專利名稱：低飽和脂肪向日葵及相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的且獨(dú)特的向日葵以及相關(guān)方法，所述向日葵產(chǎn)生低飽和脂肪和任 選地高亞油酸的種子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有草甘膦(glyphosate)抗性的非遺傳修飾的、 非誘變的向日葵及相關(guān)方法。
背景技術(shù)：
栽培的向日葵(Helianthus annuus L.)是植物油的全球主要來(lái)源。在美國(guó)，每年 種植約四百萬(wàn)英畝向日葵，主要在達(dá)科他州(Dakotas)和明尼蘇達(dá)州(Minnesota)。在過去十年里美國(guó)的向日葵種植面積非?？焖俚臄U(kuò)張部分是由于向日葵育種和 品種改良領(lǐng)域中的數(shù)項(xiàng)重要的發(fā)展。一個(gè)重大的發(fā)展是胞質(zhì)雄性不育和育性恢復(fù)基因的發(fā) 現(xiàn)，即一項(xiàng)容許產(chǎn)生雜種向日葵的發(fā)現(xiàn)。在上世紀(jì)70年代早期期間引入了如此產(chǎn)生的雜 種。Fick, "Breeding and Genetics,，， 于 Sunflower Science and Technology279-338(J. F. Carter編1978)提出了向日葵中胞質(zhì)雄性不育(CMS)和遺傳育性 恢復(fù)的描述。向日葵油主要包含棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亞油酸(18:2)和 亞麻酸(1 8:3)。雖然植物中存在其它不常見的脂肪酸，但是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、 和亞麻酸構(gòu)成植物油的世界產(chǎn)量中存在的脂肪酸的約88%。(J. L. Harwood，Plant Acyl Lipids :Structure, Distribution and Analysis, 4Lipids :Structure and Function, P. K. Stumpf和Ε. Ε. Conn編(1988)。)棕櫚酸和硬脂酸是飽和脂肪酸，在某些研究中已經(jīng)證 明了它們促成血漿膽固醇水平升高，這種升高是冠心病(coronary heart disease)的一項(xiàng) 因素。根據(jù)最近的研究，不飽和脂肪酸諸如油酸和亞油酸高的植物油可具有降低血漿膽固 醇的能力。一般而言，飽和脂肪酸還具有比碳數(shù)目相同的不飽和脂肪酸高的熔點(diǎn)，這促成食 品中的低溫耐受性問題，而且能促成攝入過程中的蠟質(zhì)(waxy)或油膩口感(feel in the mouth)。還知道的是，由具有小于約3%飽和脂肪酸的脂肪和油制成的食物產(chǎn)品通常每客 (serving)會(huì)含有小于0. 5克的飽和脂肪，并且因此可以在目前的標(biāo)簽規(guī)定下標(biāo)記為含有 “零飽和脂肪”。如此，就許多原因而言，生產(chǎn)具有低水平棕櫚酸和硬脂酸且有高水平油酸或 亞油酸的向日葵油是理想的。任何新的、理想的植物種質(zhì)的開發(fā)都有許多步驟。植物育種開始于分析和定義當(dāng) 前種質(zhì)的問題和弱點(diǎn)、建立項(xiàng)目目的、和定義具體的育種目標(biāo)。下一步是選擇擁有滿足項(xiàng)目 目的的性狀的種質(zhì)。目的是在單一品種中組合來(lái)自親本種質(zhì)的期望性狀的改良組合。這些 重要的性狀可以包括較高的種子產(chǎn)率(yield)、對(duì)疾病和昆蟲的抗性、較好的莖和根、對(duì)干 旱和熱的耐受性、和較好的農(nóng)藝學(xué)質(zhì)量。
育種或選擇方法的選擇取決于植物繁殖的模式、所改良性狀的遺傳力、和商業(yè)上 使用的栽培種類型(例如，F(xiàn)1雜種栽培種、純系栽培種等)。對(duì)于高度可遺傳的性狀，選擇 在單個(gè)位置評(píng)估的卓越植物個(gè)體會(huì)是有效的，而對(duì)于具有低遺傳力的性狀，選擇應(yīng)當(dāng)基于 自重復(fù)評(píng)估相關(guān)植物的家族所獲得的平均值。流行的選擇方法通常包括譜系選擇、改良的 譜系選擇、混合選擇(mass selection)、和輪回選擇。遺傳的復(fù)雜性影響育種方法的選擇。使用回交育種來(lái)將一種或少數(shù)幾種對(duì)于高度 可遺傳的性狀有利的基因轉(zhuǎn)移入想要的栽培種中。此辦法已經(jīng)廣泛地用于育種疾病抗性栽 培種。使用多種輪回選擇技術(shù)來(lái)改善受多個(gè)基因控制的數(shù)量遺傳性狀。輪回選擇在自花傳 粉作物中的使用依賴于傳粉容易、來(lái)自每次傳粉的成功雜種的頻率、和來(lái)自每次成功雜交 的雜種后代的數(shù)目。每個(gè)育種項(xiàng)目應(yīng)當(dāng)包括對(duì)育種方法效率的周期性客觀評(píng)估。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)隨著目的和 目標(biāo)而變化，但是應(yīng)當(dāng)包括基于與合適的標(biāo)準(zhǔn)品比較得到的每年來(lái)自選擇的收益(gain)、 高級(jí)育種系(advanced breeding line)的總價(jià)值、和每單位投入(例如每年、花費(fèi)的每一 筆美元等)產(chǎn)生的成功栽培種的數(shù)目。對(duì)有希望的高級(jí)育種系進(jìn)行徹底地測(cè)試，并與代表商業(yè)目標(biāo)區(qū)的環(huán)境中的合適標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行比較達(dá)三年或更多年。最好的品系是新商業(yè)栽培種的候選；那些在少數(shù)幾個(gè)性狀 方面仍有缺陷的品系可以作為親本使用以產(chǎn)生供進(jìn)一步選擇用的新種群。這些過程(它們通向上市(marketing)和銷售(distribution)的最終步驟)從 進(jìn)行第一次雜交的時(shí)間起通?；ㄙM(fèi)8至12年。因此，新栽培種的開發(fā)是耗時(shí)的過程，其需 要精確的預(yù)先計(jì)劃、資源的有效使用、和最低限度的方向變化。最困難的任務(wù)是鑒定遺傳上卓越的個(gè)體，因?yàn)閷?duì)于大多數(shù)性狀，真實(shí)基因型的值 被其它混雜的植物性狀或環(huán)境因素掩蓋。一種鑒定卓越植物的方法是相對(duì)于其它實(shí)驗(yàn)植物 和廣泛種植的標(biāo)準(zhǔn)栽培種觀察其性能(performance)。如果單次觀察沒有結(jié)論，則重復(fù)觀察 可提供對(duì)其遺傳價(jià)值的更好評(píng)估。植物育種的目的是開發(fā)新的、獨(dú)特的且卓越的向日葵栽培種和雜種。育種人員最 初選擇并雜交兩種或更多種親本品系，接著進(jìn)行重復(fù)的自交和選擇，產(chǎn)生許多新的遺傳組 合。理論上育種人員可以經(jīng)由雜交、自交和突變產(chǎn)生幾十億不同的遺傳組合。育種人員在 細(xì)胞水平上沒有直接對(duì)照(no direct control)。因此，兩名育種人員絕不會(huì)開發(fā)出具有相 同向日葵性狀的相同品系，或者甚至非常類似的品系。每年，植物育種人員選擇種質(zhì)來(lái)推進(jìn)到下一世代。這種種質(zhì)在獨(dú)特的且不同的地 理學(xué)、氣候和土壤條件下種植，然后在生長(zhǎng)期期間和結(jié)束時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步選擇。開發(fā)的栽培種 是不可預(yù)測(cè)的。這種不可預(yù)測(cè)性是由于育種人員的選擇，其發(fā)生在獨(dú)特的環(huán)境中，在DNA水 平上沒有對(duì)照(使用常規(guī)的育種方法)，而且產(chǎn)生幾百萬(wàn)不同的可能的遺傳組合。具有本領(lǐng) 域普通技術(shù)的育種人員不能預(yù)測(cè)他開發(fā)的最終所得品系，只是可能以非常粗略且大體的方 式。同一育種人員不能通過使用完全相同的初始親本和相同的選擇技術(shù)來(lái)產(chǎn)生相同的栽培 種兩次。這種不可預(yù)測(cè)性導(dǎo)致花費(fèi)大量的研究資金來(lái)開發(fā)卓越的新型向日葵栽培種。新的向日葵栽培種的開發(fā)要求開發(fā)和選擇向日葵品種、雜交這些品種、和選擇卓 越的雜種雜交。通過在選定的雄性能育親本之間手工雜交或者通過使用雄性不育系統(tǒng)來(lái)產(chǎn) 生雜種種子。針對(duì)某些單基因性狀來(lái)選擇這些雜種，諸如莢果顏色(pod color)、花的顏色、短柔毛(pubescence)顏色、或除草劑抗性，它們指明種子確實(shí)是雜種。關(guān)于親本品系，以及 雜種表型的別的數(shù)據(jù)影響育種人員決定是否繼續(xù)特定的雜種雜交。使用譜系育種和輪回選擇育種方法來(lái)從育種群體開發(fā)栽培種。育種項(xiàng)目將來(lái)自 兩種或更多種栽培種或多種運(yùn)用廣泛的(broad-based)來(lái)源的期望性狀組合成育種集合 (breeding pool)，通過自交和選擇期望的表型從所述育種集合開發(fā)栽培種。評(píng)估新的栽培 種以確定哪些具有商業(yè)潛力。譜系育種通常用于改良自花傳粉的作物。將兩種擁有有利的、互補(bǔ)性狀的親本雜 交以產(chǎn)生K。通過使一個(gè)或數(shù)個(gè)F1自交來(lái)產(chǎn)生F2群體。最好個(gè)體的選擇可以在F2群體中 開始；然后在F3中開始選擇最好家族中的最好個(gè)體。對(duì)家族的重復(fù)測(cè)試可以在&代中開始 以改善選擇具有低遺傳力的性狀的效率。在育種的高級(jí)階段(即F6和F7),對(duì)最好的品系 或表型上類似的品系的混合物測(cè)試作為新栽培種的推廣(release)潛力?？梢允褂没旌虾洼喕剡x擇來(lái)改善自花傳粉或異花傳粉作物的群體。通過使數(shù)種不 同親本互交來(lái)鑒定或創(chuàng)建雜合個(gè)體的遺傳可變?nèi)后w?；趥€(gè)體優(yōu)越性、杰出的子代、或卓越 的組合能力來(lái)選擇最好的植物。使選定的植物互交以產(chǎn)生新群體，在其中繼續(xù)進(jìn)一步的選 擇循環(huán)?；亟挥N已經(jīng)用于將簡(jiǎn)單遺傳的、高度可遺傳的性狀的基因轉(zhuǎn)移到作為回歸親本 的期望的純合栽培種或近交系中。要轉(zhuǎn)移的性狀來(lái)源稱作供體親本。預(yù)期所得的植物具有 回歸親本(例如栽培種)的屬性和自供體親本轉(zhuǎn)移的期望性狀。初始雜交后，選擇擁有供 體親本表型的個(gè)體，并與回歸親本重復(fù)雜交(回交)。預(yù)期所得的植物具有回歸親本(例如 栽培種)的屬性和自供體親本轉(zhuǎn)移的期望性狀。嚴(yán)格意義上的單種子遺傳(single-seed descent)方法指種植分離群，每株植物 收獲一粒種子樣品，并使用這一粒種子樣品來(lái)種植下一世代。當(dāng)群體已經(jīng)從F2推進(jìn)至期望 的育種水平時(shí)，衍生出品系的植物會(huì)各自上溯至不同的F2個(gè)體。群體中植物的數(shù)目每代都 下降，這是由于一些種子不能萌發(fā)或者一些植物不能產(chǎn)生哪怕一粒種子。因此，當(dāng)完成世代 進(jìn)度時(shí)，并不是所有最初在群體中取樣的F2植物都會(huì)由子代代表。在多種子方法中，向日葵育種人員通常從群體中的每株植物收獲種子，并使它們 脫粒在一起以形成整體(bulk)。使用整體的一部分來(lái)種植下一世代，而一部分進(jìn)行保存。 該方法已經(jīng)被稱為改良的單種子遺傳。已經(jīng)使用多種子方法來(lái)在收獲時(shí)節(jié)約勞動(dòng)力。用機(jī)器取下種子比單種子方法中用 手自每株取下一粒種子快得多。多種子方法還使得有可能每個(gè)近交世代種植相同數(shù)目的群 體種子。收獲足夠的種子來(lái)補(bǔ)償那些不萌發(fā)或不產(chǎn)生種子的植物。關(guān)于通常用于不同性狀和作物的其它育種方法的描述可以參見數(shù)本參考書之一 (例如 Allard, 1960 ；Simmonds, 1979 ；Sneep 等，1979 ；Fehr, 1987)。合適的測(cè)試應(yīng)當(dāng)檢測(cè)任何主要的不足，并建立高于當(dāng)前栽培種的優(yōu)越性或改進(jìn)水 平。除顯示卓越的性能外，必須需要與工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相容或者產(chǎn)生新市場(chǎng)的新栽培種。新栽培 種的引入可能由于專門的廣告和行銷、改變的種子和商業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐、和新產(chǎn)品利用而使種 子生產(chǎn)者、種植者、加工者和消費(fèi)者承受額外的成本。推廣新栽培種前的測(cè)試應(yīng)當(dāng)考慮研究 和開發(fā)成本以及最終栽培種的技術(shù)優(yōu)越性。對(duì)于種子繁殖的栽培種，容易且經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生種 子必須是可行的。
向日葵是一種重要且有價(jià)值的大田作物。如此，植物育種人員的持續(xù)目的是開發(fā) 穩(wěn)定的、高產(chǎn)率的農(nóng)藝學(xué)上是可靠的(sound)向日葵栽培種。當(dāng)前的目的是使所用土地上 生產(chǎn)的谷粒量最大化，并為動(dòng)物和人類供應(yīng)食物。為了實(shí)現(xiàn)此目的，向日葵育種人員必須選 擇和開發(fā)具有產(chǎn)生卓越栽培種的性狀的向日葵植物。相關(guān)領(lǐng)域的上述例子及其相關(guān)限制意圖是例示性的而非排他性的。在閱讀說明書 后，相關(guān)領(lǐng)域的其它限制對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。發(fā)明_既述結(jié)合系統(tǒng)、工具和方法來(lái)描述以下實(shí)施方案，所述系統(tǒng)、工具和方法意欲為例示性 和說明性的，而并不限制范圍。在多個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)上述問題已經(jīng)得到減少或消 除，而其它實(shí)施方案涉及其它改進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種新的向日葵植物，其產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量的種子。本 發(fā)明部分涉及具有低飽和脂肪含量的向日葵種子、產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量的種子的向日 葵植物的植株或植株部分、及用于產(chǎn)生通過將產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量的種子的向日葵植 物與其自身或另一向日葵栽培種雜交來(lái)產(chǎn)生的向日葵植物的方法和通過誘變或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 具有低飽和脂肪含量的種子的向日葵植物來(lái)創(chuàng)建變體的方法。本發(fā)明的各方面提供了新的向日葵植物，其產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量和高亞油酸 含量的種子。本發(fā)明部分涉及具有低飽和脂肪含量和高亞油酸含量的向日葵種子、產(chǎn)生具 有低飽和脂肪含量和高亞油酸含量的種子的向日葵植物的植株或植株部分、及用于產(chǎn)生通 過將產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量和高亞油酸含量的種子的向日葵植物與其自身或另一向日 葵栽培種雜交來(lái)產(chǎn)生的向日葵植物的方法和通過誘變或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量和 高亞油酸含量的種子的向日葵植物來(lái)創(chuàng)建變體的方法。具有低飽和脂肪含量的種子的例子包括但不限于如下的種子，其具有總計(jì)約 2. 8%或更少、約2. 9%或更少、約3%或更少、約3. 或更少、約3. 2%或更少、或約3. 3% 或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。具有低飽和脂肪含量和高亞油酸(18:2)含量的種子的例子包括但不限于如下的 種子，其具有總計(jì)約4. 1 %或更少、約5 %或更少、約6 %或更少、約7 %或更少、約8 %或更 少、約9%或更少、約10%或更少、約11%或更少、或約12%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂 酸(18:0)含量，而且具有約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約 50%、約55%、約60%、約65%、約70%、或約74%或更多的亞油酸(18:2)。如此，使用產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物進(jìn)行 的任何此類方法是本發(fā)明的一部分(例如自交、回交、雜種生成、與群體雜交等)。使用產(chǎn)生 具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物作為親本產(chǎn)生的所有植物在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。有利地，可以在與其它不同向日葵植物的雜交中使用所述向日葵植物以 產(chǎn)生具有卓越特征的第一代(F1)向日葵雜種種子和植物。在另一方面，本發(fā)明提供了單基因或多基因轉(zhuǎn)變的向日葵植物，其產(chǎn)生具有低飽 和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移的基因可以是顯性或隱性等位基因。轉(zhuǎn) 移的基因可以賦予性狀，諸如除草劑抗性、抗蟲性(insect resistance)、對(duì)細(xì)菌、真菌或病 毒疾病的抗性、雄性能育、雄性不育、提高的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量、和工業(yè)用途?；蚩梢允翘烊淮嬖诘?向日葵基因或經(jīng)由基因工程技術(shù)引入的轉(zhuǎn)基因。
在另一方面，本發(fā)明提供了可再生細(xì)胞，其用于組織培養(yǎng)產(chǎn)生具有低飽和脂肪和 任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物。組織培養(yǎng)能夠再生具有上述產(chǎn)生具有低飽和脂 肪和任選地高亞油酸含量之種子的向日葵植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，而且能夠再 生與上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。此類組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以 是胚、原生質(zhì)體、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果或莖。更進(jìn)一 步，本發(fā)明提供了自本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的向日葵植物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種將期望的性狀引入產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地 高亞油酸含量的種子的向日葵植物中的方法，其中所述方法包括將產(chǎn)生具有低飽和脂肪 和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物與包含期望性狀的另一向日葵栽培種的植物 雜交以產(chǎn)生F1子代植物，其中所述期望的性狀選自下組雄性不育、除草劑抗性、抗蟲性、 和對(duì)細(xì)菌疾病、真菌疾病或病毒疾病的抗性；選擇一株或多株具有期望性狀的子代植物以 產(chǎn)生選定的子代植物；將所述選定的子代植物與產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含 量的種子的向日葵植物雜交以產(chǎn)生回交子代植物；選擇具有所述期望的性狀和產(chǎn)生具有低 飽和脂肪和任選地高亞油酸含量之種子的向日葵植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的回交子代 植物，以產(chǎn)生選定的回交子代植物；并重復(fù)這些步驟來(lái)產(chǎn)生選定的第一或更高(first or higher)的回交子代植物，其包含所述期望的性狀和產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油 酸含量之種子的向日葵植物的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。除了上文所描述的例示性方面和實(shí)施方案外，通過研究以下描述，另外的方面和 實(shí)施方案會(huì)變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了低硬脂酸QTL在LG17的HA1875-HA1865區(qū)間中的精細(xì)定位(小圖A 具有新標(biāo)志物(為藍(lán)色)的LG 17的圖和小圖B 低硬脂酸QTL相對(duì)于HA1875-0RS565區(qū) 間的精細(xì)定位)；圖2顯示了來(lái)自兩個(gè)親本品系的KASII-2基因的序列比對(duì)，顯示了 SNP和 indeKlD 號(hào) 333. 1 (SEQ ID NO 38)和 333. 2 (SEQ ID NO 39)代表來(lái)自 0ND163R 擴(kuò)增子的 克隆，而 332. 4(SEQ ID NO 40)和 332. 5 (SEQ ID NO 41)代表來(lái)自 H280R[1]/687R-1-8-1 擴(kuò)增子的克隆)；圖3顯示了低棕櫚酸QTL(小圖A)和脂肪酸基因KASII 1_2 (小圖B)在LG 5上的
共定位。發(fā)明的實(shí)施方式在以下描述和表格中，使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求書(包括 此類術(shù)語(yǔ)要給予的范圍)的清楚而一致的理解，提供了下列定義等位基因。等位基因指基因的一種或多種可選形式之任一種，所有該等位基因涉 及一種性狀或特征。在雙倍體細(xì)胞或生物體中，給定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對(duì)同源染 色體上的相應(yīng)基因座?；亟??；亟恢赣N人員重復(fù)地將雜種子代往回與親本之一(例如第一代雜種F1與 F1雜種的親本基因型之一)雜交的過程。良種向日葵。已經(jīng)在某些商業(yè)上重要的農(nóng)藝學(xué)性狀方面穩(wěn)定化的向日葵栽培種， 其相對(duì)于在同一生長(zhǎng)位置、同時(shí)并且在相同條件下生長(zhǎng)的驗(yàn)證品種的產(chǎn)率包含約100%或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，“良種向日葵”意指在某些商業(yè)上重要的農(nóng)藝學(xué)性 狀方面穩(wěn)定化的向日葵栽培種，其相對(duì)于在同一生長(zhǎng)位置、同時(shí)并且在相同條件下生長(zhǎng)的 驗(yàn)證品種的產(chǎn)率包含110%或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“良種向日葵”意指 在某些商業(yè)上重要的農(nóng)藝學(xué)性狀方面穩(wěn)定化的向日葵栽培種，其相對(duì)于在同一生長(zhǎng)位置、 同時(shí)并且在相同條件下生長(zhǎng)的驗(yàn)證品種的產(chǎn)率包含115%或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)率。胚。胚指成熟種子內(nèi)含有的小植株。FAME分析。脂肪酸甲酯分析是容許精確量化構(gòu)成復(fù)合脂種類的脂肪酸的方法。咪唑啉酮(Imidazolinone)抗性(Imi)?？剐院?或耐受性是由一種或多種改變 乙酰乳酸合酶(ALS)(又稱為乙酰羥酸合酶(AHAS))的基因賦予的，所述基因容許所述酶對(duì) 抗咪唑啉酮的作用。誘變。誘變指用誘變劑(例如提高突變?cè)诎袠?biāo)植物或植物部分中的頻率的化學(xué)劑 或物理因素)誘變植物或植物部分。作為非限制性例子，可以使用Konzak的雙重化學(xué)誘變 技術(shù)(如記載于美國(guó)專利號(hào)6，696，294)來(lái)在內(nèi)源植物基因中誘導(dǎo)突變等位基因。含油量。含油量按照占完整干燥種子的百分比來(lái)測(cè)量，而且是不同品種的特征。它 可以使用多種分析技術(shù)諸如NMR、NIRjn Soxhlet提取來(lái)測(cè)定。總脂肪酸百分比。這通過如下測(cè)定，即從種子提取油樣品，生成所述油樣品中存在 的脂肪酸的甲酯，并使用氣相層析來(lái)分析各種脂肪酸在樣品中的比例。脂肪酸組成也可以 是品種的區(qū)別性特征。單基因轉(zhuǎn)變的(轉(zhuǎn)變)。單基因轉(zhuǎn)變的(轉(zhuǎn)變)植物指通過稱作回交的植物育種 技術(shù)，或者經(jīng)由基因工程開發(fā)的植物，其中除了經(jīng)由回交技術(shù)或經(jīng)由基因工程轉(zhuǎn)移到品種 中的單基因外，該品種的基本上所有期望的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征也均得到復(fù)原。穩(wěn)定化的。從一個(gè)世代能通過繁殖傳遞到同一品種的近交植物的下一世代?？傦柡偷?TOTSAT)。油中的飽和脂肪(包括C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C20:0、 C22:0和C24. 0)占種子油的總百分比。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，提供了一種新的向日葵植物，其產(chǎn)生具有低飽和脂 肪含量的種子。此實(shí)施方案涉及具有低飽和脂肪含量的向日葵種子、產(chǎn)生具有低飽和脂肪 含量的種子的向日葵植物的植株或植株部分、及用于生產(chǎn)通過將產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量 的種子的向日葵植物與其自身或另一向日葵栽培種雜交而產(chǎn)生的向日葵植物的方法和通 過誘變或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量的種子的向日葵植物來(lái)創(chuàng)建變體的方法。本發(fā)明的其它方面提供了新的向日葵植物，其產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量和高亞油 酸含量的種子。此實(shí)施方案涉及具有低飽和脂肪含量和高亞油酸含量的向日葵種子、產(chǎn)生 具有低飽和脂肪含量和高亞油酸含量的種子的向日葵植物的植株或植株部分、及用于生產(chǎn) 通過將產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量和高亞油酸含量的種子的向日葵植物與其自身或另一向 日葵栽培種雜交而產(chǎn)生的向日葵植物的方法和通過誘變或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量 和高亞油酸含量的種子的向日葵植物來(lái)創(chuàng)建變體的方法。具有低飽和脂肪含量的種子的例子包括但不限于如下的種子，其具有總計(jì)約 2. 8%或更少、約2. 9%或更少、約3%或更少、約3. 或更少、約3. 2%或更少、或約3. 3% 或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。具有低飽和脂肪含量和高亞油酸(18:2)含量的種子的例子包括但不限于如下的種子，其具有總計(jì)約6%或更少、約4. 或更少、約5%或更少、約6%或更少、約7%或更 少、約8%或更少、約9%或更少、約10%或更少、約11%或更少、或約12%或更少的棕櫚酸 (16:0)和硬脂酸(18:0)含量，而且具有約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、 約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、或約74%或更多的亞油酸(18:2)。如此，使用產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物進(jìn)行 的任何此類方法是本發(fā)明的一部分(例如自交、回交、雜種生成、與群體雜交等)。使用產(chǎn)生 具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物作為親本產(chǎn)生的所有植物在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。有利地，可以在與其它不同向日葵植物的雜交中使用所述向日葵植物以 產(chǎn)生具有卓越特征的第一代(F1)向日葵雜種種子和植物。在另一方面，本發(fā)明提供了單基因或多基因轉(zhuǎn)變的向日葵植物，其產(chǎn)生具有低飽 和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移的基因可以是顯性或隱性等位基因。優(yōu) 選地，轉(zhuǎn)移的基因會(huì)賦予性狀，諸如除草劑抗性、抗蟲性、細(xì)菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗 性、雄性能育、雄性不育、提高的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量、和工業(yè)用途?；蚩梢允翘烊淮嬖诘南蛉湛?或經(jīng)由基因工程技術(shù)引入的轉(zhuǎn)基因。在另一方面，本發(fā)明提供了可再生細(xì)胞，其用于組織培養(yǎng)產(chǎn)生具有低飽和脂肪和 任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物。優(yōu)選地，組織培養(yǎng)會(huì)能夠再生具有上述產(chǎn)生具 有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量之種子向日葵植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，而 且能夠再生與上述向日葵植物具有基本上相同基因型的植物。此類組織培養(yǎng)物中的可再 生細(xì)胞可以是胚、原生質(zhì)體、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果或 莖。更進(jìn)一步，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了自本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的向日葵植物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種將期望的性狀引入產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地 高亞油酸含量的種子的向日葵植物中的方法，其中所述方法包括將產(chǎn)生具有低飽和脂肪 和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物與包含期望性狀的另一向日葵栽培種的植物 雜交以產(chǎn)生F1子代植物，其中所述期望的性狀選自下組雄性不育、除草劑抗性、抗蟲性、和 對(duì)細(xì)菌疾病、真菌疾病或病毒疾病的抗性；選擇一株或多株具有期望性狀的子代植物以產(chǎn) 生選定的子代植物；將所述選定的子代植物與產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量 的種子的向日葵植物雜交以產(chǎn)生回交子代植物；選擇具有所述期望的性狀和產(chǎn)生具有低飽 和脂肪和任選地高亞油酸含量之種子的向日葵植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的回交子代植 物，以產(chǎn)生選定的回交子代植物；并重復(fù)這些步驟來(lái)產(chǎn)生選定的第一或更高的回交子代植 物，其包含所述期望的性狀和產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵 植物的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。有用的方法包括但不限于使用直接基因轉(zhuǎn)移方法諸如微粒介導(dǎo)的投遞、DNA注射、 電穿孔等導(dǎo)入植物組織中的表達(dá)載體。可以使用微粒介質(zhì)投遞用生物射彈裝置或使用土壤 桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中。用本發(fā)明的原生質(zhì)獲得 的轉(zhuǎn)化體植物意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。隨著使分離和表征編碼特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因成為可能的分子生物學(xué)技術(shù)的出 現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對(duì)以下方面形成了強(qiáng)烈的興趣，即工程化改造植物的基因組 以含有外來(lái)基因，或者另外的或經(jīng)修飾型式的天然或內(nèi)源基因(可能由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))， 并進(jìn)行表達(dá)以便以特定的方式改變植物的性狀。此類外來(lái)的另外的和/或經(jīng)修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因”。在過去15至20年里，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方 法，并且在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及要求保護(hù)的品種或栽培種的轉(zhuǎn)化型式。植物轉(zhuǎn)化牽涉構(gòu)建會(huì)在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。此類載體包含包括在調(diào) 節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)控制下的或者與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)可操作連接的基因的DNA。 表達(dá)載體可以含有一種或多種此類可操作連接的基因/調(diào)控元件組合。載體可以是質(zhì)粒形 式，而且可以單獨(dú)或者與其它質(zhì)粒聯(lián)合使用，以如下文所描述的那樣使用轉(zhuǎn)化方法提供經(jīng) 轉(zhuǎn)化的向日葵植物，從而將轉(zhuǎn)基因摻入向日葵植物的遺傳物質(zhì)中。供向日葵轉(zhuǎn)化用的表達(dá)載體標(biāo)志物基因表達(dá)載體包括至少一種與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)可操作連接的遺傳標(biāo)志，其容 許通過負(fù)選擇(即抑制不含該選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞生長(zhǎng))或者通過正向選擇(即篩選由該 遺傳標(biāo)志編碼的產(chǎn)物)回收含有所述標(biāo)志的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。許多通常用于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo) 志基因是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，包括例如編碼在代謝上使可以作為抗生素或除草劑的選擇性 化學(xué)劑解毒的酶的基因，或者編碼對(duì)抑制劑不敏感的改變了的靶物的基因。幾種正向選擇 方法也是本領(lǐng)域中已知的?！N通常用于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因是在植物調(diào)節(jié)信號(hào)控制下的新霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶Π (nptll)基因，其賦予對(duì)卡那霉素的抗性。參見例如Fraley等，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. ,80 :4803(1983)。另一種常用的選擇標(biāo)志基因是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦 予對(duì)抗生素潮霉素的抗性。參見例如Vanden Elzen等，Plant Mol. Biol.，5 :299 (1985)。賦予對(duì)抗生素抗性的細(xì)菌起源的另外的選擇標(biāo)志基因包括慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、 鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷-3’ _腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(adenyl transferase)和博來(lái)霉素抗性 決定子。參見 Hayford 等，Plant Physiol. 86 1216 (1988) Jones 等，Mol. Gen. Genet.， 210:86(1987) ；Svab 等，Plant Mol. Biol. 14 197 (1990) ；Hille 等，Plant Mol. Biol. 7 171(1986)。其它選擇標(biāo)志基因賦予對(duì)除草劑諸如草甘膦、草銨膦(glufosinate)或溴苯腈 (bromoxynil)的抗性。參見 Comai 等，Nature 317:741-744(1985) ；Gordon-Kamm 等，Plant Cell 2:603-618(1990)；和 Stalker 等，Science 242:419-423(1988)。其它供植物轉(zhuǎn)化用的選擇標(biāo)志基因不是細(xì)菌起源的。這些基因包括例如小鼠二氫 葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruVylShikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酰 乳酸合酶。參見 Eichholtz 等，Somatic Cell Mol. Genet. 13 67(1987) ；Shah 等，Science 233:478(1986) ；Charest 等，Plant Cell R印· 8 :643 (1990)。另一類供植物轉(zhuǎn)化用的標(biāo)志基因需要篩選據(jù)推測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，而不對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞直接遺傳選擇對(duì)毒性物質(zhì)諸如抗生素的抗性。這些基因特別可用于量化或顯現(xiàn)基 因在特定組織中表達(dá)的空間樣式，并且通常稱為報(bào)告基因，因?yàn)樗鼈兛梢耘c基因或基因調(diào) 節(jié)序列融合以調(diào)查基因表達(dá)。通常用于篩選據(jù)推測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因包括葡糖醛酸 糖苷酶(⑶S)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。參見R. A. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5 387 (1987) ；Teeri 等，EMBO J. 8 343 (1989) ；Koncz 等，Proc. Natl. Acad. SciU. S. Α. 84 131 (1987) ；DeBlock 等，EMBO J. 3 1681 (1984)。最近，已經(jīng)可獲得用于顯現(xiàn)⑶S活性的體內(nèi)方法，其不需要破壞植物組織。 Molecular Probes publication 2908， Imagene, Τ· Μ· Green，第 1 頁(yè)一第 4 頁(yè)(1993)；禾口 Naleway等，J. Cell Biol. 115 :151a(1991)。然而，還沒有證明這些用于顯現(xiàn)⑶S活性的體
12內(nèi)方法對(duì)于回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是有用的，這是由于低靈敏度、高熒光背景和與使用螢光素 酶基因作為選擇標(biāo)志有關(guān)的限制。新近，已經(jīng)利用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因作為原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá) 的標(biāo)志物。參見Chalfie等，Science 263:802(1994)。GFP和GFP突變體可以作為可篩選 標(biāo)志物使用。供向日葵轉(zhuǎn)化用的表達(dá)載體啟動(dòng)子表達(dá)載體中包含的基因必須由包含調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)的核苷酸序列驅(qū)動(dòng)。 數(shù)種類型的啟動(dòng)子現(xiàn)在是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，可以單獨(dú)使用或者與啟動(dòng)子聯(lián)合使用的其它 調(diào)節(jié)元件也是如此。如本文中所使用的，“啟動(dòng)子”包括提及如下的DNA區(qū)域，其在轉(zhuǎn)錄起始的上游，而 且牽涉識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。“植物啟動(dòng)子”是能夠在植物細(xì) 胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的例子包括優(yōu)先在某些組織諸如葉、根、種 子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子稱為“組織優(yōu)選 性的”。僅在某些組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱為“組織特異性的”?！凹?xì)胞類型”特異性啟動(dòng) 子主要在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)表達(dá)?！罢T 導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境控制下的啟動(dòng)子?？烧兄抡T導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括 缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選性的、細(xì)胞類型特異性的、和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 構(gòu)成“非組成性”啟動(dòng)子類。“組成性”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動(dòng)子。A.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與向日葵中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與 編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列與向日葵中表達(dá)的基因可操作連 接。通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而升高?？梢栽诒景l(fā)明中使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。參見Ward等，Plant Mol. Biol. 22 361-366(1993)。例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于那些響應(yīng)銅的ACEI系統(tǒng)的啟動(dòng) 子(Mett等，PNAS 90 :4567_4571 (1993))；響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的玉米的In2基 因(Hershey 等，Mol. Gen. Genetics 227 :229_237 (1991)；和 Gatz 等，Mol. Gen. Genetics 243 32-38(1994))；和來(lái)自 TnlO 的 Tet 阻抑物(Gatz 等，Mol. Gen. Genetics 227 229-237(1991))。特別優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響應(yīng)植物正常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子。例 示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是來(lái)自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性受糖皮質(zhì)激素誘 導(dǎo)。Schena 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 88 0421 (1991)。B.組成性啟動(dòng)子將組成性啟動(dòng)子與向日葵中表達(dá)的基因可操作連接，或者將組成性啟動(dòng)子與編碼 信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號(hào)序列的核苷酸序列與向日葵中表達(dá)的基 因可操作連接。可以在本發(fā)明中利用不同的組成性啟動(dòng)子。例示性的組成性啟動(dòng)子包 括但不限于來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子，諸如來(lái)自CaMV的35S啟動(dòng)子(Odell等， Nature 313 810-812 (1985))；來(lái)自稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子(McElroy等，Plant Cell 2:163-171(1990))；來(lái)自泛素的啟動(dòng)子(Christensen 等，Plant Mol. Biol. 12 619-632 (1989)，和 Christensen 等，Plant Mol. Biol. 18 :675_689 (1992))；來(lái)自 pEMU 的啟動(dòng)子(Last 等，Theor. Appl. Genet. 81 :581_588 (1991))；來(lái)自 MAS 的啟動(dòng)子(Velten 等，EMB0J. 3 =2723-2730 (1984))；和來(lái)自玉米 H3 組蛋白的啟動(dòng)子(Lepetit 等，Mol. Gen. Genetics 231 :276_285 (1992)，和 Atanassova 等，Plant Journal 2(3) :291_300 (1992))。 ALS啟動(dòng)子，即歐洲油菜(Brassica napus)ALS3結(jié)構(gòu)基因5’的Xbal/Ncol片段(或與該 Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表一種特別有用的組成性啟動(dòng)子。參見PCT申請(qǐng)WO 96/30530。C.組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子將組織特異性啟動(dòng)子與向日葵中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，將組織特異性 啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號(hào)序列的核苷酸序列與向日 葵中表達(dá)的基因可操作連接。用與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的感興趣基因轉(zhuǎn)化的植物 可以專門或優(yōu)先在特定組織中生成轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。可以在本發(fā)明中利用任何組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子。例示性組織特異性 或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子包括但不限于根優(yōu)選性啟動(dòng)子，諸如來(lái)自菜豆蛋白基因的啟動(dòng)子 (Murai 等，Science 23 :476_482 (1983)，禾口 Sengupta-Gopalan 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 =3320-3324(1985))；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如來(lái)自cab或核酮糖二磷 酸羧化酶-加氧酶(rubisco)的啟動(dòng)子(Simpson 等，EMBO J. 4(11) =2723-2729 (1985), 和Timko等，Nature 318 =579-582(1985))；花藥特異性啟動(dòng)子，諸如來(lái)自LAT52的啟動(dòng)子 (Twell 等，Mol.Gen. Genetics217 =240-245(1989))；花粉特異性啟動(dòng)子，諸如來(lái)自 Zml3 的 啟動(dòng)子(Guerrero等，Mol. Gen. Genetics 244 161-168 (1993))或小孢子優(yōu)選性啟動(dòng)子，諸 如來(lái)自 apg 的啟動(dòng)子(Twell 等，Sex. Plant R印rod. 6 :217_224(1993))?？梢酝ㄟ^將編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因 的5’和/或3’區(qū)域的手段來(lái)實(shí)現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因生成的蛋白質(zhì)向亞細(xì)胞區(qū)室諸如葉綠體、液泡、 過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)或者分泌入質(zhì)外體中?？梢栽诘鞍踪|(zhì) 合成和加工過程中測(cè)定在結(jié)構(gòu)基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中編碼的蛋白質(zhì)最后 被區(qū)室化(compartmentalized) ο信號(hào)序列的存在將多肽引導(dǎo)至胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室，或者分泌至質(zhì)外體。 許多信號(hào)序列是本領(lǐng)域中已知的。參見例如Becker等，Plrnt Mol. Biol. 20 49 (1992)； P. S. Close, Master’ s Thesis，Iowa State University (1993) ；C. Knox 等，“Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley，，，Plant Mol. Biol. 9 3-17(1987) ；Lerner 等，Plant Physiol. 91 124-129 (1989) ；Fontes 等，Plant Cell 3:483-496(1991) ；Matsuoka 等，Proc. Natl Acad. Sci. 88 :834(1991) ；Gould 等， J. Cell. Biol. 108 1657(1989) ；Creissen 等，Plant J. 2 129 (1991) ；Kalderon 等，A short amino acid sequence able to specify nuclear location， Cell 39:499-509(1984)； Steifel等，Expression of a maize cell wall hydroxypro1ine~rich glycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation, Plant Cell 2:785—793(1990)。外來(lái)蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝學(xué)基因通過根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以以商業(yè)量生產(chǎn)外來(lái)蛋白質(zhì)。如此，用于選擇和 繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)(它們是本領(lǐng)域中充分了解的)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，它們以常規(guī) 方式收獲，然后可以從感興趣的組織或總生物量提取外來(lái)蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^由例如Heney和Orr，Anal. Biochem. 114 :92_6(1981)所討論的已知方法來(lái)實(shí)現(xiàn)從植物生物量的蛋白質(zhì)提取。在本發(fā)明的各方面，為商業(yè)生產(chǎn)外來(lái)蛋白質(zhì)提供的轉(zhuǎn)基因植物是向日葵植物。在 其它方面，感興趣的生物量是種子。對(duì)于相對(duì)少量的顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以 主要經(jīng)由常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析(其鑒定整合DNA分子的近似染色體位置)來(lái)產(chǎn)生遺 傳圖譜。關(guān)于這方面的例示性方法，參見Glick和Thompson，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton 269:284(1993)。關(guān)于染色體位置 的圖譜信息對(duì)于主題轉(zhuǎn)基因植物的所有權(quán)保護(hù)是有用的。如果進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖和與其 它種質(zhì)進(jìn)行雜交，則可以將整合區(qū)域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較以確定后者是 否與主題植物具有共同來(lái)源(parentage)。圖譜比較會(huì)牽涉雜交、RFLP, PCR、SSR和測(cè)序， 它們都是常規(guī)技術(shù)。同樣地，可以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體地，可以對(duì)植物進(jìn)行遺傳 工程化改造以表達(dá)農(nóng)藝學(xué)感興趣的各種表型?？梢栽谶@方面使用的例示性基因包括但不限 于下文進(jìn)行歸類的基因。1.賦予對(duì)害蟲或疾病的抗性并編碼下列各項(xiàng)的基因A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)產(chǎn)物與病原 體中相應(yīng)無(wú)毒性(Avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因轉(zhuǎn)化 植物品種以工程化改造對(duì)特定病原體株有抗性的植物。參見例如Jones等，Science 266 789(1994)(克隆對(duì)黃枝孢霉(Cladosporium fulvum)有抗性的番茄Cf_9基因)；Martin 等，Science 262 :1432 (1993)(對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv. tomato)有抗性的番茄Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinos等，Cell 78 =1089(1994) (對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)有抗性的擬南芥(Arabidopsis) RSP2基因)。B)賦予對(duì)害蟲諸如大豆胞囊線蟲有抗性的基因。參見例如PCT申請(qǐng)W096/30517 ； PCT 申請(qǐng) WO 93/19181。C)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或模仿其的合成 多肽。參見例如Geiser等，Gene 48 :109 (1986)，其披露了 Bt δ-內(nèi)毒素基因的克隆和 核苷酸序列。此外，編碼S-內(nèi)毒素基因的DNA分子可以購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection)，Manassas，Va.，例如以 ATCC 保藏號(hào) 40098、67136、 31995 和 31998 購(gòu)得。D)凝集素。參見例如 Van Damme 等，Plant Molec. Biol. 24 :25 (1994)的公開內(nèi) 容，其披露了數(shù)種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。E)維生素結(jié)合蛋白諸如抗生物素蛋白。參見PCT申請(qǐng)US93/06487。該申請(qǐng)教導(dǎo) 了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對(duì)蟲害的殺幼蟲劑的用途。F)酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abe 等，J. Biol. Chem. 262 16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制劑的核苷酸序列)；Huub 等，Plant Molec. Biol. 21 =985(1993)(編碼煙草蛋白水解酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序 列)；Sumitani 等，Biosci. Biotech. Biochem. 57 1243 (1993)(硝孢鏈霉菌(Streptomyces nitrosporeus) α -淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)；和美國(guó)專利號(hào)5，494，813 Ofepher和 Atkinson, 1996 年 2 月 27 日公開)。
G)昆蟲特異性激素或信息素，諸如蛻皮類固醇或保幼激素，其變體、基于其的模擬 物、或其拮抗劑或激動(dòng)劑。參見例如Hammock等，Nature344 =458(1990)披露的克隆的保幼 激素酯酶(即一種保幼激素滅活劑)的桿狀病毒表達(dá)的內(nèi)容。H)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受到影響的害蟲的生理學(xué)。例如參 見Regan，J. Biol. Chem. 269 :9 (1994)(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的DNA)和 Pratt φ, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 1243(1989) ( ^ i； 5F # ff M tt (Diploptera puntata)中鑒定出咽側(cè)體抑制素(allostatin))的公開內(nèi)容。還可參見Tomalski等的美 國(guó)專利號(hào)5，266，317，其披露了編碼昆蟲特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因。I)在自然界由蛇、黃蜂(wasp)等生成的昆蟲特異性毒液。例如參見Pang等，Gene 116:165(1992)，是關(guān)于編碼蝎昆蟲毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá)的公開內(nèi)容。J)酶，其負(fù)責(zé)超積累單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯丙烷衍生物或另一具有 殺昆蟲活性的非蛋白質(zhì)分子。K)牽涉對(duì)生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白 水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合 酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見以 Scott等名義的PCT申請(qǐng)W093/02197，其披露了 callase基因的核苷酸序列。含有幾丁質(zhì) 酶編碼序列的DNA分子可以例如從ATCC以保藏號(hào)39637和67152獲得。還可參見Kramer 等，Insect Biochem. Molec. Biol. 23 691 (1993)(其教導(dǎo)了編碼煙草天蛾幾丁質(zhì)酶的 cDNA 的核苷酸序列)和 Kawalleck 等，Plant Molec. Biol. 21 =673(1993)(其提供了歐芹 ubi4_2 多聚泛素基因的核苷酸序列)。L)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見Botella等，Plant Molec. Biol. 24 =757(1994) (關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等，Plant Physiol. 104 1467(1994)(其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開內(nèi)容。M)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide) 參見 PCT 申請(qǐng) TO 95/16776 (抑 制真菌植物病原體的鱟抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公開內(nèi)容)和PCT申請(qǐng)WO 95/18855 (教導(dǎo)了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。N)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見Jaynes等，Plant Sci. 89 43(1993)公開的殺菌肽-β溶胞肽類似物(cecropin-β lytic peptide analog)的異源 表達(dá)以使轉(zhuǎn)基因煙草植物對(duì)青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。0)病毒侵入蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 中的積累賦予對(duì)由衍生出該外殼蛋白基因的病毒及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病 形成的抗性。參見Beachy等，Ann. Rev. Phytopathol. 28 451 (1990)。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物 賦予了針對(duì)苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙 草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。P)昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功 能的抗體會(huì)使受影響的酶失活，這殺死昆蟲。參見Taylor等，摘要號(hào)497，Seventh Int' 1 Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh,Scotland)(1994)(經(jīng) 由生成單鏈抗體片段進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因煙草中的酶促失活)。Q)病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki等，Nature 366 :469 (1993)，其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)免于病毒攻擊。R)在自然界由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白(developmental-arrestive protein)。如此，真菌內(nèi)α-1，4_D_多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁同-α-1， 4-D-半乳糖醛酸酶(galacturonase)來(lái)促進(jìn)真菌定殖(colonization)和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。 參見Lamb等，Bio/Technology 10 1436 (1992)。編碼豆內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基 因的克隆和表征由Toubart等，Plant J. 2 =367(1992)描述。S)在自然界由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如Logemarm等，Bio/Technology 10 305(1992)顯示了表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌疾病具有升高的抗性。2.賦予對(duì)除草劑的抗性的基因A)抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，諸如咪唑啉酮或磺酰脲。在這類中的例示性 基因編碼突變的ALS和AHAS酶，如分別由例如Lee等，EMBO J. 7 1241 (1988)和Miki等， Theor. Appl. Genet. 80 449 (1990)所描述的。B)抑制光合作用的除草劑，諸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶 基因)。Przibila等，Plant Cell 3:169(1991)描述了用編碼突變的psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美國(guó)專利號(hào) 4，810，648，并且含有這些基因的DNA分子可以以ATCC保藏號(hào)53435、67441、和67442獲得。 編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)由Hayes等，Biochem. J. 285 =173(1992)描述。3.賦予或促成如下增值(value-added)性狀的基因，諸如A)經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化 植物以提高植物的硬脂酸含量。參見Knultzon等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 2624(1992)。B)降低的肌醇六磷酸鹽含量——1)肌醇六磷酸酶編碼基因的導(dǎo)入會(huì)增強(qiáng)肌醇六 磷酸鹽的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多游離的磷酸鹽。例如，參見Van Hartingsveldt等， Gene 127 :87 (1993)，關(guān)于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列 的公開內(nèi)容。2)可以導(dǎo)入降低肌醇六磷酸鹽含量的基因。例如在玉米中，這可以如下實(shí)現(xiàn)， 即克隆與單一等位基因有關(guān)的DNA，然后再次導(dǎo)入，所述單一等位基因負(fù)責(zé)特征為低水平肌 醇六磷酸的玉米突變體。參見Raboy等，Maydica 35:383(1990)。C)例如通過用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來(lái)實(shí)現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳 水化合物組成。參見 Shiroza 等，J. Bacteol. 170 810(1988)(鏈球菌(Sti^ptococcus)突 變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等，Mol. Gen. Genet. 20 =220(1985)(枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因的核苷酸序列)；Pen 等，Bio/Technology 10 292(1992)(表達(dá)地衣芽胞桿菌(Bacillus lichenifonnis) α-淀 粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的生成)；Elliot等，Plant Molec. Biol. 21 :515 (1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基 因的核苷酸序列)；Sogaard等，J.Biol. Chem. 268 :22480 (1993)(大麥α-淀粉酶基因的定 點(diǎn)誘變)；和Fisher等，Plant Physiol. 102 1045 (1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。用于向日葵轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)開發(fā)了許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括生物學(xué)和物理植物轉(zhuǎn)化方案。參見 例如 Miki 等，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，，于 Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，B. R. Glick 禾口 J. E. Thompson 編(CRCPress, Inc.，Boca Raton，1993)第67頁(yè)-第88頁(yè)。另外，可獲得用于植物細(xì)胞或組織 轉(zhuǎn)化及植物再生的表達(dá)載體和體外培養(yǎng)方法。參見例如Gruber等，“Vectors for Plant Transformation，，于Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,B. R. Glick 禾口 J. E. Thompson 編(CRCPress, Inc.，Boca Raton, 1993)第 89 頁(yè)-第 119 頁(yè)。Α) 土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化——一種用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中的方法是基于土壤 桿菌屬的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。參見例如Horsch等，Science 227 1229 (1985).根癌土壤桿菌 (A. tumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(A. rhizogenes)是在遺傳上轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原 性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌(A. tumefaciens)的Ti質(zhì)粒和發(fā)根土壤桿菌(A. rhizogenes) 的Ri質(zhì)粒攜帶負(fù)責(zé)植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見例如C. I. Kado, Crit. Rev. Plant Sci. 10 1 (1991)。土壤桿菌屬載體系統(tǒng)和土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法的描述由Gruber等，見上 文，Miki 等，見上文，及 Moloney 等，Plant Cell Reports 8:238(1989)提供。還可參見美 國(guó)專利號(hào) 5，563，055 (Townsend 和 Thomas)，1996 年 10 月 8 日公開。B)直接基因轉(zhuǎn)移——已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種植物轉(zhuǎn)化方法(統(tǒng)稱為直接基因轉(zhuǎn)移)作為 土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的備選。植物轉(zhuǎn)化普遍可適用的方法是微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中在測(cè)量 為1至4 μ m的微粒的表面上攜帶DNA。用生物射彈裝置將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中，所述生 物射彈裝置將微粒加速到300至600m/s的速度，其足以穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。Sanford 等，Part. Sci. Technol. 5 27(1987) J. C. Sanford, Trends Biotech. 6 299(1988) ；Klein 等，Bio/Technology 6:559-563(1988) J. C. Sanford, Physiol. Plant7 206 (1990) ；Klein 等，Biotechnology 10 268 (1992)。還可參見美國(guó)專利號(hào) 5，015，580 (Christou 等)，1991 年5月14日公開；美國(guó)專利號(hào)5，322，783 (Tomes等)，1994年6月21日公開。另一種用于將DNA物理投遞至植物的方法是對(duì)靶細(xì)胞的超聲處理。Zhang等，Bio/ Technology 9:996(1991)?；蛘?，已經(jīng)使用脂質(zhì)體和原生質(zhì)球融合來(lái)將表達(dá)載體導(dǎo)入植物 中。Deshayes 等，EMBO J，4 :2731 (1985) ；Christou 等，Proc Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 84 3962(1987)。還已經(jīng)報(bào)道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或多-L-鳥氨酸來(lái)將DNA直接攝 取到原生質(zhì)體中。Hain 等，Mol. Gen. Genet. 199 161(1985),和 Draper 等，Plant Cell Physiol. 23 :451 (1982)。還已經(jīng)描述了原生質(zhì)體和全細(xì)胞和組織的電穿孔。Dorm等， 于 Abstracts of VIIthInternational Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，第 53 頁(yè)(1990) ；D，Halluin 等，Plant Cell 4 :1495_1505 (1992)，和 Spencer 等，Plant Mol. Biol. 24 :51_61 (1994)。轉(zhuǎn)化向日葵靶標(biāo)組織后，上述選擇性標(biāo)志物基因的表達(dá)容許優(yōu)先選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞、組織和/或植物，其中使用本領(lǐng)域中公知的再生和選擇方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。前述轉(zhuǎn)化方法通常會(huì)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品種。然后可以將轉(zhuǎn)基因品種與另一(非轉(zhuǎn) 化的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的)品種雜交，以產(chǎn)生新轉(zhuǎn)基因品種?；蛘?，可以使用植物育種領(lǐng)域中公知的 傳統(tǒng)回交技術(shù)將遺傳性狀移入另一栽培種中，所述遺傳性狀已經(jīng)使用前述轉(zhuǎn)化技術(shù)工程化 改造入特定的向日葵栽培種中。例如，可以使用回交方法來(lái)將工程化改造的性狀從公共的、 非良種品種移入良種品種中，或者從在其基因組中含有外來(lái)基因的品種移入不含所述基因 的一種或多種品種中。如本文中所使用的，“雜交”可以指簡(jiǎn)單的XxY雜交，或回交過程，這 取決于上下文。向日葵的組織培養(yǎng)
可以通過自花傳粉或者通過組織培養(yǎng)和再生來(lái)進(jìn)行向日葵植物的進(jìn)一步生成，所 述向日葵植物產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子。向日葵的各種組織的組 織培養(yǎng)和自其再生植物是已知的。例如，通過組織培養(yǎng)繁殖向日葵栽培種記載于美國(guó)專利 6，998，516。可以通過組織培養(yǎng)和再生來(lái)進(jìn)行品種的進(jìn)一步繁殖。大豆的各種組織的組織培養(yǎng) 和自其再生植物是公知且廣泛公布的。例如，可以參照美國(guó)專利6，998，516。如此，本發(fā)明 的另一方面是提供如下的細(xì)胞，其在生長(zhǎng)和分化后產(chǎn)生具有含低飽和脂肪和任選地高亞油 酸含量的種子的向日葵植物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“組織培養(yǎng)物”指包含相同或不同類型的分離的細(xì)胞的組 合物，或者組織成植物部分的此類細(xì)胞的集合。組織培養(yǎng)物的例示性類型包括能產(chǎn)生組織 培養(yǎng)物且在植物或植物部分中完整的原生質(zhì)體、愈傷組織、植物塊(plant clump)、和植物 細(xì)胞，諸如胚、花粉、花、種子、莢果、葉、莖、根、根尖、花藥等。用于制備和維持植物組織培養(yǎng) 物的手段是本領(lǐng)域中公知的。舉例而言，已經(jīng)使用構(gòu)成器官的組織培養(yǎng)物來(lái)產(chǎn)生再生植物。 美國(guó)專利號(hào) 5，959，185,5, 973，234,5, 977，445、和 6，998，516 描述了某些技術(shù)。單基因轉(zhuǎn)變的(轉(zhuǎn)變)植物當(dāng)術(shù)語(yǔ)“向日葵植物”在本發(fā)明的語(yǔ)境中使用時(shí)，這還包括所述品種的任何單基因 轉(zhuǎn)變。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“單基因轉(zhuǎn)變的植物”指通過稱作回交的植物育種技術(shù)，或者 經(jīng)由基因工程開發(fā)的那些向日葵植物，其中除了經(jīng)由回交技術(shù)轉(zhuǎn)移到品種中的單基因外， 該品種的基本上所有期望的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征均得到復(fù)原?；亟环椒梢耘c本發(fā)明一起 使用以改善品種或?qū)⒛撤N特征引入品種中。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“回交”指雜種子代往 回與回歸親本的重復(fù)雜交(即與回歸親本回交1、2、3、4、5、6、7、8或更多次)。親本向日葵植 物(其貢獻(xiàn)期望特征的基因)稱作“非回歸”或“供體親本”。此術(shù)語(yǔ)指在回交方案中使用非 回歸親本一次，并且非回歸親本因此不再出現(xiàn)的事實(shí)。接受來(lái)自非回歸親本的一種或多種 基因轉(zhuǎn)移的親本向日葵植物稱為回歸親本，因?yàn)樗诨亟环桨钢斜皇褂昧藬?shù)輪(Poehlman 和Sleper，1994;Fehr，1987)。在典型的回交方案中，將感興趣的原始品種(回歸親本)與 第二品種(非回歸親本)雜交，所述第二品種攜帶要轉(zhuǎn)移的感興趣的單基因。然后將自此 雜交所得的子代再次與回歸親本雜交，并重復(fù)該過程，直至獲得這樣的向日葵植物，即其中 除了來(lái)自非回歸親本的單轉(zhuǎn)移基因外，回歸親本的基本上所有期望的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征 均得到復(fù)原。選擇合適的回歸親本是成功回交方法的重要步驟?；亟环桨傅哪康氖歉淖兓蛱鎿Q 原始品種中的單一性狀或特征。為了實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，對(duì)回歸品種的單基因進(jìn)行修飾或者用來(lái)自 非回歸親本的期望基因替換，而保留原始品種的基本上所有剩余的期望的遺傳構(gòu)成，和因 此保留基本上所有剩余的期望的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)構(gòu)成。特定非回歸親本的選擇會(huì)取決于回 交目的。主要目的之一是將一些商業(yè)上期望的、農(nóng)藝學(xué)上重要的性狀添加至植物。確切的 回交方案會(huì)取決于所改變的特征或性狀以確定合適的測(cè)試方案。雖然當(dāng)所轉(zhuǎn)移的特征是顯 性等位基因時(shí)回交方法得到簡(jiǎn)化，但是也可以轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在此例子中，引入子代測(cè) 試來(lái)測(cè)定期望的特征是否已經(jīng)得到成功轉(zhuǎn)移可能是必要的。已經(jīng)鑒定出許多單基因性狀，它們?cè)谛缕贩N的開發(fā)中不會(huì)有規(guī)律地被選擇，但是 可以通過回交技術(shù)來(lái)改良。單基因性狀可以是或者不是轉(zhuǎn)基因的，這些性狀的例子包括但
19不限于雄性不育、蠟質(zhì)淀粉、除草劑抗性、對(duì)細(xì)菌、真菌、或病毒疾病的抗性、抗蟲性、雄性能 育、提高的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量、工業(yè)應(yīng)用、產(chǎn)率穩(wěn)定性和產(chǎn)率提高。這些基因一般經(jīng)由細(xì)胞核遺傳。這 些單基因性狀之中的數(shù)個(gè)記載于美國(guó)專利號(hào)5，959，185,5, 973，234和5，977，445。
本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生向日葵植物的方法，其通過將第一親本向日葵植物與第二 親本向日葵植物雜交來(lái)進(jìn)行，其中所述第一或第二親本向日葵植物是產(chǎn)生具有低飽和脂肪 和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物。此外，第一和第二親本向日葵植物兩者都可 以來(lái)源于產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物。如此，使用產(chǎn) 生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物進(jìn)行的任何此類方法是本 發(fā)明的一部分(例如自交、回交、雜種生成、與群體雜交等)。使用產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任 選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物作為親本產(chǎn)生的所有植物在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括 那些自從產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子的向日葵植物衍生的品種開 發(fā)的。有利地，可以在與其它不同向日葵植物的雜交中使用所述向日葵品種以產(chǎn)生具有卓 越特征的第一代(F1)向日葵雜種種子和植物。本發(fā)明的品種也可以用于轉(zhuǎn)化，其中導(dǎo)入外 源基因，并由本發(fā)明的品種進(jìn)行表達(dá)。使用如下向日葵植物經(jīng)由傳統(tǒng)育種方法或者經(jīng)由通 過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方案之任一種轉(zhuǎn)化如下向日葵植物而創(chuàng)建的遺傳變體意圖 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述向日葵植物產(chǎn)生具有低飽和脂肪和任選地高亞油酸含量的種子。
實(shí)施例本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例作為例示提供，而并不意圖 以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1 產(chǎn)生具有低飽和脂肪含量的種子的向日葵已經(jīng)經(jīng)由正常的育種技術(shù)開發(fā)出了具有低得異乎尋常的飽和類水平(saturate level)的向日葵種質(zhì)。表1中提供了向日葵栽培種的種子含油量。表1
樣品C16:0 C16:l C18:0 C18:l C18:2 ^^
H757B/LS10670B-B -17-3-23.06
H757B/LS10670B-B -17-3-33.11
2.34 0.09 0.48 94.18 1.51 3.39 2.82 2.47 0.11 0.51 93.62 2.11 3.42 2.98
權(quán)利要求
向日葵栽培種的種子，其中所述種子中的油的脂肪酸組成包含總計(jì)約3.3％或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的向日葵栽培種的種子，其中所述種子的含油量包含共計(jì)大約或小 于3%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)。
3.向日葵植物或其部分，其是通過種植權(quán)利要求1的種子來(lái)產(chǎn)生的。
4.用于產(chǎn)生&雜種向日葵種子的方法，其中所述方法包括將權(quán)利要求3的植物與不同 向日葵植物雜交，并收獲所得的F1雜種向日葵種子。
5.通過權(quán)利要求4的方法產(chǎn)生的雜種向日葵種子。
6.將期望的性狀引入根據(jù)權(quán)利要求3的向日葵植物中的方法，其中所述方法包括(a) 將根據(jù)權(quán)利要求3的向日葵植物與包含期望性狀的另一向日葵栽培種的植物雜交以產(chǎn)生F1 子代植物，其中所述期望的性狀選自下組雄性不育、除草劑抗性、抗蟲性、和對(duì)細(xì)菌疾病、 真菌疾病或病毒疾病的抗性；(b)選擇一株或多株具有所述期望性狀的子代植物以產(chǎn)生選 定的子代植物；(c)將所述選定的子代植物與根據(jù)權(quán)利要求3的向日葵植物雜交以產(chǎn)生回 交子代植物；(d)選擇具有所述期望的性狀并且能夠產(chǎn)生具有如下含油量的種子的回交子 代植物，即包含總計(jì)約3. 3%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量，以產(chǎn)生回交子 代植物以產(chǎn)生選定的回交子代植物；并(e)重復(fù)步驟(c)和(d)三次或更多次以產(chǎn)生選定 的第四或更高的回交子代植物，其包含所述期望的性狀，并且能夠產(chǎn)生具有如下含油量的 種子，即包含總計(jì)約3. 3%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
7.權(quán)利要求6的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求3的向日葵植物包含總計(jì)大約或小于2.8% 的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
8.在種子油方面穩(wěn)定化的良種向日葵栽培種，所述種子油包含總計(jì)約3.3%或更少的 棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的在種子油方面穩(wěn)定化的良種向日葵栽培種，其中所述種子油包含 總計(jì)大約或小于3%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
10.權(quán)利要求8的良種向日葵栽培種，其中所述期望的性狀是除草劑抗性，而且賦 予對(duì)選自下組的除草劑的抗性咪唑啉酮、磺酰脲、草甘膦、草銨膦、L-草銨膦、三嗪、 (163什丨61(1、麥草畏、2，4-0、和苯基氰。
11.至少一種良種向日葵植物的種子，所述種子在種子油方面是穩(wěn)定化的，所述種子油 包含總計(jì)約3. 3%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的種子，其中所述種子油包含總計(jì)大約或小于3%的棕櫚酸 (16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
13.自良種向日葵品種的向日葵種子提取的向日葵油的整裝樣品，所述向日葵油具有 如下的脂肪酸譜，其包含總計(jì)約3. 3%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量，所述 脂肪酸譜在所述良種向日葵品種的種子油中是穩(wěn)定化的。
14.根據(jù)權(quán)利要求19的自良種向日葵品種的向日葵種子提取的向日葵油的整裝樣品， 其中所述向日葵油的脂肪酸譜包含總計(jì)大約或小于3%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0) 含量。
15.來(lái)自良種向日葵品種種子的油，所述油具有如下的脂肪酸譜，其包含總計(jì)約3.3% 或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的來(lái)自良種向日葵品種種子的油，其中未氫化油的脂肪酸譜包含 總計(jì)大約或小于3%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量。
17.向日葵栽培種的種子中的油，所述油具有如下的脂肪酸含量，其包含總計(jì)3.3%或 更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)。
18.權(quán)利要求17的油，其用于食品應(yīng)用。
19.食物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求17的油。
20.植物油組合物，其包含權(quán)利要求17的油。
21.向日葵栽培種的種子，其中所述種子的含油量包含總計(jì)約12%或更少的棕櫚酸 (16:0)和硬脂酸(18:0)含量和約15%或更多的亞油酸(18:2)含量。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的向日葵栽培種的種子，其中總計(jì)棕櫚酸(16:0)和硬脂酸 (18:0)含量小于約11%，并且其中總亞油酸(18:2)含量大于約20%。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的向日葵栽培種的種子，其中總計(jì)棕櫚酸(16:0)和硬脂酸 (18:0)含量小于約4. 1%，并且其中總亞油酸(18:2)含量大于約74%。
24.向日葵植物或其部分，其是通過種植權(quán)利要求21的種子來(lái)產(chǎn)生的。
25.用于產(chǎn)生F1雜種向日葵種子的方法，其中所述方法包括將權(quán)利要求23的植物與不 同向日葵植物雜交，并收獲所得的F1雜種向日葵種子。
26.通過權(quán)利要求25的方法產(chǎn)生的雜種向日葵種子。
27.將期望的性狀引入根據(jù)權(quán)利要求24的向日葵植物中的方法，其中所述方法包括: (a)將根據(jù)權(quán)利要求24的向日葵植物與包含期望性狀的另一向日葵栽培種的植物雜交以 產(chǎn)生F1子代植物，其中所述期望的性狀選自下組雄性不育、除草劑抗性、抗蟲性、和對(duì)細(xì)菌 疾病、真菌疾病或病毒疾病的抗性；(b)選擇一株或多株具有所述期望性狀的子代植物以 產(chǎn)生選定的子代植物；(c)將所述選定的子代植物與根據(jù)權(quán)利要求24的向日葵植物雜交以 產(chǎn)生回交子代植物；(d)選擇具有所述期望的性狀并且能夠產(chǎn)生具有如下含油量的種子的 回交子代植物，即包含總計(jì)約3. 3%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量，以產(chǎn)生 回交子代植物以產(chǎn)生選定的回交子代植物；并(e)重復(fù)步驟(c)和(d)三次或更多次以產(chǎn) 生選定的第四或更高的回交子代植物，其包含所述期望的性狀，并且能夠產(chǎn)生具有如下含 油量的種子，即包含總計(jì)約12%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量和約15%或 更多的亞油酸(18:2)含量。
28.在種子油方面穩(wěn)定化的良種向日葵植物，其包含總計(jì)約12%或更少的棕櫚酸 (16:0)和硬脂酸(18:0)含量和約15%或更多的亞油酸(18:2)含量。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的在種子油方面穩(wěn)定化的良種向日葵植物，其中所述種子油包含 總計(jì)大約或小于11%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量和大約或大于20%的總亞油 酸(18:2)含量。
30.至少一種良種向日葵植物的種子，所述種子在種子油方面是穩(wěn)定化的，所述種子油 包含總計(jì)約12%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量和約15%或更多的亞油酸 (18:2)含量。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的至少一種良種向日葵植物的種子，其中所述種子在種子油方面 是穩(wěn)定化的，所述種子油包含總計(jì)大約或小于11%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量 和大約或大于20%的總亞油酸(18:2)含量。
32.自良種向日葵栽培種的向日葵種子提取的向日葵油的整裝樣品，所述向日葵油 具有如下的脂肪酸譜，所述脂肪酸譜包含總計(jì)約12%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸 (18:0)含量和約15%或更多的亞油酸(18:2)含量，所述脂肪酸譜在所述良種向日葵栽培 種的種子油中是穩(wěn)定化的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的自良種向日葵栽培種的向日葵種子提取的向日葵油的整裝 樣品，其中所述向日葵油的脂肪酸譜包含總計(jì)大約或小于11%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸 (18:0)含量和大約或大于20%的總亞油酸(18:2)含量。
34.自良種向日葵栽培種的種子提取的油，所述油具有如下的脂肪酸譜，其含總計(jì)約 12%或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量和約15%或更多的亞油酸(18:2)含量， 所述脂肪酸譜在所述良種向日葵栽培種的種子油中是穩(wěn)定化的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的來(lái)自良種向日葵栽培種的種子的油，其中所述油的脂肪酸譜包 含總計(jì)大約或小于11%的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量和大約或大于20%的總亞 油酸(18:2)含量。
36.向日葵栽培種的種子中的油，所述油具有如下的脂肪酸含量，其包含總計(jì)約12% 或更少的棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)含量和約15%或更多的亞油酸(18:2)含量。
37.權(quán)利要求36的油，其用于食品應(yīng)用。
38.食物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求36的油。
39.植物油組合物，其包含權(quán)利要求36的油。
全文摘要
提供了能夠產(chǎn)生低飽和脂肪和任選地高亞油酸的向日葵油的向日葵、其部分、培養(yǎng)物、和種子以及相關(guān)方法。
文檔編號(hào)A01H5/10GK101945573SQ200880127223
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者安杰拉·L·埃里克森, 查爾斯·J·卡爾, 羅伯特·M·本森, 詹姆斯·T·格迪斯 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司