌土壤桿菌orf233'非翻譯區(qū)，木薯葉脈花葉病毒啟動子、根癌土壤桿菌orf13'非翻譯區(qū)、煙草rb7基質(zhì)附著區(qū)，過驅(qū)動(overdrive)、t-鏈邊界序列、lfkcs3啟動子、fae1啟動子、myc標簽和血凝素標簽。還公開了包含與選自seqidno:1的序列至少80％相同的氨基酸序列的δ-9去飽和酶多肽以及編碼這種δ-9去飽和酶多肽的核酸分子，例如seqidno:2。在一些實施方案中，核酸分子和δ-9去飽和酶多肽可以在植物材料、細胞、組織或整個植物中表達，以減少植物材料、細胞、組織或整個植物中的飽和脂肪酸的量(相對于在同一物種的野生型植物中觀察到的量)。本發(fā)明的替代實施方案包括減少植物材料、細胞、組織或整個植物中的飽和脂肪酸的量的方法。這樣的方法可以包括用至少一種上述的核酸分子轉(zhuǎn)化植物材料、細胞、組織或整個植物，使得植物材料、細胞、組織或整個植物中的飽和脂肪酸的量減少。具體實施方案包括用于優(yōu)先降低植物材料，細胞，組織或整個植物中的棕櫚酸和/或硬脂酸的方法。本文公開的方法可以例如在植物或源自植物(例如擬南芥屬植物或卡諾拉)的植物材料中進行。一個具體實施方案涉及用于產(chǎn)生或再生基因工程植物的方法，所述植物與相同物種的野生型植物相比在植物中包含減少量的飽和脂肪酸，所述方法包括用至少一種上述核酸分子轉(zhuǎn)化植物細胞或材料的；并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物材料以獲得植物。還公開了通過任何上述方法獲得的植物、植物材料、植物細胞和種子。ii.縮寫x:yδz含有x個碳原子和位于自羧基端數(shù)起第z位的y個雙鍵的脂肪酸acp?；d體蛋白coa輔酶afa脂肪酸fas脂肪酶合酶fame脂肪酸甲酯kasiiβ-酮脂酰-acp合酶iimufa單不飽和脂肪酸pufa多不飽和脂肪酸wt野生型iii.術(shù)語脂肪酸：如本文中使用的，術(shù)語“脂肪酸”指例如從約c12至c22的不同鏈長的長鏈脂肪族酸(鏈烷酸)，盡管更長和更短鏈長的酸兩者是已知的。脂肪酸的結(jié)構(gòu)以符號x:yδz表示，其中“x”是特定脂肪酸中碳(c)原子的總數(shù)，且“y”是碳鏈中如從該酸的羧基端開始數(shù)起的第“z”位中的雙鍵數(shù)目。代謝途徑：術(shù)語“代謝途徑”指細胞內(nèi)存在的、由酶催化以實現(xiàn)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化或另一代謝途徑啟動的一系列化學(xué)反應(yīng)。代謝途徑可以牽涉幾個或許多步驟，并且可以與不同代謝途徑競爭特定反應(yīng)底物。類似地，一種代謝途徑的產(chǎn)物可以是又一代謝途徑的底物。代謝工程：出于本發(fā)明的目的，“代謝工程”指改變細胞中的一種或多種代謝途徑，使得在細胞中運行的總代謝途徑的總體方案內(nèi)實現(xiàn)將初始底物逐步修飾為具有期望的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的理性策略設(shè)計。去飽和酶：如本文中使用的，術(shù)語“去飽和酶”指可以在一種或多種脂肪酸中去飽和(即，引入雙鍵)以生成感興趣的脂肪酸或前體的多肽。植物可溶性脂肪酸去飽和酶酶可以將雙鍵區(qū)域?qū)Ｒ恍砸腼柡偷孽；?acp底物中。酰基-coa去飽和酶將雙鍵區(qū)域?qū)Ｒ恍砸腼柡偷闹觉；?coa底物中。該反應(yīng)牽涉通過由形成去飽和酶構(gòu)造核心的四螺旋束配位的兩電子還原性二鐵中心活化分子氧。一些實施方案中特別感興趣的是?；?coadelta-9去飽和酶。delta-9-18:01-acp去飽和酶是所有植物維持膜流動性需要的。雖然此酶主要使硬脂酰-acp去飽和，但是它在棕櫚酰-acp的情況中也在微小的程度上有活性。后代植物：為本發(fā)明的目的，“后代植物”指可以通過植物育種方法獲得的任何植物，或自其獲得的植物材料。植物育種方法是本領(lǐng)域中公知的，并且包括天然育種、人工育種、牽涉dna分子標志分析的選擇育種、轉(zhuǎn)基因?qū)W、和商業(yè)育種。植物材料：如本文中使用的，術(shù)語“植物材料”指自植物獲得的任何細胞或組織。核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括rna的有義和反義鏈兩者、cdna、基因組dna、和上述物質(zhì)的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核苷酸、或任一類核苷酸的經(jīng)修飾形式。如本文中使用的，“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義的。該術(shù)語包括dna的單鏈和雙鏈形式。核酸分子可以包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸聯(lián)接連接在一起的天然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸之任一或兩者。核酸分子可以經(jīng)過化學(xué)或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易領(lǐng)會的。此類修飾包括例如標記物、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、帶電荷的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、懸垂的模塊(moiety)(例如，肽)、插入劑(例如，吖啶、補骨脂素，等等)、螯合劑、烷化劑(alkylator)、和經(jīng)修飾的連接(例如，alpha異頭核酸，等等)。術(shù)語“核酸分子”還包括任何拓撲學(xué)構(gòu)象，包括單鏈、雙鏈，部分雙鏈體、三聯(lián)體、發(fā)夾、環(huán)形和掛鎖構(gòu)象?？刹僮鬟B接的：當?shù)谝缓怂嵝蛄性谂c第二核酸序列的功能性關(guān)系中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，若啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，則啟動子與編碼序列可操作連接。在重組生成時，可操作連接的核酸序列一般是連續(xù)的，且在必需連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，在同一閱讀框中。然而，核酸為了可操作連接不需要是連續(xù)的。調(diào)節(jié)元件：如本文中使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”指具有基因調(diào)節(jié)活性的核酸分子；即具有影響可操作連接的可轉(zhuǎn)錄核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯的能力的核酸分子。調(diào)節(jié)元件諸如啟動子、前導(dǎo)物、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是具有基因調(diào)節(jié)活性的非編碼核酸分子，其在活細胞的總體基因表達中發(fā)揮不可或缺的作用。因此，在植物中發(fā)揮功能的分離的調(diào)節(jié)元件可用于經(jīng)由分子工程化技術(shù)修飾植物表型?！罢{(diào)節(jié)元件”意指決定是否表達特定基因、何時表達特定基因、及以何種水平表達特定基因的一系列核苷酸。調(diào)節(jié)dna序列與調(diào)節(jié)蛋白或其它蛋白質(zhì)特異性相互作用。如本文中使用的，術(shù)語“基因調(diào)節(jié)活性”指能夠影響可操作連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸分子。具有基因調(diào)節(jié)活性的分離的核酸分子可以提供可操作連接的核酸分子的時間或空間表達或調(diào)控表達水平和速率。具有基因調(diào)節(jié)活性的分離的核酸分子可以包括啟動子、內(nèi)含子、前導(dǎo)物、或3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。啟動子：如本文中使用的，術(shù)語“啟動子”指牽涉rna聚合酶ii或其它蛋白質(zhì)諸如轉(zhuǎn)錄因子(調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式作用蛋白因子)的識別和結(jié)合以啟動可操作連接的基因轉(zhuǎn)錄的核酸分子。啟動子可以自身含有招致可操作連接的基因轉(zhuǎn)錄的亞元件諸如順式元件或者增強子域?！爸参飭幼印笔窃谥参锛毎泄δ苄缘奶烊坏幕蚍翘烊坏膯幼印？梢允褂弥参飭幼幼鳛?’調(diào)節(jié)元件以調(diào)控一種或多種可操作連接的基因表達。植物啟動子可以以其時間、空間、或發(fā)育表達模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有啟動子的核酸序列。序列同一性：如本文中在兩種核酸或多肽序列的背景中所使用的，術(shù)語“序列同一性”或“同一性”可以指兩種序列中在規(guī)定的比較窗里為了實現(xiàn)最大對應(yīng)性而比對時相同的殘基。兩種核酸序列間或兩種氨基酸序列間的相似性按照序列間共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，兩種序列越相似。用于比對比較序列的方法在下文詳細描述。在提及蛋白質(zhì)使用序列同一性百分比時，認可的是，不相同的殘基位置經(jīng)常相差保守的氨基酸取代，其中氨基酸殘基用具有類似化學(xué)特性(例如，電荷、疏水性或空間效應(yīng))的其它氨基酸殘基取代，并且因此不改變分子的功能特性。因此，在序列相差保守取代時，百分比序列同一性可以向上調(diào)節(jié)以校正不相同殘基位點處取代的保守性質(zhì)。相差此類保守取代的序列被說成具有“序列相似性”或“相似性”。用于進行此調(diào)節(jié)的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。通常，此類技術(shù)牽涉將保守取代評分為部分的，而不是完全的匹配，由此增加百分比序列同一性。例如，在對相同的氨基酸給予0-1的得分，而對非保守取代給予0得分的情況中，對保守取代給予0-1的得分?？梢杂嬎惚Ｊ厝〈牡梅?，例如如程序pc/gene(intelligenetics,mountainview,ca)中執(zhí)行的。如本文中所使用的，術(shù)語“序列同一性百分比”可以指在比對窗里比較兩個最佳比對序列時測定的數(shù)值，其中為了兩個序列的最佳比對，比較窗中序列的部分與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通過測定兩個序列中存在相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比來計算百分比。氨基酸序列中的類似位置：可以通過前述段落中所描述的方法比對核酸和氨基酸序列。在比對時，若各位置在共有序列內(nèi)是相同的，則一個序列中的位置與比對序列中的位置在“類似位置”中。用于比對比較序列的方法是本領(lǐng)域中公知的。各種程序和比對算法記載于：smith和waterman,adv.appl.math.2:482,1981；needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443,1970；pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444,1988；higgins和sharp,gene73:237-44,1988；higgins和sharp,cabios5:151-3,1989；corpet等,nucleicacidsresearch16:10881-10890,1988；huang,等,computerapplicationsinthebiosciences8:155-65,1992；pearson等,methodsinmolecularbiology24:307-31,1994；tatiana等,femsmicrobiol.lett.,174:247-50,1990.altschul等,j.mol.biol.215:403-10,1990(關(guān)于序列比對方法和同源性計算的詳細討論)。美國國家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)基本局部比對搜索工具(blast)在因特網(wǎng)上可獲得(于blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，其與序列分析程序，例如blastp和blastn結(jié)合使用。關(guān)于如何使用此程序測定序列同一性的描述在因特網(wǎng)上經(jīng)由ncbi于blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？cmd＝web&page_type＝blastdocs可獲得。為了比較氨基酸序列，使用缺省參數(shù)采用blast程序的“blast2種序列(blast2sequence)”功能(bl2seq)。特定參數(shù)可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷內(nèi)調(diào)節(jié)，以例如提供錯配罰分或匹配獎勵。經(jīng)轉(zhuǎn)化的：如本文中使用的，術(shù)語“經(jīng)轉(zhuǎn)化的”指已經(jīng)接受外來核酸分子，諸如構(gòu)建體導(dǎo)入的細胞、組織、器官、或生物體?？梢詫?dǎo)入的核酸分子整合入接受細胞、組織、器官或生物體的基因組dna中，使得導(dǎo)入的多核苷酸分子得到后續(xù)后代繼承。“轉(zhuǎn)基因”或“經(jīng)轉(zhuǎn)化”細胞或生物體還包括所述細胞或生物體的后代和自在例如雜交中采用此類轉(zhuǎn)基因植物作為親本的育種程序生成并展現(xiàn)出源自存在外來核酸分子的改變的表型的后代。iv.減少宿主細胞、組織、或生物體中飽和脂肪酸的代謝工程方法a.概述本發(fā)明的一個實施方案包括在植物種子中引入具有特定酰基-coa偏愛(例如，對于棕櫚酸或硬脂酸)的delta-9去飽和酶。delta-9去飽和酶的特定?；?coa偏愛實現(xiàn)對某些特定飽和脂肪酸集合(例如，棕櫚酸酯，用于轉(zhuǎn)化成單不飽和產(chǎn)物)的靶向。選擇?；?coadelta-9去飽和酶來降低植物中的飽和脂肪酸含量，因為它們通常不以任何可察覺的程度在植物系統(tǒng)中生成。b.多肽依照本發(fā)明的一些實施方案的多肽包含如下的氨基酸序列，其在與選自下組的序列比對時顯示增加的百分比同一性：seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33。這些和其它實施方案內(nèi)的特定氨基酸序列可以包含與前述序列具有例如至少約70％,約75％,約80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列。在許多實施方案中，在與前述序列比對時具有前述序列同一性的氨基酸序列編碼具有delta-9-18:0-acp去飽和酶酶促活性的肽，或此類肽的部分。c.核酸一些實施方案包括編碼上文所描述的多肽的核酸分子。例如，一些實施方案中的核酸序列在與選自下組的序列比對是顯示增加的百分比同一性：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25。這些和其它實施方案內(nèi)的特定核酸序列可以包含與選自下組的序列具有例如至少約60％,約65％,約70％,約75％,約80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％,99％或100％同一性的序列：seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:8,seqidno:9,seqidno:10,seqidno:11,seqidno:15,seqidno:16,seqidno:17,seqidno:44,seqidno:45,seqidno:48和seqidno:49。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，可以例如通過依照密碼子簡并性引入可允許的核苷酸取代在不實質(zhì)性改變編碼多肽的氨基酸序列的情況中修飾核酸分子。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含基因調(diào)節(jié)元件(例如，啟動子)。啟動子可以基于會接受載體構(gòu)建體插入的細胞類型選擇。在細菌、酵母和植物中發(fā)揮功能的啟動子是本領(lǐng)域中公知的。啟動子也可以基于其調(diào)節(jié)特征進行選擇。此類特征的例子包括增強轉(zhuǎn)錄活性、可誘導(dǎo)性、組織特異性、和發(fā)育階段特異性。在植物中，已經(jīng)描述了病毒或合成起源的誘導(dǎo)型、組成性活性、時間調(diào)節(jié)性、和空間調(diào)節(jié)性啟動子。見例如poszkowski等(1989)emboj.3:2719；odell等(1985)nature313:810；及chau等(1989)science244:174-81)。有用的誘導(dǎo)型啟動子包括例如由通過應(yīng)用安全劑(取代的苯磺酰胺除草劑)誘導(dǎo)的水楊酸或聚丙烯酸誘導(dǎo)的啟動子、熱休克啟動子、自菠菜硝酸鹽還原酶可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列衍生的硝酸鹽誘導(dǎo)型啟動子、激素誘導(dǎo)型啟動子、和與rubp羧化酶的小亞基和lhcp家族結(jié)合的光誘導(dǎo)型啟動子。有用的組織特異性、發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動子的例子包括β-伴大豆球蛋白(conglycinin)7sα啟動子和種子特異性啟動子。可用于在種子質(zhì)體中優(yōu)先表達的植物功能性啟動子包括那些來自牽涉含油種子中脂肪酸生物合成的蛋白質(zhì)和來自植物儲存蛋白的。此類啟動子的例子包括來自可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列諸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、acp、硬脂酰-acp去飽和酶、和油質(zhì)蛋白的5’調(diào)節(jié)區(qū)。另一種例示性的組織特異性啟動子是種子組織特異性的凝集素啟動子。更具體地說，啟動子可以包括菜豆(phaseolusvulgaris)菜豆蛋白啟動子(單獨的或與菜豆菜豆蛋白3'非翻譯區(qū)和菜豆菜豆蛋白3'基質(zhì)附著區(qū)域聯(lián)用)，lesquerellafendlerikcs3啟動子或根癌土壤桿菌曼甘露氨酸合酶啟動子。其它有用的啟動子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章魚堿合酶啟動子(其在根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒(camv)19s和35s啟動子；增強型camv35s啟動子；玄參花葉病毒35s啟動子；來自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssrubisco)小亞基的光誘導(dǎo)型啟動子；來自煙草的eif-4a啟動子(mandel等,(1995)plantmol.biol.29:995-1004)；玉米蔗糖合成酶；玉米醇脫氫酶i；玉米光收獲復(fù)合物(lightharvestingcompolex)；玉米熱休克蛋白；來自擬南芥的幾丁質(zhì)酶啟動子；ltp(脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白)啟動子；矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶；豆富含甘氨酸的蛋白1；馬鈴薯patatin；泛素啟動子；和肌動蛋白啟動子。優(yōu)選地，有用的啟動子是種子選擇性的、組織選擇性的、或誘導(dǎo)型的。種子特異性調(diào)節(jié)在例如ep0255378中有討論。為了獲得更高的異源基因表達，可以優(yōu)選的是再工程化改造基因，使得它在表達宿主細胞(例如，植物細胞，例如，卡諾拉、稻、煙草、玉米、棉、和大豆)中更有效地表達。因此，設(shè)計植物表達的編碼delta-9去飽和酶的基因中任選的額外步驟(即，在提供一種或多種基因調(diào)節(jié)元件外)是為了最佳表達而再工程化改造異源基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)。具體的實施方案包括再設(shè)計的基因，其經(jīng)過優(yōu)化以提高在轉(zhuǎn)基因卡諾拉植物細胞或擬南芥植物細胞中，而不是在用天然存在的異源基因序列轉(zhuǎn)化的卡諾拉植物細胞或擬南芥植物細胞中的表達水平(即，生成更多蛋白質(zhì))。由于由遺傳密碼的冗余性/簡并性提供的可塑性(即，一些氨基酸由超過一種密碼子規(guī)定)，不同生物體或生物體類中的基因組進化已經(jīng)導(dǎo)致同義密碼子的差別選擇。此“密碼子偏愛”在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的平均堿基組成中得到反映。例如，具有含相當較低g+c含量的基因組的生物體利用更多的在同義密碼子的第三位具有a或t的密碼子，而那些具有較高g+c含量的生物體利用更多的在第三位具有g(shù)或c的密碼子。此外，認為mrna內(nèi)“次要”密碼子的存在可以降低所述mrna的絕對翻譯速率，尤其在與次要密碼子對應(yīng)的帶電荷的trna的相對豐度較低時。此推理的延伸是通過個別次要密碼子降低翻譯速率對于多種次要密碼子至少會是疊加的。因此，在特定表達宿主中具有相對較高次要密碼子含量的mrna會具有相應(yīng)較低的翻譯速率。此速率可以通過編碼蛋白質(zhì)的相應(yīng)低水平反映。在工程化改造編碼delta-9去飽和酶的優(yōu)化基因以在卡諾拉或擬南芥(或其它植物，諸如稻、煙草、玉米、棉或大豆)中表達中，若已經(jīng)測定預(yù)期的宿主植物的密碼子偏愛，則其是有幫助的。存在多種公眾可用的dna序列數(shù)據(jù)庫，其中可以尋找關(guān)于植物基因組的密碼子分布或各種植物基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息。密碼子偏愛是表達宿主(例如，植物，諸如卡諾拉或擬南芥)使用以編碼其蛋白質(zhì)的氨基酸的密碼子的統(tǒng)計學(xué)分布。密碼子偏愛可以以單一密碼子相對所有氨基酸的密碼子的使用頻率計算?；蛘撸艽a子偏愛可以以單一密碼子用于編碼特定氨基酸，相對于所述氨基酸的所有其它密碼子(同義密碼子)的頻率計算。在為delta-9去飽和酶基因的植物表達設(shè)計優(yōu)化的編碼區(qū)中，應(yīng)當確定植物優(yōu)選的主要(“第一選擇”)密碼子，及優(yōu)選密碼子的第二、第三、第四選擇等等(在存在多種選擇時)。然后，可以設(shè)計新的編碼delta-9去飽和酶基因氨基酸序列的dna序列，其中新的dna序列與天然dna序列(編碼去飽和酶)不同之處在于取代編碼宿主優(yōu)選性(第一優(yōu)選性、第二優(yōu)選性、第三優(yōu)選性、或第四優(yōu)選性，等等)密碼子以規(guī)定氨基酸序列內(nèi)每個位置處的氨基酸。然后，對新的序列分析限制酶位點，其可以已經(jīng)通過修飾創(chuàng)建。通過將這些密碼子用下一優(yōu)選性密碼子替換來進一步修飾鑒定的推定限制性位點以除去限制性位點。序列中可以影響異源序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它位點是外顯子:內(nèi)含子接合(5’或3’)、多聚-a添加信號、和/或rna聚合酶終止信號。可以進一步分析序列，并將其進行修飾以降低ta或cg雙聯(lián)體的頻率。在這些雙聯(lián)體外，具有相同的超過約6個g或c核苷酸的序列區(qū)組也可以不利地影響序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。因此，有利地，通過將第一或第二選擇的密碼子，等等用選擇的下一優(yōu)選性密碼子替換來修飾這些區(qū)組。上文所描述的方法使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠修飾對于特定植物而言外來的基因，使得基因在植物中最佳地表達。所述方法在pct申請wo97/13402中進一步例示。如此，可以使用與一些實施方案的去飽和酶/基因在功能上等同的經(jīng)優(yōu)化的合成基因來轉(zhuǎn)化宿主，包括植物。關(guān)于生成合成基因的更多指導(dǎo)可以參見例如美國專利5,380,831。一旦在紙上或在計算機芯片中設(shè)計出經(jīng)植物優(yōu)化的dna序列，可以在實驗室中合成實際的dna分子以在序列上精確對應(yīng)于設(shè)計的序列。可以將此類合成的dna分子克隆，并以其它方式操作，完全就像它們源自自然或天然來源那樣。d.用于遺傳轉(zhuǎn)化植物材料的方法一些實施方案涉及生成包含一種或多種核酸分子的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞的方法，所述核酸分子包含與選自下組的序列至少60％相同的核酸序列：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25。此類核酸分子還可以包含例如非編碼調(diào)節(jié)元件，諸如啟動子。也可以將其它序列與非編碼調(diào)節(jié)元件和可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列一起導(dǎo)入細胞中。這些其它序列可以包含3’轉(zhuǎn)錄終止子、3’多聚腺苷酸化信號、其它非翻譯序列、轉(zhuǎn)運或靶向序列、選擇標志、增強子、和操縱基因。一般地，轉(zhuǎn)化方法包括下列步驟：選擇合適的宿主細胞，用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞。用于將dna導(dǎo)入細胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一般地，這些方法可以分成5類：(1)化學(xué)方法(graham和vandereb(1973)virology54(2):536-9；zatloukal等(1992)ann.n.y.acad.sci.660:136-53)；(2)物理方法，諸如微注射(capechi(1980)cell22(2):479-88)、電穿孔(wong和neumann(1982)biochim.biophys.res.commun.107(2):584-7；fromm等(1985)proc.natl.acad.sci.usa82(17):5824-8；美國專利5,384,253)、和顆粒加速(johnston和tang(1994)methodscellbiol.43(a):353-65；fynan等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(24):11478-82；(3)病毒載體(clapp(1993)clin.perinatol.20(1):155-68；lu等(1993)j.exp.med.178(6):2089-96；eglitis和anderson(1988)biotechniques6(7):608-14)；(4)受體介導(dǎo)的機制(curiel等(1992)hum.gen.ther.3(2):147-54；wagner等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89(13):6099-103)；和(5)細菌介導(dǎo)的機制，諸如用土壤桿菌。或者，可以通過直接注射植物的生殖器官來將核酸直接導(dǎo)入花粉中。zhou等(1983)methodsinenzymology101:433；hess(1987)intern.rev.cytol.107:367；luo等(1988)plantmol.biol.reporter6:165；pena等(1987)nature325:274。其它轉(zhuǎn)化方法包括例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如美國專利5,508,184中例示的。也可以將核酸分子注射入未成熟的胚中。neuhaus等(1987)theor.appl.genet.75:30。最常使用的用于轉(zhuǎn)化植物細胞的方法是：土壤桿菌介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)移方法(fraley等(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803)(如美國專利5,824,877；美國專利5,591,616；美國專利5,981,840；和美國專利6,384,301中例示的)和生物射彈或微粒轟擊介導(dǎo)的方法(即，基因槍)(諸如記載于美國專利5,550,318；美國專利5,538,880；美國專利6,160,208；美國專利6,399,861；和美國專利6,403,865)。通常，核轉(zhuǎn)化是期望的，但是在期望特異性轉(zhuǎn)化質(zhì)體，諸如葉綠體或造粉體的情況中，可以對某些植物物種諸如擬南芥、煙草、馬鈴薯和卡諾拉物種利用期望的核酸分子的微粒介導(dǎo)的遞送來轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。經(jīng)由使用屬于土壤桿菌屬的遺傳工程化土壤細菌實現(xiàn)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。幾種土壤桿菌物種介導(dǎo)轉(zhuǎn)移稱為“t-dna”的特定dna，其可以遺傳工程化改造為將任何期望的dna部分攜帶入許多植物物種中。標記t-dna介導(dǎo)的發(fā)病機制過程的主要事件是：誘導(dǎo)毒力基因、和加工并轉(zhuǎn)移tdna。此過程是許多綜述的主題。見例如ream(1989)ann.rev.phytopathol.27:583-618；howard和citovsky(1990)bioassays12:103-8；kado(1991)crit.rev.plantsci.10:1-32；zambryski(1992)annualrev.plantphysiol.plantmol.biol.43:465-90；gelvin(1993)于transgenicplants,kung和wu編,academicpress,sandiego,ca,第49頁-第87頁；binns和howitz(1994)于bactericalpathogenesisofplantsandanimals,dang編,berlin:springerverlag.,第119-38頁；hooykaas和beijersbergen(1994)ann.rev.phytopathol.32:157-79；lessl和lanka(1994)cell77:321-4；及zupan和zambryski(1995)annualrev.phytopathol.27:583-618。為了對經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞選擇或評分(不管轉(zhuǎn)化方法如何)，導(dǎo)入細胞中的dna可以含有在可再生的植物組織中發(fā)揮功能以生成化合物的基因，所述化合物對植物組織賦予對否則有毒性的化合物的抗性。作為選擇、篩選、或評分標準物使用的感興趣的基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)、綠色熒光蛋白(gfp)、螢光素酶、和抗生素或除草劑耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括賦予對青霉素、卡那霉素(和新霉素、g418、博來霉素)；甲氨蝶呤(和甲氧芐啶)；氯霉素；和四環(huán)素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草劑抗性基因賦予。della-cioppa等(1987)bio/technology5:579-84。也可以執(zhí)行其它選擇裝置，包括例如但不限于對膦絲菌素(phosphinothricin)、雙丙氨磷和正向選擇機制的耐受性(joersbro等(1998)mol.breed.4:111-7)，并且認為在本發(fā)明的實施方案的范圍內(nèi)。然后，可以容許通過選擇或篩選鑒定并在支持再生的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞成熟成植物。目前公開的方法可以與任何可轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織一起使用。如本文中使用的，可轉(zhuǎn)化的細胞和組織包括但不限于能夠進一步增殖以產(chǎn)生植物的那些細胞或組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員認可許多植物細胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，其中在插入外源dna和適當?shù)呐囵B(yǎng)條件后植物細胞或組織可以形成分化的植物。適合于這些目的的組織可以包括但不限于未成熟的胚、小盾(scutellar)組織、懸浮細胞培養(yǎng)物、未成熟的花序、枝分生組織、節(jié)外植體、愈傷組織、下胚軸組織、子葉、根、和葉。自經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物原生質(zhì)體或外植體再生、發(fā)育、和培養(yǎng)植物是本領(lǐng)域中已知的。weissbach和weissbach(1988)methodsforplantmolecularbiology,(編)academicpress,inc.,sandiego,ca；horsch等(1985)science227:1229-31。此再生和生長方法通常包括下列步驟：選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，并將那些細胞培養(yǎng)到胚發(fā)育的通常階段到生根的小植物階段。類似地，再生轉(zhuǎn)基因的胚和種子。在此方法中，一般將轉(zhuǎn)化體在存在選擇培養(yǎng)基的情況中培養(yǎng)，所述選擇培養(yǎng)基選擇成功轉(zhuǎn)化的細胞并誘導(dǎo)植物幼芽(shoot)的再生。fraley等(1993)proc.natl.acad.sci.usa80:4803。這些幼芽通常在2至4個月內(nèi)獲得。此后，將所得的轉(zhuǎn)基因生根幼芽在合適的植物生長培養(yǎng)基諸如土壤中種植?？梢詫⑿颐庥诒┞队谶x擇劑的細胞，或已經(jīng)在篩選測定法中得分為正的細胞在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，可以將幼芽轉(zhuǎn)移至合適的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述根誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有選擇劑和防止細菌生長的抗生素。許多幼芽會形成根。然后，將這些移植至土壤或其它培養(yǎng)基以容許根的繼續(xù)發(fā)育。一般地，如上文概述的方法會根據(jù)采用的特定植物品系而不同，并且因此，方法的細節(jié)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷內(nèi)。再生的轉(zhuǎn)基因植物可以自花傳粉以提供純合轉(zhuǎn)基因植物。或者，可以將自再生的轉(zhuǎn)基因植物獲得的花粉與非轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選地，農(nóng)藝學(xué)重要的物種的近交系雜交。相反，可以使用來自非轉(zhuǎn)基因植物的花粉來給再生的轉(zhuǎn)基因植物傳粉。轉(zhuǎn)基因植物可以將轉(zhuǎn)化的核酸序列傳遞給其后代。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物是在轉(zhuǎn)化的核酸序列方面是純合的，并在有性繁殖后且由于有性繁殖而將所述序列遺傳給所有其后代。可以自由轉(zhuǎn)基因植物生成的種子培養(yǎng)后代。然后，可以將這些其它植物自花傳粉以生成真正的植物育種株系。可以對來自這些植物的后代評估基因表達，等等。可以通過幾種常見的方法諸如western印跡、northern印跡、免疫沉淀、和elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定法)檢測基因表達。也可以對經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物分析導(dǎo)入的dna的存在和由本發(fā)明的核酸分子和氨基酸分子賦予的表達水平和/或脂肪酸譜。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于分析經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的許多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于southern印跡或northern印跡、基于pcr的方法、生物化學(xué)測定法、表型篩選法、田間評估、和免疫診斷測定法。用于特異性轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。已經(jīng)對許多作物，包括但不限于擬南芥屬的成員、棉(棉(gossypiumhirsutum))、大豆(大豆(glycinemax))、花生(落花生(arachishypogaea))、和蕓苔屬的成員描述了使用這些方法的轉(zhuǎn)化和植物再生。已經(jīng)對棉(美國專利5,004,863；美國專利5,159,135；美國專利5,518,908)；大豆(美國專利5,569,834；美國專利5,416,011；mccabe等(1988)biotechnology6:923；christou等(1988)plantphysiol.87:671-4)；(美國專利5,463,174)；花生(cheng等(1996)plantcellrep.15:653-7；mckently等(1995)plantcellrep.14:699-703)；蕃木瓜；和豌豆(grant等(1995)plantcellrep.15:254-8)發(fā)表了主要通過使用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法也是本領(lǐng)域中公知的。已經(jīng)對許多作物，包括但不限于大麥(大麥(hordeumvulgarae))；玉蜀黍(玉蜀黍(zeamays))；燕麥(燕麥(avenasativa))；野茅(野茅(dactylisglomerata))；稻(稻(oryzasativa)，包括印度和日本變種)；高粱(高粱(sorghumbicolor))；甘蔗(甘蔗(saccharumsp))；葦狀羊茅(葦狀羊茅(festucaarundinacea))；草地草(turfgrass)物種(例如，匍莖剪股穎(agrostisstolonifera)、草地早熟禾(poapratensis)、錐穗鈍葉草(stenotaphrumsecundatum))；小麥(小麥(triticumaestivum))；和苜蓿(苜蓿(medicagosativa))描述了使用這些方法的轉(zhuǎn)化和植物再生。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用并修改許多轉(zhuǎn)化方法以對許多感興趣的目標作物生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物?？梢赃x擇任何植物在目前公開的方法中使用。依照本發(fā)明修飾的優(yōu)選的植物包括例如但不限于含有種子植物、擬南芥(arabidopsisthaliana)、琉璃苣(琉璃苣屬(borago)物種)、卡諾拉(canola)(蕓苔屬(brassica)物種)、蓖麻(蓖麻(ricinuscommunis))、可可豆(可可(theobromacacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉屬(gossypium)物種)、兩節(jié)薺屬(crambe)物種、萼距花屬(cuphea)物種、亞麻(亞麻屬物種)、小濱菊屬(lesquerella)和鯨油草(limnanthes)物種、linola、旱金蓮(旱金蓮屬(tropaeolum)物種)、月見草屬(oenothera)物種、橄欖(olive)(木樨欖屬(olea)物種)、棕櫚(油棕屬(elaeis)物種)、花生(花生屬(arachis)物種)、油菜籽(rapeseed)、紅花(紅花屬(carthamus)物種)、大豆(大豆屬(glycine)和野生大豆(soja)物種)、向日葵(向日葵屬(helianthus)物種)、煙草(煙草屬(nicotiana)物種)、斑鳩菊屬(vernonia)物種、小麥(小麥屬(triticum)物種)、大麥(大麥屬(hordeum)物種)、稻(稻屬(oryza)物種)、燕麥(燕麥屬(avena)物種)、高粱(高粱屬(sorghum)物種)、和黑麥(黑麥屬(secale)物種)或禾本科(gramineae)的其它成員。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用并修改許多轉(zhuǎn)化方法以對許多感興趣的目標作物生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。e.轉(zhuǎn)基因種子在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因種子可以包含delta-9去飽和酶多肽，其包含與選自下組的序列至少80％相同的氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32和seqidno:33。在這些和其它實施方案中，轉(zhuǎn)基因種子可以包含與選自下組的序列至少60％相同的核酸序列：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24和seqidno:25。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因種子可以展現(xiàn)出降低的飽和脂肪酸(例如，棕櫚酸脂肪酸和/或硬脂酸脂肪酸)水平?？梢宰阅苡D(zhuǎn)基因植物收獲種子，并可以用于培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的后代世代，包括包含如上文所列的至少一種核酸序列，和任選地至少一種別的感興趣的基因或核酸構(gòu)建體的雜種植物株系。提供以下實施例來例示某些具體的特征和/或?qū)嵤┓桨?。這些實施例不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限于所描述的具體特征或?qū)嵤┓桨?。實施例實施?：pdab7305的構(gòu)建體設(shè)計構(gòu)巢曲霉δ-9去飽和酶(and9ds)酶先前在美國專利申請序列號2008/0260933中公開，在本文中為seqidno:1。合成包含and9dsv3編碼序列的多核苷酸序列(seqidno:2)，并將其引入質(zhì)粒構(gòu)建體pdab7305中用于土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化(圖1)。所得的構(gòu)建體含有三個植物轉(zhuǎn)錄單元(也被描述為基因表達盒，二者可互換使用)。第一植物轉(zhuǎn)錄單元(ptu)(seqidno:3)由rb7基質(zhì)附著區(qū)(rb7mar；國際專利申請?zhí)杦o9727207)、菜豆菜豆蛋白啟動子(pvphas啟動子；美國專利號5,504,200)、and9ds編碼序列(anδ9去飽和酶v3)、菜豆菜豆蛋白3'非翻譯區(qū)(pvphas3'utr；美國專利號5,504,200)和菜豆菜豆蛋白3'基質(zhì)附著區(qū)(pvphas3'mal；美國專利號5,504,200)構(gòu)成。第二個ptu(seqidno:4)由lesquerellafendlerikcs3啟動子(lfkcs3啟動子；美國專利號7,253,337)、and9ds編碼序列(anδ9去飽和酶v3)和根癌土壤桿菌orf233'非翻譯區(qū)(atuorf233'utr；美國專利號5,428,147)構(gòu)成。第三個ptu(seqidno:5)由根癌土壤桿菌甘露氨酸合酶啟動子(atumas啟動子；barker,r.f.,idler,k.b.,thompson,d.v.,kemp,j.d.,(1983),apolynucleotidesequenceofthet-dnaregionfromtheagrobacteriumtumefaciensoctopinetiplasmidpti15955,plantmolecularbiology,2(6),335-50)、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(pat；wohlleben等，(1988)gene，70：25-37)、和根癌土壤桿菌orf13'非翻譯區(qū)(atuorf13′utr；huangetal.,(1990)j.bacteriol.,172:1814-1822)構(gòu)成。通過限制酶消化和測序證實該構(gòu)建體。最后，將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌中并作為甘油儲儲存。實施例2：土壤桿菌介導(dǎo)的對卡諾拉(brassicanapus)下胚軸的轉(zhuǎn)化土壤桿菌制備使用含有pdab7305二元質(zhì)粒的土壤桿菌菌株在含有鏈霉素(100mg/ml)和壯觀霉素(50mg/ml)的yep培養(yǎng)基(bactopeptonetm(20.0g/l)和酵母提取物(10.0g/l))板上劃線，并于28℃溫育2天。使用無菌接種環(huán)從2日劃線平板上刮取含有pdab7305二元質(zhì)粒經(jīng)增殖的土壤桿菌菌株。然后將刮下的含有pdab7305二元質(zhì)粒的土壤桿菌菌株接種入150ml進入無菌500ml帶有擋板的燒瓶中的具有鏈霉素(100mg/ml)和壯觀霉素(50mg/ml)的改良yep液體中，并以200rpm于28℃搖動。將培養(yǎng)物離心后重懸在m-培養(yǎng)基(ls鹽；3％葡萄糖；改良的b5維生素；1μm細胞分裂素；1μm2,4-d；ph5.8)中，并稀釋至合適的濃度(50個klett單位，用分光光度計測得)，之后轉(zhuǎn)化卡諾拉下胚軸?？ㄖZ拉轉(zhuǎn)化：種子萌發(fā)：將卡諾拉種子(品種nexera710tm)在10％clorox中表面滅菌10分鐘，并用無菌蒸餾水漂洗三次(在該過程中種子盛放在鋼制濾網(wǎng)中)。將種子種植在phytatraytm中含有的1/2ms卡諾拉培養(yǎng)基(1/2ms、2％蔗糖、0.8％瓊脂)(每個phytatraytm為25粒種子)上以進行萌發(fā)，并放置在設(shè)置為25℃和16小時光照/8小時黑暗光周期的生長方案的percivaltm生長室中5天以供萌發(fā)。預(yù)處理：在第5天，在無菌情況下切出長度約3mm的下胚軸節(jié)段，棄去剩余的根和芽部分(通過在切出過程期間將下胚軸節(jié)段浸入10ml無菌milliqtm水中來防止它們干燥)。在具有設(shè)置為22-23℃和16小時光照/8小時黑暗光周期的生長方案的percivaltm生長室中預(yù)處理前，將下胚軸節(jié)段在無菌濾紙上在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基msk1d1(ms；1mg/l細胞分裂素；1mg/l2,4-d；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂(phytagar))上水平放置3天。與土壤桿菌的共培養(yǎng)：在土壤桿菌共培養(yǎng)前一天，用含有pdab7305二元質(zhì)粒的土壤桿菌菌株接種含有合適抗生素的yep培養(yǎng)基的燒瓶。將下胚軸節(jié)段從濾紙愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基msk1d1轉(zhuǎn)移至含有10ml液體m培養(yǎng)基的空100x25mmpetritm培養(yǎng)皿，以防止下胚軸節(jié)段干燥。在此階段使用刮刀舀出節(jié)段，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基。用移液管除去液體m培養(yǎng)基，并將40ml土壤桿菌懸浮液添加至petritm培養(yǎng)皿(500個段及40ml土壤桿菌溶液)。將各下胚軸節(jié)段在周期性渦旋振蕩下胚軸節(jié)段培養(yǎng)皿的條件下處理30分鐘，使得下胚軸在土壤桿菌溶液中保持浸沒。在處理期結(jié)束時，將土壤桿菌溶液移液入廢物燒杯中，用高壓滅菌器處理，并棄去(將土壤桿菌溶液完全除去以放置土壤桿菌生長過度)。將經(jīng)處理的下胚軸用鑷子返回轉(zhuǎn)移至含有用濾紙覆蓋的msk1d1培養(yǎng)基的初始平板，注意確保各節(jié)段不干燥。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的下胚軸節(jié)段與未轉(zhuǎn)化的對照下胚軸節(jié)段一起放回到降低光強(通過用鋁箔覆蓋平板)下的percivaltm生長室，并將經(jīng)處理的下胚軸節(jié)段與土壤桿菌共培養(yǎng)3天。在選擇培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)：在共培養(yǎng)3天后，將下胚軸節(jié)段用鑷子個別地轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基msk1d1h1(ms；1mg/l細胞分裂素；1mg/l2,4-d；0.5g/lmes；5mg/lagno3；300mg/l特美汀(timentin)；200mg/l羧芐西林(carbenicillin)；1mg/lherbiacetm；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂)上，生長方案設(shè)定為22-26℃。將下胚軸節(jié)段在培養(yǎng)基上錨定，但是不深埋到培養(yǎng)基中。選擇和芽再生：在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7天后，將生成愈傷組織的(callusing)下胚軸段轉(zhuǎn)移至具有選擇的芽再生培養(yǎng)基1msb3z1h1(ms；3mg/lbap；1mg/l玉米素；0.5gm/lmes；5mg/lagno3；300mg/l特美汀tm；200mg/l羧芐西林；1mg/lherbiace；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂)上。在14天后，將已發(fā)出芽的下胚軸節(jié)段轉(zhuǎn)移至具有增強的選擇的再生培養(yǎng)基2msb3z1h3(ms；3mg/lbap；1mg/l玉米素；0.5gm/lmes；5mg/lagno3；300mg/l特美汀tm；200mg/l羧芐西林；3mg/lherbiacetm；3％蔗糖；0.7％植物瓊脂)，生長方案設(shè)定為22-26℃。芽伸長：在14天后，將具有已生發(fā)芽的下胚軸節(jié)段從再生培養(yǎng)基2轉(zhuǎn)移至芽伸長培養(yǎng)基msmesh5(ms；300mg/l特美汀tm；5mg/lherbiacetm；2％蔗糖；0.7％tc瓊脂)，生長方案設(shè)定為22-26℃。從下胚軸節(jié)段分離已經(jīng)伸長的芽，并轉(zhuǎn)移至msmesh5。14天后，將在伸長培養(yǎng)基的第一輪培養(yǎng)中未伸長的剩余芽轉(zhuǎn)移到新鮮的芽延長培養(yǎng)基msmesh5。在這個階段，丟棄所有剩下的未產(chǎn)生芽的下胚軸片段。根誘導(dǎo)：在芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天后，將分離的芽轉(zhuǎn)移至msmest培養(yǎng)基(ms；0.5g/lmes；300mg/l特美汀tm；2％蔗糖；0.7％tc瓊脂)以在22-26℃進行根誘導(dǎo)。將任何在第一次轉(zhuǎn)移msmest培養(yǎng)基的過程中在溫育后未生根的芽轉(zhuǎn)移到msmest培養(yǎng)基上的第二或第三輪溫育，直至芽生出根。pcr分析：經(jīng)轉(zhuǎn)化的卡諾拉下胚軸片段再生成有根的芽后，用pcr分子確認測定法對其進一步分析。從綠芽獲得葉組織，通過pcr測試是否存在pat選擇標志物基因。丟棄任何褪綠芽，不進行pcr分析。鑒定為pat選擇標志物基因存在為陽性的樣品在msmest培養(yǎng)基上保存并培養(yǎng)，以繼續(xù)發(fā)出和伸長芽和根。丟棄根據(jù)pcr分析鑒定為陰性不含pat選擇標志物基因的樣品。將包含選擇標志物基因存在pcr陽性的芽和根的經(jīng)轉(zhuǎn)化的卡諾拉植物移植到溫室中的土壤中?？ㄖZ拉植物在土壤中定植之后，進一步分析卡諾拉植物，通過invadertm定量pcr測定法和southern印跡法定量pat基因表達盒的拷貝數(shù)。證實含有至少一個pat基因表達盒拷貝的轉(zhuǎn)基因t0卡諾拉植物推進進一步分析種子脂肪酸譜。通過fame分析方法分析從這些轉(zhuǎn)基因t0卡諾拉植物獲得的種子(即t1卡諾拉種子)，以鑒定與對照植物相比總飽和脂肪酸減少的事件(總飽和脂肪酸含量通過將所有飽和脂肪酸，包括短鏈和長鏈脂肪酸加和來確定)。實施例3：從轉(zhuǎn)基因pdab7305卡諾拉植物獲得的t1卡諾拉種子的fame分析對于發(fā)生分離的(segregating)t1卡諾拉種子，通過fame分析方法分析以鑒定這樣的t0卡諾拉事件：其產(chǎn)生的t1卡諾拉種子的總飽和脂肪酸(c14:0，c16：0，c18：0，c20:0，c22:0，c24:0)與從相同條件下生長的對照植物獲得的種子相比降低。對所有總飽和脂肪酸(tsfa)的總和進行定量，并與陰性對照植株進行比較。使用下面描述的方案對單個t1卡諾拉種子完成fame分析。對來自每個單獨的卡諾拉t0事件的總共24個單一t1卡諾拉種子進行測定，并且對來自每個個體的tsfa結(jié)果進行定量。使用鋼球磨機將單一卡諾拉種子樣品在庚烷中均質(zhì)化，其中庚烷中含有十七烷酸三甘酯(triheptadecanoin)(nu-chekprep)作為三酰基甘油內(nèi)標。在均質(zhì)化之前，加入0.25m新鮮制備的甲醇鈉(sigma-aldrich，st.louis，mo)在甲醇中的溶液。萃取在40℃恒定震搖下進行。內(nèi)源性脂肪酸回收率用甲基化的替代物c17脂肪酸的回收率來歸一化。重復(fù)3次fame(脂肪酸甲酯)萃取，將庚烷層合并后分析。所得的fame通過gc-fid進行分析，使用來自sge的毛細管柱bpx70(15m×0.25mm×0.25μm)。根據(jù)保留時間鑒定每種fame，并通過注入來自matreyallc(pleasantgap，pa)菜籽油參考預(yù)混物作為校準標準，同時添加適當?shù)拈L鏈脂肪酸(nu-chekprep，elysianmn)，來加以定量。大批種子分析由50mg等分試樣(10至15個種子組合)組成，并按照上述相同方案加以少許修改后實施。為了推動衍生化反應(yīng)完全，首先用庚烷萃取油三次。然后，將合并的油提取物的對應(yīng)于1個種子的等分試樣如上述單種子方案所述衍生化成fame。通過在第四次萃取/衍生化中檢查內(nèi)源fame的存在來驗證反應(yīng)的完全性?；诒砻髋c對照油菜植物tsfa相比顯著減少的fame結(jié)果，鑒定并選擇了三個轉(zhuǎn)基因卡諾拉事件(事件2182[12]-138.001，事件2182[12]-125.001和事件2182[12]-156.001)推進到t1代。測定了另外兩個植物脂肪酸內(nèi)含物范疇。這些范疇包括單不飽和脂肪酸(mufa：c16:1，c18:11和c20:11)和多不飽和脂肪酸(pufa：c18:12和c18:13)濃度，列出這些范疇以顯示t1種子中降低的tsfa的效果(表1)。表1：與幾個nexera710tm非轉(zhuǎn)化對照植物相比，從三個轉(zhuǎn)基因卡諾拉事件獲得的單個t1種子tsfa、mufa和pufa含量總結(jié)。n*表示對每個植物后代分析的單t1種子的數(shù)量。與nexera710tm非轉(zhuǎn)化對照植物相比，轉(zhuǎn)基因卡諾拉事件的平均tsfa顯著降低。在tsfa的降低的同時，觀察到mufa含量(c18:1和c16:1)的增加。mufa含量的增加是and9ds過表達而在飽和脂肪酸自羧酸官能團起的第9個碳(δ9)處引入雙鍵的直接結(jié)果。有趣的是，pufa含量并未隨著磷酸甘油酯去飽和酶fad2的合成c18:2的底物mufa的積累而增加。將t1卡諾拉植物事件在溫室中生長并自受精，以將滲入的轉(zhuǎn)基因固定在后代植物中。對來自每個轉(zhuǎn)基因事件的多個t1卡諾拉植物完成了invadertm定量pcr檢測。這些結(jié)果表明，從三個事件中獲得的t1卡諾拉植物均含有約2或3個拷貝的pdab7305t鏈整合(圖3頂部小圖)。無法具體確定拷貝數(shù)，因為pdab7305t鏈整合體在三個事件中以不同的拷貝數(shù)分離。讓t1卡諾拉植物事件在溫室中生長成熟并自受精。收獲產(chǎn)生的t2卡諾拉種子用于通過fame測定法進行脂肪酸譜分析。實施例4：從轉(zhuǎn)基因pdab7305卡諾拉植物獲得的t2卡諾拉種子的fame分析通過先前描述的fame分析方法分析大批t2卡諾拉種子，以鑒定與對照植物(nexera710tm)相比總飽和脂肪酸有所減少的t1卡諾拉植物株系(圖2)。每株植物的產(chǎn)量作為每株植物的種子克數(shù)記錄。將產(chǎn)量結(jié)果與含有穩(wěn)定整合的構(gòu)巢曲霉δ-9去飽和酶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因陽性對照事件218-11.30(參見wo2006/042049)(本文也描述為218-11.30hs50或218-11.30hl)的產(chǎn)量進行比較，對照植物與本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物一起種植。218-11.30植物和本主題公開的轉(zhuǎn)基因卡諾拉植物都表達相似的轉(zhuǎn)基因。然而，本主題公開中用于轉(zhuǎn)化2182[12]-125.sx001、2182[12]-138.sx001和2182[12]-156.sx00卡諾拉植物的構(gòu)建體是不同的，因為它包含第二個ptu，該ptu由lesquerellafendlerikcs3啟動子及該啟動子驅(qū)動表達的and9ds編碼序列組成，并且被根癌土壤桿菌orf233'非翻譯區(qū)所側(cè)翼。定量對本主題公開的轉(zhuǎn)基因植物的tsfa(％)，并與從陽性對照218-11.30hl轉(zhuǎn)基因卡諾拉植物和陰性對照nexera710tm植物獲得的tsfa(％)進行比較。鑒別出少數(shù)本主題公開的轉(zhuǎn)基因植物含有較高水平的tsfa，其水平近似于陰性對照的nexera710tm植物。這些植物是由于轉(zhuǎn)基因在自受精期間發(fā)生分離而產(chǎn)生的同胞無效體(siblingnulls)，并且不包含任何積極表達的本主題公開的轉(zhuǎn)基因的拷貝。這些結(jié)果證實，在鑒別出t1卡諾拉植物中，大批t2卡諾拉種子的總飽和脂肪酸含量降低到3.5％以下。進一步分析t2卡諾拉株系，以確定哪一個卡諾拉株系含有低拷貝數(shù)的pdab7305t鏈整合體，并產(chǎn)生高t2種子產(chǎn)量。(圖3)。選擇這樣的本主題公開的卡諾拉植物個體：含有的tsfa少于3.5％，產(chǎn)生的產(chǎn)量超過10g，并且含有的t鏈拷貝數(shù)最低?；谶@三個標準(tsfa水平低于3.5％，高種子產(chǎn)量和低拷貝數(shù))，選擇了七個卡諾拉植物并推進以進一步表征tsfa譜。使用invaderassay從每個t1株系的一個植物確定拷貝數(shù)。表2。將這些t2卡諾拉植物株系轉(zhuǎn)移到溫室，生長成熟并自受精。進一步分析t2卡諾拉植物株系，并通過fame測定法收獲t3種子進行脂肪酸譜分析。表2：列出了基于最高產(chǎn)量(種子重量)，最低pat拷貝數(shù)(t1植物)和最低tsfa選擇的t2卡諾拉株系。實施例5：t2卡諾拉株系的分子確認對于選出的含有pat基因表達盒(和緊密連鎖的and9ds基因表達盒)的t2卡諾拉事件，使用定量pcr和southern印跡分析表征分子整合模式。通過水解探針測定法確認and9ds整合通過水解探針測定證實and9ds基因表達盒的存在。首先通過水解探針測定(類似于taqmantm)篩選分離的t2卡諾拉植物，以確認pat轉(zhuǎn)基因的存在。從這些研究中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)用于確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，并用于選擇用于回交和推進到后代的轉(zhuǎn)基因卡諾拉事件。將組織樣品收集在96孔板中，使用klecotm組織粉碎機和不銹鋼珠(hooverprecisionproducts，cumming，ga)，在qiagenrlttm緩沖液中進行組織浸漬。在組織浸漬后，根據(jù)制造商的建議方案，使用biosprint96tm植物試劑盒(qiagen，germantown，md)以高通量形式分離基因組dna?；蚪Mdna用quant-itpicogreendnaassaykittm(molecularprobes，invitrogen，carlsbad，ca)定量。使用biorobot3000tm自動液體處理器(qiagen，germantown，md)，將定量后的基因組dna調(diào)節(jié)至約2ng/μl用于水解探針測定。通過使用480系統(tǒng)(rocheappliedscience，indianapolis，in)的實時pcr進行類似于測定的水解探針測定的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)確定。使用probedesignsoftware2.0設(shè)計用于pat和內(nèi)部參考基因hmg1(weng等(2005).j.aoacint.88(2):577-84)的測定。為了擴增，在10μl體積多重反應(yīng)中制備1×終濃度的480探針主混合物(含有0.4μm的每種用于and9ds和pat的引物，和0.2μm的每種探針)(表3)。進行兩步擴增反應(yīng)，在60℃下延伸40秒，捕獲熒光。運行所有樣品，并將平均循環(huán)閾值(ct)值用于每個樣品的分析。實時pcr數(shù)據(jù)的分析使用相對量化模塊使用軟件版本1.5進行，并基于δδct方法。對照包括：來自單一拷貝校準品的基因組dna樣品，以及每次運行中包括的已知的二拷貝檢查品。表4列出了水解探針測定的結(jié)果。使用qpcr測定從每個t1株系的n株(并平均，給出表4中的值)確定拷貝數(shù)。表3：用于pat和內(nèi)部參考(hmg1)的水解探針測定的引物和探針序列。表4:利用水解探針測定法確定的and9ds事件(t2植物)的拷貝量結(jié)果水解探針測定的結(jié)果確定了兩個株系(2182[12]-138.sx001.sx094和2182[12]-138.sx001.sx090)，其具有與陽性對照植物(218-11.30(hl))相當?shù)南鄬藴势?如表4所示為sd)和變異系數(shù)(如表4所示為cv％)的組合。218-11.30(hl)對照植物先前被鑒定為含有兩個固定拷貝的and9ds基因插入(wo2006042049)。通過將選定的卡諾拉株系(2182[12]-138.sx001.sx094和2182[12]-138.sx001.sx090)與218-11.30(hl)對照植物進行比較，鑒定出將會含有固定拷貝的pdab7305t鏈整合體的特定卡諾拉株系。通過southern印跡分析確認and9ds基因組整合。使用southern印跡分析建立證明t鏈dna片段的整合模式，并鑒定含有全長and9ds基因表達盒的卡諾拉株系。產(chǎn)生了可證明在卡諾拉基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)基因插入物的整合和完整性的數(shù)據(jù)。使用特異于and9ds基因表達盒的pcr擴增探針進行詳細的southern印跡分析。該探針與經(jīng)過特異性限制酶消化的基因組dna的雜交鑒定出具有特定分子量的基因組dna片段，用這些片段的模式來表征用于推進到下一代的轉(zhuǎn)基因事件。將組織樣品收集在2ml錐形管中并凍干2天。用kleckotm組織粉碎機和鎢珠進行組織浸漬。在組織浸漬后，使用ctab分離程序分離基因組dna。使用qiagengenomictipstm試劑盒進一步純化基因組dna。用quant-itpicogreendnatm測定試劑盒(molecularprobes，invitrogen，carlsbad，ca)定量基因組dna。將經(jīng)定量的基因組dna調(diào)節(jié)至一致的濃度。對于每個樣品，用限制酶bamhi(newenglandbiolabs，beverley，ma)充分消化4μg基因組dna。使用quickprecipitationsolutiontm(edgebiosystems，gaithersburg，md)，根據(jù)制造商的建議方案通過沉淀來濃縮消化的dna。然后將基因組dna在65℃下重懸浮于25μl水中1小時。將重懸浮的樣品加載到1xtae中制備的0.8％瓊脂糖凝膠上，并以1.1v/cm在1xtae緩沖液中電泳過夜。對凝膠依次進行變性(0.2mnaoh/0.6mnacl)30分鐘，及中和(0.5mtris-hcl(ph7.5)/1.5mnacl)30分鐘。利用層析紙捻和紙巾，使20xssc溶液被動地穿透凝膠吸引到經(jīng)處理的immobilontmny+轉(zhuǎn)移膜(millipore，billerica，ma)上，來將dna片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，將膜用2xssc短暫洗滌，與stratalinkertm1800(stratagene，lajolla，ca)交聯(lián)，并在80℃下真空烘烤3小時。使用400型雜交培養(yǎng)箱(robbinsscientific，sunnyvale，ca)，將印跡與預(yù)雜交溶液(perfecthybplus，sigma，st.louis，mo)在65℃下在玻璃滾瓶中溫育1小時。從含有整個編碼序列的pcr片段制備探針。使用qiaexiigelextractionkittm純化pcr擴增子，并用digdnalabelingkittm(rocheappliedbiosciencse，indianapolis，in)標記。印跡在65℃下雜交過夜，變性探針直接加入到雜交緩沖液中。雜交后，在65℃用0.1×ssc/0.1％sds依次洗滌印跡40分鐘。最后，將印跡暴露于儲磷成像屏，并使用moleculardynamicsstorm860tm成像系統(tǒng)成像。本研究中完成的southern印跡分析用于確定拷貝數(shù)，并確認所選擇的事件在卡諾拉基因組中含有and9ds基因表達盒。表5提供了來自基于上述表2中定義的標準選定的株系的多個t2植物的條帶分布。對照株系不含有選擇標志物，這確認了pcr數(shù)據(jù)。從三個事件中選擇的大多數(shù)株系顯示均一的條帶模式(數(shù)目和大小)，除了來自事件2182[12]-125.sx001.sx014的株系外。事件2182[12]-138.sx001的所有三個t2系顯示具有一致條帶模式的t2群體。表5：對來自四個轉(zhuǎn)基因事件的多個t2卡諾拉株系以及nexera710tm卡諾拉對照植物完成的southern分析的概述。通過與在瓊脂糖凝膠上樣品旁邊運行的已知標準品進行比較來確定每個樣品的觀察到的條帶的大小。實施例6：選定的卡諾拉株系的t3種子產(chǎn)量來自t2卡諾拉株系的選定植物在溫室中生長成熟。從植物收獲種子。清洗種子，并確定每個t2卡諾拉株系的種子產(chǎn)量(表6)。將來自每一株系的種子的產(chǎn)量與來自在相同條件下生長的未轉(zhuǎn)化的對照植物(nexeratm710gs)獲得的種子的產(chǎn)量進行比較。表6給出了從每個t2卡諾拉株系獲得的不同植物的產(chǎn)量結(jié)果。這些結(jié)果表明，測試的每個植物和株系的產(chǎn)量是可變的。但是t2卡那拉株系的平均產(chǎn)量(2182[12]-125.sx001.sx014,2182[12]-138.sx001.sx085、2182[12]-138.sx001.sx090、2182[12]-138.sx001.sx094、和2182[12]-156.sx001.sx049)相對近似，并且沒有顯著偏離對照植物(nexeratm710g5和218-11.30(hl))。表6：來自卡諾拉轉(zhuǎn)基因品株系和未轉(zhuǎn)化的nexeratm710gs對照植物的種子產(chǎn)量(以總克數(shù)計)的annova分析。括號中連接相同字母的植物產(chǎn)量結(jié)果沒有顯著差異(p<0.05)。事件/株系植物數(shù)比例產(chǎn)量(g)218-11.30(hl)120.061865.7233333(a,b)2182[12]-125.sx001.sx014350.180415.9874286(a,b)2182[12]-138.sx001.sx085340.175266.8394118(a)2182[12]-138.sx001.sx090330.170106.4887879(a,b)2182[12]-138.sx001.sx094350.180415.0302857(b)2182[12]-156.sx001.sx049330.170106.3715152(a,b)nexeratm710g5120.061867.1666667(a,b)總計1941.00000---實施例7：從轉(zhuǎn)基因pdab7305卡諾拉植物獲得的t3卡諾拉種子的fame分析通過先前描述的fame分析方法分析單個和大批的t3卡諾拉種子，以表征各株系的脂肪酸譜，從而鑒定與對照植物相比導(dǎo)致總飽和脂肪酸減少的特定株系。定量總飽和脂肪酸的總和，并與陽性對照和陰性對照植物進行比較。結(jié)果證實，在所選的卡諾拉植物株系中，單個和大批t3卡諾拉種子的總飽和脂肪酸和飽和脂肪酸(由棕櫚酸和硬脂酸含量之和確定)含量降低到3.5％以下。令人驚訝的是，兩個株系，2182[12]-138.sx001.sx085和2182[12]-138.sx001.sx094，積累的tsfa水平平均在3.0％以下。首次描述了由包含小于3.0％飽和脂肪酸的大批種子構(gòu)成的卡諾拉株系。表7和表8。此外，將一個亞組的卡諾拉株系用于種子fame分析，以確定在單個卡諾拉種子中能夠獲得的總飽和脂肪酸和飽和脂肪酸水平的最低水平。從基于大批種子的最低總飽和脂肪酸以及高水平的植物產(chǎn)量選擇出的卡諾拉株系獲得種子，用于單種子fame分析。使用fame方法，每個株系分析總共288個個體種子。分析的總結(jié)見表9。來自所選植物的所有單種子的平均tsfa低于2.8％，明顯低于3.5％的tsfa水平。在單種子卡諾拉的水平上，最低的tsfa水平為2.25％。這顯著低于nexeratm710g5對照植物獲得的tsfa水平5.11％。最后，轉(zhuǎn)基因卡諾拉株系中tsfa的最大百分比不超過3.5％，單種子的平均飽和水平為2.52％，遠低于3.5％。表9和圖4。表7顯示了與未轉(zhuǎn)化的nexeratm710g5對照和轉(zhuǎn)化的218-11.30(hl)陽性對照植物相比，5個遺傳上均一的卡諾拉株系群體的t2成熟種子大批fame分析的分布。求出所有個體測量值(n)的平均值，以代表卡諾拉植物群體的tsfa和飽和百分比。用粗體字標明了2182[12]-138.sx001.sx085和2182[12]-138.sx001.sx094，因為這兩個株系的平均tsfa百分比低于3.00％。表7表8顯示了與nexeratm710g5對照相比，從事件2182[12]-138.sx001獲得的單個t2后代植物的最低t3成熟種子大批fame和植物產(chǎn)量。顯示的結(jié)果是油的百分比、tsfa的百分比、飽和脂肪酸的百分比(通過總結(jié)棕櫚酸和硬脂酸含量確定)和種子產(chǎn)量。表8表9顯示了來自選定的t2株系的t3單種子fame分析結(jié)果的分布。與在相該表顯示tsfa和飽和脂肪酸百分比的平均值(平均值)、最小值(最小)和最大值(最大)，與同條件下生長的nexeratm710g5對照卡諾拉籽植物相比。相比于nexeratm710g5對照卡諾拉植物，所選事件的t3種子中的總飽和脂肪酸(tsfa)和飽和脂肪酸水平均有降低。表9序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司d·j·加喬迪p·a·o·默洛m·a·湯普森t·a·沃爾什b·r·威爾遜m·維爾特<120>具有少于3.5%的總飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因卡諾拉的生成<130>71671<160>33<170>patentinversion3.5<210>1<211>455<212>prt<213>構(gòu)巢曲霉<400>1metseralaprothralaaspileargalaargalaproglualalys151015lysvalhisilealaaspthralaileasnarghisasntrptyrlys202530hisvalasntrpleuasnvalpheleuileileglyileproleutyr354045glycysileglnalaphetrpvalproleuglnleulysthralaile505560trpalavaliletyrtyrphephethrglyleuglyilethralagly65707580tyrhisargleutrpalahiscyssertyrseralathrleuproleu859095argiletrpleualaalavalglyglyglyalavalgluglyserile100105110argtrptrpalaargasphisargalahishisargtyrthraspthr115120125asplysaspprotyrservalarglysglyleuleutyrserhisleu130135140glytrpmetvalmetlysglnasnprolysargileglyargthrasp145150155160ileseraspleuasngluaspprovalvalvaltrpglnhisargasn165170175tyrleulysvalvalphethrmetglyleualavalprometleuval180185190alaglyleuglytrpglyasptrpleuglyglyphevaltyralagly195200205ileleuargilephephevalglnglnalathrphecysvalasnser210215220leualahistrpleuglyaspglnpropheaspaspargasnserpro225230235240argasphisvalilethralaleuvalthrleuglygluglytyrhis245250255asnphehishisglupheproserasptyrargasnalaileglutrp260265270hisglntyraspprothrlystrpseriletrpalatrplysglnleu275280285glyleualatyraspleulyslyspheargalaasngluileglulys290295300glyargvalglnglnleuglnlyslysleuasparglysargalathr305310315320leuasptrpglythrproleuaspglnleuprovalmetglutrpasp325330335asptyrvalgluglnalalysasnglyargglyleuvalalaileala340345350glyvalvalhisaspvalthrasppheilelysasphisproglygly355360365lysalametileserserglyileglylysaspalathralametphe370375380asnglyglyvaltyrtyrhisserasnalaalahisasnleuleuser385390395400thrmetargvalglyvalileargglyglycysgluvalgluiletrp405410415lysargalaglnlysgluasnvalglutyrvalargaspglysergly420425430glnargvalileargalaglygluglnprothrlysileproglupro435440445ileprothralaaspalaala450455<210>2<211>1368<212>dna<213>人工序列<220><223>編碼構(gòu)巢曲霉delta9去飽和酶v3的合成核苷酸<400>2atgtctgctccaaccgctgacatcagggctagggctccagaggctaagaaggttcacatc60gctgataccgctatcaacaggcacaattggtacaagcacgtgaactggctcaacgtcttc120ctcatcatcggaatcccactctacggatgcatccaagctttctgggttccacttcaactc180aagaccgctatctgggctgtgatctactacttcttcaccggacttggaatcaccgctgga240taccacaggctttgggctcactgctcatactctgctactcttccacttaggatctggctt300gctgctgttggaggaggagctgttgagggatctatcagatggtgggctagggatcacagg360gctcatcataggtacaccgataccgacaaggacccatactctgttaggaagggacttctc420tactctcaccttggatggatggtgatgaagcagaacccaaagaggatcggaaggaccgac480atctctgatctcaacgaggacccagttgttgtttggcaacacaggaactacctcaaggtt540gtgttcaccatgggacttgctgttccaatgcttgttgctggacttggatggggagattgg600cttggaggattcgtgtacgctggaatccttaggatcttcttcgttcaacaagctaccttc660tgcgtgaactctcttgctcactggct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