專利名稱：：用于生物燃料生產(chǎn)的優(yōu)化的分子方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的公開的實(shí)施方式處于用于生物燃料生產(chǎn)的系統(tǒng)和方法的領(lǐng)域，特別是利用微藻生產(chǎn)生物燃料的系統(tǒng)和方法。背景近來，石油的價(jià)格顯著地波動(dòng)，達(dá)到了記錄性的高度，以及產(chǎn)生了戲劇性的向下回落。部分地，當(dāng)前的價(jià)格升高反映了政治和供應(yīng)鏈的不確定性。對(duì)便宜的石油供應(yīng)品的可用性的關(guān)注產(chǎn)生了不斷成熟的認(rèn)識(shí)，工業(yè)化國(guó)家的能源獨(dú)立性具有關(guān)鍵的戰(zhàn)略重要性。一般還公認(rèn)的是，來自化石燃料燃燒的co2的釋放實(shí)質(zhì)上促進(jìn)了全球變暖和氣候變化。作為這些關(guān)注的結(jié)果，碳中性的生物燃料的國(guó)內(nèi)生產(chǎn)成為對(duì)進(jìn)口的化石燃料消費(fèi)的越來越吸引人的備選方案。在1970年代晚期和1990年代期間，美國(guó)能源部門的國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)評(píng)估了從各種水生和陸地光合生物生產(chǎn)生物燃料的經(jīng)濟(jì)可行性(Sheehanetal.，1998)。來自微藻的生物燃料生產(chǎn)被確定為具有所篩選的任何生物體的最大的產(chǎn)量/英畝潛力。估計(jì)微藻生物燃料生產(chǎn)是最好的陸地生物燃料生產(chǎn)系統(tǒng)的8到24倍。雖然很有前景，仍然需要在來自微藻的生物燃料生產(chǎn)中產(chǎn)生更高效率的系統(tǒng)和方法。發(fā)明概述如以下更詳細(xì)描述的示范性的組合物和方法滿足了現(xiàn)有技術(shù)的這種和其他的未滿足的需求。在一個(gè)方面，本發(fā)明的實(shí)施方式利用了理論的遺傳學(xué)和化學(xué)工程化策略來實(shí)現(xiàn)來自微藻的生物燃料生產(chǎn)中的再更高的效率。這些提高的效率可以通過在此公開的靶向的和良好設(shè)計(jì)的化學(xué)和遺傳工程化方法的應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)。示范性的實(shí)施方式集中于提高單細(xì)胞油產(chǎn)量，提高藻類培養(yǎng)密度和提高油生產(chǎn)的效率。單獨(dú)地或組合地，示范性的實(shí)施方式可以降低生產(chǎn)一桶生物燃料的成本以允許商業(yè)上的生存性。在此公開的組合物、系統(tǒng)和方法的示范性的實(shí)施方式可以單獨(dú)地或以不同的組合使用，來提高來自微藻的脂質(zhì)生產(chǎn)和油提取。與其他特征一起，在此公開的實(shí)施方式可以通過利用至少一種以下策略提高脂質(zhì)生產(chǎn)1)提高細(xì)胞培養(yǎng)物密度，2)提高細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯積累，和3)利用新的脂質(zhì)收獲技術(shù)來非破壞性地從活培養(yǎng)物收獲油。因此，示范性的實(shí)施方式包括提高藻類物種中的脂質(zhì)生產(chǎn)的方法，包括提供含油的藻類；和向所述含油藻類飼喂生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有有效量的甘油，與用不含有甘油的生長(zhǎng)培養(yǎng)基飼喂的相應(yīng)的含油藻類相比，其提高所述含油藻類的脂質(zhì)生產(chǎn)。在特定的實(shí)施方式中，所述藻類被遺傳學(xué)地修飾。在某些實(shí)施方式中，所述藻類是光合成的。在各種實(shí)施方式中，所述光合成的藻類可以在所述藻類的光合過程基本上無(wú)活性的時(shí)期期間飼喂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。具體的實(shí)施方式包括表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼小抑制性核糖核酸(“siRNA”)分子的核苷酸序列。某些實(shí)施方式包括siRNA，所述siRNA抑制選自由編碼Cao、LHCII_b、PDC、PFL1/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成的組的一種或更多種代謝基因的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼兩種代謝基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼三種代謝基因。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼四種代謝基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼五種代謝基因。在各種示范性的實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼PDC、PFL1/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼LHCII-b、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)。在可選擇的實(shí)施方式中，所述代謝基因編碼Cao、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)。示范性的實(shí)施方式包括抑制編碼AGPase、Cao、LHC_IIb、PDC或PFL1/PFLA的一種或更多種核酸分子的表達(dá)的siRNA分子。其他描述的實(shí)施方式包括基因堆疊的表達(dá)載體，其包含與表達(dá)控制序列相連的一種或更多種核酸序列，所述核酸序列編碼刺激提高的脂質(zhì)生產(chǎn)的一種或更多種多肽，其中所述多肽選自由ACCase、DGAT、油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白構(gòu)成的組。在實(shí)施例實(shí)施方式中，所述載體可以與抗生素抗性基因可操作連接。在可選擇的實(shí)施方式中，所述基因堆疊表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含選自以下的一種或更多種基因(i)能夠?yàn)檗D(zhuǎn)化的藻類賦予莠去津(atrazine)抗性的突變的psbA基因，(ii)來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合酶基因，(iii)編碼兔嗜中性粒細(xì)胞肽-l(NP-l)多肽的基因，(iv)賦予抗生素抗性的一種或更多種基因。在示范性的實(shí)施方式中，所述基因堆疊表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含編碼多肽NP-1的核酸序列。在又一個(gè)示范性的實(shí)施方式中，所述基因堆疊表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼小抑制性核糖核酸(“siRNA”)分子的核苷酸序列，所述小抑制性核糖核酸分子抑制選自由編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成的組的一種或更多種代謝基因的表達(dá)。另一個(gè)實(shí)施方式包括包含與表達(dá)控制序列可操作連接的核酸序列的表達(dá)載體，所述核酸序列編碼PCC7942ftp-l基因。在可選擇的實(shí)施方式中，所述載體可以進(jìn)一步包含與表達(dá)控制序列可操作連接的核酸序列，所述核酸序列編碼選自下組的一種或更多種多肽ACCaSe、DGAT、油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包含編碼PCC7942ftp-l基因的核酸序列的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含編碼siRNA分子的核苷酸序列，所述siRNA分子抑制選自由編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成的組的一種或更多種代謝基因的表達(dá)。在可選擇的實(shí)施方式中，包含編碼PCC7942ftp_l基因的核酸序列的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含選自以下的一種或更多種基因(i)能夠?yàn)檗D(zhuǎn)化的藻類賦予莠去津抗性的突變的psbA基因，(ii)來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合酶基因，(iii)編碼兔嗜中性粒細(xì)胞肽-l(NP-l)多肽的基因，(iv)賦予抗生素抗性的一種或更多種基因。示范性的實(shí)施方式還廣泛地涉及重組藻類，所述重組藻類包含所述表達(dá)盒、基因堆疊表達(dá)載體和/或此處描述的其他表達(dá)載體的一種或更多種。還公開的是遺傳修飾藻類物種的方法，包括(a)向所述藻類的基因組中導(dǎo)入選自以下的兩種或更多種核酸序列以獲得轉(zhuǎn)化的藻類(i)編碼小抑制性核糖核酸(“siRNA”)分子的一種或更多種核苷酸序列，所述小抑制性核糖核酸分子抑制編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFL1/PFLA或AGPase蛋白質(zhì)的一種或更多種代謝基因的表達(dá)；(ii)編碼選自ACCase、DGAT、油體鈣蛋白或油質(zhì)蛋白的一種或更多種多肽的一種或更多種核酸序列；(iii)與表達(dá)控制序列可操作連接的、編碼PCC7942ftp-l基因的核酸序列；(iv)能夠?yàn)檗D(zhuǎn)化的藻類賦予莠去津抗性的psbA基因的突變的形式，(v)來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合酶基因，(vi)編碼兔嗜中性粒細(xì)胞肽-l(NP-l)多肽的基因，(vii)賦予抗生素抗性的一種或更多種基因，和(b)選擇在培養(yǎng)中展現(xiàn)了提高的生長(zhǎng)或油生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化的藻類。附圖的簡(jiǎn)要描述當(dāng)參考附圖時(shí)，將得到本發(fā)明的示范性的實(shí)施方式的更好的理解，在附圖中附圖1是顯示可利用遺傳操作來改善生物燃料的生產(chǎn)的潛在區(qū)域的說明性的示意圖。附圖2A，衣藻屬類囊體膜的吸收光譜(900Chl/RC)。B，缺少LHC復(fù)合物和chlb的分離的PSII核心顆粒(50Chl/RC)的吸收光譜。注意到類胡蘿卜素吸收光帶(450nm)中的降低和650nm處的肩部歸因于Chlb。附圖3是顯示類囊體中存在的光合成電子傳遞復(fù)合物的示意圖，所述類囊體顯示了LHCb-II與PSII復(fù)合物的締合。附圖4展現(xiàn)了葉綠素b缺陷的突變體的光依賴性光合活性為野生型細(xì)胞的2.5倍(Polleetal.，1999)。完全的日光強(qiáng)度是2，000iimol光子/m2/sec。附圖5圖表性地顯示了可以利用來敲低LHC復(fù)合物的示范性的RNAi盒。附圖6是顯示可以利用來改變蛋白質(zhì)表達(dá)的許多構(gòu)建體的示意圖。附圖7是說明甘油三酯合成途徑中的重要步驟和提高脂質(zhì)生產(chǎn)和積累的基因目標(biāo)的示意圖。注意到，包被脂質(zhì)貯存體的油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)在這個(gè)圖中沒有被鑒定。附圖8是展現(xiàn)油質(zhì)蛋白和油體鈣蛋白在藻類中脂質(zhì)的貯存和穩(wěn)定化方面的作用的示意圖。還顯示了atOLEOl表達(dá)盒。附圖9是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡，所述轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)由提高原殼小球藻(Chlorellaprotothecoides)中的脂質(zhì)積累的條件(-N)所誘導(dǎo)(Hortensteineretal.，2000；Naestedetal.，2000)。附圖10在光照生長(zhǎng)的原殼小球藻(Chlorellaprotothecoides)中葡萄糖對(duì)油和葉綠素含量的影響。通過尼羅紅熒光間接地測(cè)定油水平。附圖11顯示了補(bǔ)充甘油(摩爾濃度)的培養(yǎng)基對(duì)藻類生長(zhǎng)速率的影響。注意到，甘油提高了原殼小球藻生長(zhǎng)；甘油是生物柴油的副產(chǎn)物。附圖12是展現(xiàn)甘油有效地刺激生長(zhǎng)至少10倍的數(shù)據(jù)的圖表。附圖13是展現(xiàn)總脂質(zhì)產(chǎn)量被甘油提高的數(shù)據(jù)柱形圖。附圖14是展現(xiàn)甘油被有效地轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的表格。附圖15展現(xiàn)了RuBP的羧化作用和氧化可以在通過各種方法分離之后利用[1-3H]-RuBP測(cè)量不連續(xù)標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物來同時(shí)地測(cè)量。詳細(xì)說明除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明屬于的
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。雖然類似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以被用于示范性的實(shí)施方式的實(shí)踐或測(cè)試，以下描述了適合的方法和材料。在此提及的所有公開物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用將它們完整地合并。在沖突的情況下，當(dāng)前的說明書，包括定義，是支配性的。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，而不意圖是限制性的。在此使用的“遺傳工程化”、“分子生物學(xué)”和“遺傳操作”是指在生物體的基因中的定向的和計(jì)劃的改變，它們是質(zhì)體、線粒體、葉綠體、核或載體誘導(dǎo)的。在此使用的，"RNAi”和“RNA干擾”是指RNA的使用，所述RNA被設(shè)計(jì)以被細(xì)胞加工成特定RNA的小片段，所述小片段控制細(xì)胞中的活性。另外，可以產(chǎn)生合成的雙鏈RNA(dsRNA)、小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)，它們模擬天然RNAi系統(tǒng)的產(chǎn)物，或直接地影響RNAi系統(tǒng)，作為本發(fā)明的RNAi盒的成分是期待的。在此使用的，“抑制表達(dá)”在此是指在存在本發(fā)明的實(shí)施方式的遺傳構(gòu)建體的情況下，相比在相同條件下野生型生物體的表達(dá)，表達(dá)水平可檢測(cè)地降低。在實(shí)際的方法中，這種抑制作用常?？梢允腔蚧钚缘?00%，然而，這可以通過構(gòu)建體的類型來有選擇地控制，所述構(gòu)建體的類型被設(shè)計(jì)以取決于構(gòu)建體中的啟動(dòng)子和次級(jí)調(diào)節(jié)序列來提供10%到100%。“基因”或“編碼”特定蛋白質(zhì)“的序列”，是一種核酸分子，當(dāng)置于合適的調(diào)節(jié)序列的控制下時(shí)，在體外或體內(nèi)其被轉(zhuǎn)錄(對(duì)于DNA來說)和翻譯(對(duì)mRNA來說)成為多肽?；虻倪吔缬?'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定?；蚩梢园?，但不限于，來自真核mRNA的cDNA，來自真核DNA的基因組DNA序列，以及甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于基因序列的3'。一般地，提供多腺苷酸化信號(hào)來終止被插入到重組病毒中的基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是，術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白質(zhì)”是指通過肽鍵按特定序列連接的氨基酸的線性聚合物。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指氨基酸的D或L立體異構(gòu)體形式，除非另外具體地指定了。術(shù)語(yǔ)“可操作連接的”是指各種核酸分子元件相互之間的排列，從而元件是功能地連接的，并能夠相互作用。這些元件可以包括，無(wú)限制地，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化序列、一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)含子和/或外顯子，以及要表達(dá)的感興趣的基因(即，轉(zhuǎn)基因)的編碼序列。當(dāng)可操作地連接時(shí)，核酸序列元件一起作用來調(diào)節(jié)彼此的活性，最終可以影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的水平。調(diào)節(jié)是指提高、降低或維持特定元件的活性的水平。一般地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)提高了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，優(yōu)選的，血管生成抑制多肽Vasculostatin的表達(dá)。與其他元件相對(duì)的每個(gè)元件的位置可以按照每個(gè)元件的5'末端和3'末端來表述。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”被用于指哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)外源DNA的攝取。當(dāng)外源DNA被導(dǎo)入細(xì)胞膜的內(nèi)部時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見，Grahametal.(1973)Virology,52456；andSambrooketal.(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork。這樣的技術(shù)可用于將一個(gè)或更多個(gè)外源DNA部分，例如，病毒載體和其他核酸分子導(dǎo)入到適合的宿主細(xì)胞中。該術(shù)語(yǔ)是指遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定的和短暫的攝取。術(shù)語(yǔ)“載體”被用于指載體核酸分子，其中可以插入核酸序列，用于導(dǎo)入到它可以復(fù)制的細(xì)胞中。核酸序列可以是“外源的”，這是指它對(duì)于導(dǎo)入載體的細(xì)胞是外來的，或所述序列與細(xì)胞中的序列同源，但是處在宿主細(xì)胞核酸之內(nèi)該序列通常不存在的位置中。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)和人工染色體(例如，YACs)。通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很好地準(zhǔn)備來構(gòu)建載體(參見，例如，Maniatisetal.，1988andAusubeletal.，1994，兩者都通過引用合并在此)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指任何類型的遺傳構(gòu)建體，其包含編碼能被轉(zhuǎn)錄的RNA的核酸。在某些情況下，RNA分子然后被翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。在其它情況下，這些序列不被翻譯，例如，在反義分子或核酶的生產(chǎn)中。表達(dá)載體可以含有多種的“控制序列”，這是指在特定宿主細(xì)胞中可操作連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄以及可能的翻譯所必需的核酸序列。除了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達(dá)載體可以含有也提供其他功能、在下文描述的核酸序列。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指直接或間接地調(diào)節(jié)與它可操作連接的相應(yīng)核酸編碼序列的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動(dòng)子可以單獨(dú)地起作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，或在某些情況下，可以與一種或更多種其他調(diào)節(jié)序列，例如增強(qiáng)子或沉默子一起作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子包含DNA調(diào)節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列來源于基因，其能夠結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3'方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子一般地包括起作用來定位RNA合成的起始位點(diǎn)的序列。這個(gè)的公知的實(shí)例是TATA框，但是在某些缺乏TATA框的啟動(dòng)子中，例如，哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子，和SV40晚期基因的啟動(dòng)子，覆蓋了起始位點(diǎn)本身的獨(dú)立元件幫助固定開始的位置。其他的啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。一般地，這些位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域中，而許多啟動(dòng)子已經(jīng)顯示了也含有起始位點(diǎn)下游的功能元件。為了使編碼序列“處在”啟動(dòng)子的“控制下”，人們將轉(zhuǎn)錄閱讀框的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5'末端置于所選的啟動(dòng)子的“下游”(即，3'端)。“上游”啟動(dòng)子刺激DNA的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)編碼的RNA的表達(dá)。啟動(dòng)子元件之間的間隔通常是靈活的，從而當(dāng)元件相對(duì)于彼此被反轉(zhuǎn)或移動(dòng)時(shí)，啟動(dòng)子功能被保留。取決于啟動(dòng)子，看起來，獨(dú)立的元件可以協(xié)同地或獨(dú)立地起作用來活化轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以或可以不與“增強(qiáng)子”連接地使用，增強(qiáng)子是指核酸序列的轉(zhuǎn)錄活化中涉及的順式作用調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子可以與核酸序列天然地相連，可以通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5'非編碼序列來獲得。這樣的啟動(dòng)子可以稱為“內(nèi)源的”。類似地，增強(qiáng)子可以是與核酸序列天然地相連的，位于該序列的下游或上游。做為選擇，通過將編碼核酸片段置于重組或異源啟動(dòng)子的控制下，可以獲得某些優(yōu)點(diǎn)，所述重組或異源啟動(dòng)子是指通常在它的自然環(huán)境中不與核酸序列相連的啟動(dòng)子。重組或異源增強(qiáng)子還指在它的自然環(huán)境中通常不與核酸序列相連的增強(qiáng)子。這樣的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可以包括其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以及從任何其他病毒、或原核或真核細(xì)胞分離的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以及非“天然存在的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即，含有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的不同元件和/或改變表達(dá)的突變。除了合成地產(chǎn)生啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列之外，序列可以利用重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)，與在此公開的組合物一起來產(chǎn)生。此外，期待的是，也可以采用指導(dǎo)非核細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體等等之內(nèi)的序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的控制序列。兩個(gè)序列之間的百分之同一性或同源性的確定利用KarlinandAltschul(1990)Proc.Nat'1Acad.Sci.USA87:2264_2268的、在KarlinandAltschul(1993)Proc.Nat'1Acad.Sci.USA90:5873_5877中修改的的算法來實(shí)現(xiàn)。這樣的算法被合并在Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中?？梢杂肗BLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，分值=100，字長(zhǎng)=12，來獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白檢索，分值=50，字長(zhǎng)=3，來獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對(duì)，可以利用如Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389_3402中描述的GappedBLAST。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)°參見http://www.ncbi.nlm.術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”是本領(lǐng)域根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案已知的(例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,editorsF.Ausubeletal.,JohnWileyandSons,Inc.1994),被理解為與以下定義的一樣嚴(yán)格的條件在0.5MNaHP04(pH7.2)、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)UmMEDTA中在+65°C下與濾器結(jié)合的DNA雜交，在0.1倍SSC/0.1%SDS中在+68°C下洗滌。還包括在本發(fā)明內(nèi)的是，具有一核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列是在此公開的公開核酸的簡(jiǎn)并變體。三個(gè)核苷酸的連續(xù)分組，“密碼子”編碼一個(gè)氨基酸。由于存在64種可能的密碼子，但是僅有20種天然的氨基酸，大多數(shù)氨基酸由超過一個(gè)密碼子編碼。遺傳密碼的這種天然的“簡(jiǎn)并性”或“冗余”是本領(lǐng)域公知的。因而將理解的是，序列表中所示的核酸序列僅提供了將編碼如上描述的多肽的、很多但明確的一組核酸序列中的實(shí)例。實(shí)例的實(shí)施方式還包括核酸分子編碼的分離的多肽?！胺蛛x的”多肽是基本上沒有與之天然地相關(guān)的蛋白質(zhì)和其他天然存在的有機(jī)分子的多肽。純度可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法來測(cè)量，例如，柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC?？梢垣@得分離的多肽，例如，通過從天然來源(例如，藻類細(xì)胞)提??；通過表達(dá)編碼多肽的重組核酸；或通過多肽的化學(xué)合成。在通過從天然來源提取獲得的多肽的情境下，“基本上沒有”是指所述多肽構(gòu)成了所述制品的干重的至少60%(例如，至少75%、90%或99%)?；瘜W(xué)地合成的、或從與該蛋白質(zhì)天然起源的來源不同的來源產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，被定義為基本上沒有它的天然相關(guān)的成分。因而，分離的多肽包括例如，體內(nèi)地，例如在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中，或體外地，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，在大腸桿菌或其他單細(xì)胞微生物中，或在昆蟲細(xì)胞中合成的重組多肽。還包括在本發(fā)明中的是帶有修飾，例如，取代、小的刪除、插入或反轉(zhuǎn)的多肽，盡管如此所述多肽基本上具有Vasculostatin多肽的生物學(xué)活性。因此，包括在本發(fā)明中的是多肽，其氨基酸序列至少95%相同于(例如，至少96%、97%、98%或99%相同于)所公開的多肽序列?！巴恍园俜直取备鶕?jù)上文描述的算法來定義。還包括在本發(fā)明中的是被翻譯后修飾的本發(fā)明的多肽，例如，通過N-末端信號(hào)序列的裂解，其可以是，例如，1到25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。利用許多遺傳性和化學(xué)工程化策略，本發(fā)明的示范性的實(shí)施方式是針對(duì)提高可從藻類收獲的富含能源的脂質(zhì)(例如，甘油三酯)的產(chǎn)量。雖然如下所述的許多示范性的實(shí)施方式分別是有用的，當(dāng)前系統(tǒng)的示范性的組合物、系統(tǒng)和方法可以令人稱贊地工作來成本有效地使產(chǎn)量最大化。雖然在此公開的系統(tǒng)、組合物和方法可以利用許多生物提供可接受的結(jié)果，至少一種示范性的實(shí)施方式利用了原殼小球藻。綠藻原殼小球藻是特別合適的，因?yàn)樗诟吲囵B(yǎng)細(xì)胞密度下生長(zhǎng)，一般是大多數(shù)藻類的10倍。當(dāng)在理想條件下異養(yǎng)地生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)原殼小球藻記錄了高達(dá)35gfV/L的創(chuàng)紀(jì)錄的生物質(zhì)產(chǎn)量。原殼小球藻能夠?qū)⑺纳镔|(zhì)的至少55%積累為脂質(zhì)，是大多數(shù)藻類株系達(dá)不到的值。原殼小球藻可以在葡萄糖或玉米甜味劑水解產(chǎn)物(CSH)上異養(yǎng)地生長(zhǎng)。異養(yǎng)的生長(zhǎng)提高了脂質(zhì)含量，可以降低對(duì)太陽(yáng)能的直接依賴性。原殼小球藻產(chǎn)生的生物柴油的能量密度與基于石油的柴油相當(dāng)(Xuetal.,2006；MiaoandWu，2006)。原殼小球藻產(chǎn)生的生物柴油的冷濾溫度低于柴油燃料的(Xuetal.,2006；MiaoandWu，2006)。小球藻屬以及其他微藻物種具有被遺傳工程化的潛力，它們已經(jīng)利用廢氣作為富集的C02的來源在大規(guī)模光生物反應(yīng)器中成功地生長(zhǎng)。提高培養(yǎng)物光利用效率和密度提高培養(yǎng)物密度對(duì)生物燃料產(chǎn)量具有正面的直接影響，因?yàn)楫a(chǎn)生給定體積的油需要更少的培養(yǎng)體積。本發(fā)明的示范性的實(shí)施方式通過提高光合成的光利用效率和通過降低培養(yǎng)物自我遮蔽來提高培養(yǎng)物密度。這些革新容許向更稠密的培養(yǎng)物中更深的光穿透。LHC復(fù)合物吸收的超過90%的能量未被有效地收獲用于化學(xué)能量的生產(chǎn)。LHC葉綠素(Chi)吸收的大部分能量作為熒光被重新輻射，或作為通過非光化學(xué)淬滅的熱量而損失。已經(jīng)展現(xiàn)的是，光驅(qū)動(dòng)的光合成的氧放出的速率可以通過LHC復(fù)合物的消除來實(shí)質(zhì)上提高(3X)。在沒有LHC復(fù)合物(900Chl/反應(yīng)中心(RC))的情況下，光線被光系統(tǒng)I和IIRC復(fù)合物的近端天線Chls(50Chl/RC)吸收(附圖1A和B，和附圖2)(RuffleandSayre，1998)。在本發(fā)明的至少一個(gè)示范性的實(shí)施方式中，更高的培養(yǎng)物密度通過消除葉綠素a/b結(jié)合，光收獲類囊體膜的天線(LHC)復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)。LHC復(fù)合物從微藻中的消除可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多誘變和轉(zhuǎn)基因方法來實(shí)現(xiàn)。具體地，消除可以通過至少以下的方法來獨(dú)特地實(shí)現(xiàn)Chib合成的抑制和/或LHC蛋白質(zhì)合成的抑制。葉綠素a加氧酶基因(Cao)的誘變已經(jīng)顯示了阻斷葉綠素b合成并阻止結(jié)合Chib的LHC復(fù)合物的積累(Egginketal.，2004；Espinedaetal.，1999；PlumleyandSchmidt，1995；Tanakaetal.，1998)。如附圖4中所示，Chib合成阻斷的藻類具有野生型細(xì)胞的幾乎3倍的光合電子傳遞的光飽禾口速率或放氧(oxygenevolving)活性。這種更高的光飽和水平容許培養(yǎng)物中的更高的光穿透，和Chi所吸收的可獲得光子的更有效的利用。存在著與LHC表達(dá)的抑制相關(guān)的一些損失。在低光強(qiáng)度下的光收獲被降低，吸收光譜被改變(附圖1，A和B)。有趣地，缺乏LHC復(fù)合物的分離的PSII核心顆粒，當(dāng)利用光系統(tǒng)II電子受體分析時(shí)，與完整的類囊體相比，具有每單位葉綠素10倍高的放氧速率。為了降低原殼小球藻中的LHC含量，必需從原殼小球藻分離和測(cè)序編碼葉綠素a氧化酶和LHCB-II的高度保守的基因(PlumleyandSchmidt，1995)。推定的LHCB-II和Cao基因已經(jīng)從我們實(shí)驗(yàn)室制備的原殼小球藻cDNA庫(kù)中鑒定出。參考附圖5，可以產(chǎn)生這些基因的RNAi構(gòu)建體來抑制它們?cè)谵D(zhuǎn)基因原殼小球藻中的表達(dá)(Ceruttietal.，1997)。附圖6提供了這種類型的應(yīng)用可以利用的許多構(gòu)建體。小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)可以合成地制得。RNA可以酶學(xué)地或通過部分/完全有機(jī)合成來產(chǎn)生，任何修飾的核糖核苷酸可以通過體外的酶學(xué)或有機(jī)合成來引入。在一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)地制備RNAi試劑。合成RNA分子的方法是本領(lǐng)域已知的，特別是，VermaandEckstein(1998)AnnulRev.Biochem.67:99_134中描述的化學(xué)合成方法。在另一個(gè)實(shí)施方式中，酶學(xué)地制備RNAi試劑。例如，ds-siRNA可以通過與期望的目標(biāo)mRNA具有足夠的互補(bǔ)性的長(zhǎng)dsRNA的酶學(xué)加工來制備。長(zhǎng)dsRNA的加工可以體外地，例如，利用合適的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)，ds-siRNA可以隨后通過凝膠電泳或凝膠過濾來純化。ds-siRNA然后可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來變性。在示范性的實(shí)施方式中，RNA可以通過用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、層析或其組合從混合物中純化。做為選擇，RNA可以沒有或最少純化地使用，以避免由于樣品處理的損失。做為選擇，單鏈的RNA也可以通過從合成的DNA模板、或從分離自重組細(xì)菌的DNA質(zhì)粒酶轉(zhuǎn)錄來制備。一般地，使用噬菌體RNA聚合酶，例如T7、T3或SP6RNA聚合酶(MilliganandUhlenbeck(1989)MethodsEnzymo1.180:51_62)。RNA可以被干燥用于貯存，或溶于水性溶液中。溶液可以含有緩沖液或鹽，來抑制退火，和/或促進(jìn)單鏈的穩(wěn)定。早先描述了合適的方法(Zamore等人的美國(guó)專利7，459，547)。據(jù)我們所知，原殼小球藻早先未被轉(zhuǎn)化。然而，幾種其他的小球藻屬物種已經(jīng)被轉(zhuǎn)化(Dawsonetal.，1997，ChowandTung,1999，El-Sheekh，1999；Chenetal.，2001，Grossman，2005)。用于轉(zhuǎn)化小球藻屬物種的技術(shù)(電穿孔、粒子轟擊和玻璃珠)基本上相同于用于衣藻屬轉(zhuǎn)化的那些，衣藻屬是在我們實(shí)驗(yàn)室中最經(jīng)常轉(zhuǎn)化的藻類(Siripornadulsiletal.，2006；Rajamanietal.，2006；XiongandSayre,2004；RuffIeandSayre，1998)。通過利用公知的抗生素抗性基因，可以利用基因組整合質(zhì)粒來選擇核轉(zhuǎn)化體(XiongandSayre，2004；RuffleandSayre，1998)。天然和外源基因表達(dá)可以由各種基因異源的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，包括來自小球藻屬病毒的那些以及CaMV35S啟動(dòng)子(Mitraetal,1994；Chenetal，2001)。摻入了各種基因啟動(dòng)子和抗生素選擇標(biāo)記基因(aadA、npt-II等等)的新的轉(zhuǎn)化載體可以用于得到期望的轉(zhuǎn)化體。更具體地，CaMV35S、小球藻屬遍在蛋白和小球藻屬病毒amt啟動(dòng)子(Dawsonetal.,1997,ChowandTung,1999,El-Sheekh,1999；Chenetal.，2001，Grossman，2005)被良好地表征了。CaMV35S和遍在蛋白啟動(dòng)子早先顯示了驅(qū)動(dòng)其他小球藻屬物種中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Chenetal.，2001；Dawsonetal.，1997)。使用公認(rèn)的分子策略來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化載體，預(yù)期的轉(zhuǎn)化率應(yīng)當(dāng)在10_4到_6的范圍內(nèi)，其應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生每個(gè)事件100-1，000個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。摻入了多種基因啟動(dòng)子和抗生素選擇標(biāo)記基因(例如，aadA、npt-II，等等)的各種轉(zhuǎn)化載體，對(duì)于得到對(duì)示范性的實(shí)施方式的系統(tǒng)和方法有用的遺傳修飾的物種是有用的。例如，CaMV35S和遍在蛋白啟動(dòng)子早先顯示了驅(qū)動(dòng)其他小球藻屬物種中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Chenetal.,2001；Dawsonetal.，1997)。利用合適的表達(dá)載體，各種轉(zhuǎn)基因(如下所述)可以克隆到這些載體中，并轉(zhuǎn)化到小球藻屬中。所有藻類轉(zhuǎn)化體中轉(zhuǎn)基因的存在可以通過PCR擴(kuò)增和轉(zhuǎn)基因的測(cè)序來確認(rèn)。為了鑒定最佳產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因藻類，通過RT-PCR分析，通過比較轉(zhuǎn)基因的和野生型細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，和通過定量每個(gè)DNA構(gòu)建體的獨(dú)立轉(zhuǎn)化體中的脂質(zhì)生產(chǎn)水平，可以測(cè)定所有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。提高甘油三酯(脂質(zhì))積累本發(fā)明的示范性的實(shí)施方式針對(duì)在有關(guān)的藻類中產(chǎn)生提高的脂質(zhì)積累的基團(tuán)。特別地，實(shí)例的實(shí)施方式針對(duì)四種基因，用于在轉(zhuǎn)基因原殼小球藻中過量表達(dá)以提高脂質(zhì)積累。這些基因包括1)催化脂肪酸合成中的第一個(gè)貢獻(xiàn)步驟的酶，乙?；鵆oA羧化酶(ACCase)(附圖7)；2)催化來自甘油二酯的甘油三酯合成的酶，或甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)(附圖7)；和3)編碼功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的兩種基因；油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白，其是原殼小球藻中脂質(zhì)貯存泡囊的組裝所需的(Bouvier-Naveetal.,2000；Dahlqvistetal.,2000；Frandsenetal.,2001；Hortensteineretal.,2000；Naestedetal.,2000)(參見附圖8)。由附圖9中的Northern印跡所展現(xiàn)的，當(dāng)油積累被誘導(dǎo)時(shí)，小球藻屬油體鈣蛋白表達(dá)水平顯著地提高。編碼ACCase和DGAT的基因可以置于小球藻屬轉(zhuǎn)化載體中，用于與本發(fā)明的成分以合適的組合促進(jìn)脂質(zhì)積累。此外，代謝物貯存泡囊的產(chǎn)生可以促進(jìn)代謝物積累，而沒有代謝物生物合成基因的表達(dá)的提高或分解代謝酶的減量調(diào)節(jié)。疏水化合物(例如，胡蘿卜素和根據(jù)推理，脂質(zhì))的積累可能受到蛋白質(zhì)包被的貯存泡囊的可獲得性的影響。為了提高油貯存體中的脂質(zhì)積累，編碼脂質(zhì)貯存體包被蛋白油質(zhì)蛋白和油體鈣蛋白的基因可以被過量表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞在促進(jìn)脂質(zhì)貯存的條件下(氮限制性)生長(zhǎng)時(shí)，原殼小球藻中提高的油體鈣蛋白表達(dá)與增強(qiáng)的脂質(zhì)積累相關(guān)。這些基因可以轉(zhuǎn)化到原殼小球藻中，并評(píng)估表型(如上所述的參數(shù))。進(jìn)一步的調(diào)節(jié)操作可以緩和對(duì)氮壓力的需求。高脂質(zhì)積累誘導(dǎo)的細(xì)胞的蛋白質(zhì)組的表征對(duì)于許多微藻，包括小球藻屬和衣藻屬，提高的碳/氮比例產(chǎn)生以淀粉或油形式的提高的碳貯存。C/N比例的改變可以通過從培養(yǎng)基中扣除氮，或通過向培養(yǎng)基添加還原的碳(對(duì)于小球藻屬為葡萄糖)來實(shí)現(xiàn)。在存在葡萄糖(1%，w/v)的情況下，原殼小球藻中的總脂質(zhì)含量從15%提高到55%。實(shí)際上，所有這種提高(40%)是油的形式。此外，在存在葡萄糖的情況下的生長(zhǎng)可能與光合能力的損失相關(guān)，光合能力的損失與葉綠素脫綠相關(guān)。我們監(jiān)測(cè)到小球藻屬中作為葡萄糖濃度的函數(shù)的油積累和葉綠素?fù)p失。如附圖10中所示，令人驚訝地，與對(duì)葉綠素?fù)p失相比，油積累對(duì)葡萄糖支持的生長(zhǎng)更為敏感。意料之外地，當(dāng)在原殼小球藻的情況下葡萄糖添加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基時(shí)，脂質(zhì)產(chǎn)量被顯著地改善(附圖10)。顯著地，在存在降低的葡萄糖水平(0.1%)的情況下的生長(zhǎng)也數(shù)量級(jí)地提高了油積累，而僅產(chǎn)生了葉綠素含量中的50%損失。在這些生長(zhǎng)條件(0.葡萄糖)之下，對(duì)脂質(zhì)積累的作用可以被最大化，而最小化對(duì)光合作用的影響。因此，選擇這些生長(zhǎng)條件來比較產(chǎn)生豐富數(shù)量的甘油三酯的細(xì)胞、與產(chǎn)生極少的甘油三酯的空氣生長(zhǎng)的細(xì)胞的蛋白質(zhì)組。利用生長(zhǎng)培養(yǎng)基中15N和13N標(biāo)記的NH4Cl,我們將同位素地標(biāo)記有和沒有0.葡萄糖下生長(zhǎng)的細(xì)胞。利用對(duì)衣藻屬開發(fā)的操作(Stauberetal.,2003)在細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)上，可溶的和膜蛋白部份將從每種處理中分離，并在2D凝膠上單獨(dú)地運(yùn)行。在處理之間蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度方面的差異可以利用校園化學(xué)儀器中心(CCIC，http://www.ccic.ohio-state.edu/MS/index,htm)可獲得的標(biāo)準(zhǔn)軟件包來測(cè)定。隨后，來自兩種處理的同位素標(biāo)記的細(xì)胞可以在相等細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)上組合，同時(shí)地提取蛋白質(zhì)來來降低蛋白質(zhì)分離假象。所有的提取可以在存在蛋白酶抑制物的混合物的情況下進(jìn)行?？扇艿暮湍さ鞍兹缓罂梢栽讵?dú)立的2D凝膠上分離。在染色強(qiáng)度方面不同的早先鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)可以被穿孔下來，它們的氨基酸序列和身份可以在CCIC通過MS來測(cè)定。近來完成的藻類基因組將幫助蛋白質(zhì)鑒定(Merchantetal.,Science,inpress)。通過比較重(15N)和輕(13N)同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，人們可以確定哪些蛋白質(zhì)是在處理之間差異化積累的。也可以利用減法cDNA雜交技術(shù)來確定哪些基因是響應(yīng)于葡萄糖(0.l%w/v)在原殼小球藻中過量或減量表達(dá)的。響應(yīng)于葡萄糖在豐度方面不同的、已知與碳和/或脂質(zhì)積累相關(guān)的、編碼蛋白質(zhì)/轉(zhuǎn)錄物的基因?qū)⒈徽J(rèn)為是在轉(zhuǎn)基因小球藻屬中過量表達(dá)或抑制的其他目標(biāo)，以提高脂質(zhì)積累。響應(yīng)于葡萄糖過量或減量表達(dá)的、鑒定為與油生產(chǎn)有代謝途徑相關(guān)性的基因，將被考慮導(dǎo)入小球藻屬中，利用強(qiáng)啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)正義或RNAi調(diào)節(jié)沉默構(gòu)建體(參見下文)。利用甘油的異養(yǎng)生長(zhǎng)參考附圖11，至少某些微藻物種的生長(zhǎng)可以被甘油增強(qiáng)，甘油是生物燃料生產(chǎn)的副產(chǎn)物。實(shí)際上，如附圖12中所示，甘油可以提高原殼小球藻中的生長(zhǎng)至至少10倍。如附圖13和14中所展現(xiàn)的，總脂質(zhì)產(chǎn)量也可以在提供了甘油的微藻中提高。通過利用副產(chǎn)物甘油作為藻類的食物來源，生物燃料的極其有效的生產(chǎn)是可能的。因?yàn)楦视偷漠愷B(yǎng)的飼喂，如葡萄糖一樣，可以抑制光合作用，甘油飼喂可以優(yōu)選地在低光可獲得性的時(shí)期期間進(jìn)行。這樣，藻類生長(zhǎng)可以支持一天24小時(shí)。雖然藻類主要被認(rèn)為是光自養(yǎng)生物，藻類展示了營(yíng)養(yǎng)作用方面的大量的多樣性。許多藻類是專性的光養(yǎng)生物，僅在存在光的情況下生長(zhǎng)。然而，有很多能夠利用固定的碳源作為它們唯一的營(yíng)養(yǎng)物(異養(yǎng)生長(zhǎng))或在存在光的情況下(混合營(yíng)養(yǎng)的，或光能異養(yǎng)的生長(zhǎng))。這些之中有藍(lán)藻類(例如，魚腥藻屬(Anabaena))、綠藻類(例如，小球藻屬(Chlorella)、衣藻屬(Chlamydomonas))、Xanthopytes(例如，Nannochloropsis)、Euglenophytes、BacilIariophytes>Dinophytes(例如，Crypthicodineum)禾口某些未表征的株(例如，Thaustochytrids)。降低淀粉合成小球藻屬中還原的碳的兩種主要貯存形式是淀粉和油。在蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)中，淀粉占據(jù)了總生物質(zhì)的6%(RamazanovandRamanazanov，06)。顯著地，小球藻屬的無(wú)淀粉的突變體具有比野生型細(xì)胞高22%的生長(zhǎng)速度。無(wú)淀粉細(xì)胞還具有生產(chǎn)比野生型細(xì)胞更多的脂質(zhì)的潛力。當(dāng)野生型蛋白核小球藻氮營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)，脂質(zhì)含量從15%提高到25%。顯著地，在相似的生長(zhǎng)條件下，無(wú)淀粉突變體的脂質(zhì)含量提高到總生物質(zhì)的38%，相對(duì)于野生型細(xì)胞50%的提高。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)含量的實(shí)質(zhì)性增高可以通過阻斷小球藻屬中的淀粉合成來實(shí)現(xiàn)。為了降低作為淀粉的固定的碳匯集(sequestration)和提高油積累，示范性的實(shí)施方式抑制ADP葡萄糖焦磷酸化酶表達(dá)。AGPase催化淀粉合成中第一個(gè)貢獻(xiàn)的和限速的步驟。因此，阻斷AGPase活性將抑制淀粉生產(chǎn)。具體實(shí)施方式將小球藻屬AGPase小亞基(催化亞基)RNAi發(fā)夾元件導(dǎo)入可選擇標(biāo)記物基因的終止子的3'UTR中(在多腺苷酸化信號(hào)之后)(Zabawinskietal.，2001)。為了確保AGPase表達(dá)的完全抑制，人們也可以將RNAi元件靶向AGPase基因家族的每個(gè)成員。在阻斷AGPase表達(dá)的細(xì)胞中，可以產(chǎn)生提高的(50%)油積累如下文討論的，當(dāng)AGPaseRNAi元件與提高油積累的基因堆疊時(shí)(例如，ACCase、DGAT和可能的油質(zhì)蛋白/油體鈣蛋白)，可以在正常生長(zhǎng)條件下實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)產(chǎn)量的進(jìn)一步提聞。提高光合的碳固定效率=RubisCO的工程化在陸地和海洋植物和特異化的微生物中，演變了不同的酶方案來催化無(wú)機(jī)碳還原。這些之中主要的是Calvin-Benson-BasshanKCBB)還原性戊糖磷酸途徑，使用20核酮糖1，5_二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶(RubisC0，EC4.1.1.39)，其是催化CO2的實(shí)際固定的關(guān)鍵的酶(Tabita，1999)。RubisCO特征在于它的低催化能力，具有對(duì)任何生物催化劑所報(bào)道的最低的周轉(zhuǎn)(kcat)值之一。因而，RubisCO催化效率總是被認(rèn)為是限制提高光合作用和植物生產(chǎn)力的主要因素。新近的模擬確認(rèn)了RubisCO催化作用方面的改善，與其他因素一起，對(duì)于增強(qiáng)總體光合作用、植物生產(chǎn)力和CO2匯集(sequestration)的重要性(Longetal.，2006)。多年來，已經(jīng)明顯的是，RubisCO催化作用實(shí)際上是五個(gè)步驟的總和烯醇化、羧化、7jC化、C-C裂解和質(zhì)子化(Clelandetal.，1998，Schneideretal.，1992，Mauseretal.，2001)。除了催化RuBP的羧化之外，RubisCO還催化RuBP依賴性O(shè)2固定反應(yīng)，從而RuBP的烯二醇由于O2加成的結(jié)果被裂解，產(chǎn)生各一個(gè)分子的3-PGA和2-磷酸乙醇酸(2-PG)(附圖15)。因而，RubisCO是在催化新陳代謝中的兩個(gè)重要步驟，CO2固定和O2固定中具有雙重功能的酶(0)2和O2競(jìng)爭(zhēng)同樣的酶結(jié)合的enediolate)。加氧酶反應(yīng)引起甘醇酸酯的形成(在通過特定磷酸酶的2-PG的脫磷酸之后)，其經(jīng)過一系列反應(yīng)進(jìn)一步被氧化代謝，從而碳(CO2)最終從細(xì)胞中失去。后一種氧化(呼吸)途徑因而直接地對(duì)立于CO2同化途徑，相同的酶(RubisCO)用于兩種代謝途徑的第一個(gè)和關(guān)鍵的反應(yīng)。對(duì)于以空氣中的CO2固定的結(jié)果來生存的生物體，加氧酶活性是個(gè)難題。RuBP的羧化和氧化的相對(duì)速率(v。/v。)因而確定了蛋白質(zhì)的催化效率或?yàn)榧?xì)胞提供所需的碳的能力。后者的比例可以在反應(yīng)產(chǎn)物3-PGA和2-PG的特異性分離之后測(cè)定(附圖15)，其可以在用[1-3H]-RuBP進(jìn)行酶反應(yīng)之后容易地辨別。如所示的，在可以同時(shí)地測(cè)量?jī)煞N反應(yīng)的條件下，在存在CO2和O2的情況下，來自[I-3H]-RuBP的[3H]-PGA或[3H]-2-PG的比定量，分別是羧化酶和加氧酶反應(yīng)的相對(duì)活性的度量(附圖15)。根據(jù)上述的，很明顯的是，有效率的RubisCO催化作用取決于在特定反應(yīng)中采用的CO2和O2的相對(duì)濃度下酶區(qū)分CO2和O2的固有的能力(Ω或τ值)。兩種反應(yīng)的速率可以定義為ν。/ν。=Ω[CO2]/[O2]，因而，Ω=VJO2]/v0[CO2]以及Ω=VCK0/V0KC,Vc和V。分別代表羧化和氧化的最大速率，Kc和K0分別是CO2和O2的相對(duì)米氏常數(shù)。Tabita實(shí)驗(yàn)室最初發(fā)現(xiàn)并描述了當(dāng)前用于功能研究的幾乎所有的微生物RubisCO蛋白質(zhì)(Tabita,1999；Tabitaetal.，inpress)，包括II形酶的初步分離和描述(Tabitaetal.,1974；GibsonandTabita，1977)，以及更近一些的III形和IV形酶(Watsonetal.,1999；FinnandTabita,2003；HansonandTabita,2001；Tabita，2004)。此外，我們的實(shí)驗(yàn)室首先顯示了，II形和微生物的I形蛋白質(zhì)(Tabita，1988)可以有效地用于剖析催化機(jī)理的許多方面，其細(xì)節(jié)由許多國(guó)際科學(xué)家的合作所闡明。此外，近來我們發(fā)現(xiàn)了在各種形式的RubisCO中的、影響關(guān)鍵催化性質(zhì)如KC、KO和□的殘基(SmithandTabita,2003；KreelandTabita(2007))。在許多情況下，這些殘基在活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)端，我們近來發(fā)現(xiàn)了特別令人感興趣的疏水性區(qū)域，其深刻地影響這些關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而工程化的細(xì)菌蛋白質(zhì)可以通過氧的存在實(shí)際上被釋放(KreelandTabita,2007；Satagopanetal.,2007；Satagopan,Scott,andTabita,原稿在}^隹備中)。在靠近二氧化碳的富集來源，例如化石燃料發(fā)電廠和乙醇植物的地方生長(zhǎng)藻類具有潛在的優(yōu)點(diǎn)。在高CO2濃度下，加氧酶反應(yīng)被競(jìng)爭(zhēng)性地抑制，實(shí)現(xiàn)了小球藻屬的更高生長(zhǎng)速度(RamazanovandRamazanov，2006)。然而，富集的CO2供應(yīng)可能不總是可獲得的。為了提高在空氣中生長(zhǎng)的細(xì)胞的光合效率，理想的是降低Rubisco的競(jìng)爭(zhēng)性加氧酶活性。具體的示范性的實(shí)施方式將利用遺傳地操縱和轉(zhuǎn)化原殼小球藻的能力，來確定早先鑒定的殘基是否影響各種RubisCO蛋白質(zhì)中的CO2固定效率，包括緊密相關(guān)的藍(lán)細(xì)菌酶，也影響小球藻屬酶的CO2固定。如衣藻屬一樣，小球藻屬物種也在有機(jī)碳化合物上生長(zhǎng)，因而使得便于產(chǎn)生和回收rbcL基因中的突變，如對(duì)衣藻屬所進(jìn)行的(SpreitzerandSalvucci,2002)。我們將首先通過除去大部分或完整的或rbcL基因，并用抗生素抗性盒替換它，來在野生型小球藻屬菌株的葉綠體基因組內(nèi)創(chuàng)造rbcL刪除。產(chǎn)生的rbcL突變株，其將保持在有機(jī)碳上生長(zhǎng)的能力，但不能在作為唯一碳源的CO2上生長(zhǎng)，將充當(dāng)接受突變的rbcL基因的方便的宿主。在rbcL的期望的核苷酸中的改變將利用商業(yè)上可獲得的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖衼磉M(jìn)行，從而可以改變關(guān)鍵的氨基酸殘基。利用含有rbcL基因的5'和3'的同源序列的遞送載體，突變的rbcL基因?qū)⒂糜谥脫Q抗生素抗性盒和轉(zhuǎn)化小球藻屬rbcL刪除菌株。通過同源重組，以及相對(duì)于插入的抗生素抗性制造者來選擇，突變的rbcL基因?qū)⒈粨饺氲叫∏蛟鍖俚娜~綠體基因組中。在通過陰離子交換層析和蔗糖密度離心或凝膠滲透層析的組合分離突變的酶之后，將注意到對(duì)CO2依賴性生長(zhǎng)的明顯作用。必需的動(dòng)力學(xué)常數(shù)將然后通過已建立的方法來測(cè)定(KreelandTabita,2007；Satagopanetal.,2007)我們將對(duì)改善小球藻屬的光合生長(zhǎng)產(chǎn)率和生長(zhǎng)速度、以及總體的完整細(xì)胞CO2固定速率的任何改變特別感興趣。隨機(jī)誘變和選擇策略可以用于鑒定未被預(yù)測(cè)為影響功能的小球藻屬蛋白質(zhì)的區(qū)域。在指導(dǎo)的酶進(jìn)化的任何程序中，這總是一種重要的策略。因而，我們將調(diào)整易錯(cuò)誘變方案來獲得1-4個(gè)之間的堿基對(duì)變化(SmithandTabita，2003)，一同克隆突變的rbcL基因到遞送載體中，然后使用這種含有rbcL分子的載體的群體來轉(zhuǎn)化小球藻屬rbcL刪除菌株。在含有有機(jī)碳的平板上抗生素選擇之后，來自影響CO2依賴性生長(zhǎng)的那些克隆的rbcL基因?qū)⒈粶y(cè)序，將注意到修飾的殘基。如果在任何潛在感興趣的克隆中有多個(gè)突變，然后可以使用定點(diǎn)誘變來選出哪些殘基是重要的，哪些殘基可能以協(xié)同的方式起作用。然后可以生長(zhǎng)所有感興趣的克隆，用于分離突變的酶和測(cè)定它們的酶學(xué)性質(zhì)。藍(lán)細(xì)菌雙功能性果糖-1，6-二磷酸酶/SEDUHEPTUL0SE-1、7_二磷酸酶在轉(zhuǎn)基因的小球藻屬中的表達(dá)果糖-I，6-二磷酸酶(FBPase)和seduh印tulose-Ι，7_二磷酸酶(SBPase)都催化不可逆反應(yīng)，是卡爾文循環(huán)中的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。對(duì)植物的早先的研究表明，F(xiàn)BPase和SBPase水平相對(duì)于其他的卡爾文循環(huán)酶是極低的，限制了光合速率(Raines，2006)。此外，具有降低的FBPase和SBPase活性的轉(zhuǎn)基因植物被報(bào)道具有降低的光合能力，與再生卡爾文循環(huán)中間物的降低的能力相關(guān)(Komanetal.,1994；Harrisonetal.，1998)。在2001年，Miyagawa等人報(bào)道了，在空氣中生長(zhǎng)期間，來自藍(lán)細(xì)菌的雙功能FBPase/SBPase基因(ftp-Ι)在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)提高了生物質(zhì)產(chǎn)量和CO2固定速率分別至1.5倍和1.2倍。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物在飽和CO2濃度(SOOppm)下生長(zhǎng)時(shí)，類似于對(duì)微藻生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)的條件，轉(zhuǎn)基因植物的光合CO2固定活性比在空氣中生長(zhǎng)時(shí)甚至更大(1.5倍提高)。轉(zhuǎn)基因植物中CO2固定速率的提高與穩(wěn)態(tài)的RuBP水平方面近乎50%的提高、以及在其他磷酸化的卡爾文循環(huán)中間物和己糖中的提高相關(guān)。通過擬南芥屬(Arabidopsis)SBPase在轉(zhuǎn)基因煙草中的過量表達(dá)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了類似的結(jié)果(Lefebvreetal.，2005)。根據(jù)FBPase和SBPase在藻類中也可能是限制性的假設(shè)，修飾的集胞藻屬(Synechocystis)PCC7942ftp_l基因的過量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因小球藻屬中的CO2固定。這個(gè)基因在它的5'末端融合rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，以將它靶向葉綠體。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以通過RT-PCR以及通過從小球藻屬分離的葉綠體的SDS-PAGE分析來確認(rèn)。轉(zhuǎn)基因物的CO2固定速率、生長(zhǎng)速度和脂質(zhì)含量將與野生型細(xì)胞相比較。表達(dá)ftp-ι基因的細(xì)胞將展現(xiàn)提高的CO2固定速率，具有更高的總體生產(chǎn)力或生物質(zhì)產(chǎn)量，當(dāng)與提高脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)結(jié)合時(shí)提高脂質(zhì)產(chǎn)量/細(xì)胞?？刂苹蛳∏蛟鍖倥囵B(yǎng)物的可能的微生物或藻類污染物的分子策略微藻的大規(guī)模培養(yǎng)中的一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是維持純性培養(yǎng)。當(dāng)小球藻屬在無(wú)機(jī)鹽上生長(zhǎng)良好時(shí)，釋放到培養(yǎng)基中的廢物和其他代謝物可以支持許多其他微生物的異養(yǎng)生長(zhǎng)。此外，其他光合生物可以潛在地在混合培養(yǎng)中與小球藻屬競(jìng)爭(zhēng)。為了降低或消除生物學(xué)污染，許多性狀可以導(dǎo)入小球藻屬中，以容許它產(chǎn)生廣譜的殺菌分子，以及提供針對(duì)光合的(莠去津)和代謝的除草劑(草甘膦)的抗性。顯著地，這些性狀的每一種本身是轉(zhuǎn)化事件的可選擇標(biāo)記物，可以與非可選性狀的導(dǎo)入相聯(lián)系以便于基因堆疊。光合的除草劑莠去津與質(zhì)體醌競(jìng)爭(zhēng)光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的Dl蛋白質(zhì)上的QB結(jié)合位點(diǎn)，阻斷光合電子傳遞(附圖2)。葉綠體DNA編碼的psbA基因(編碼Dl蛋白質(zhì))中的許多單位點(diǎn)特異性突變(在0ettmeier，1999中綜述)賦予莠去津抗性，而基本上不改變光合效率。賦予莠去津抗性的突變形式的psbA基因可以通過顆粒槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)入小球藻屬質(zhì)體基因組中。小球藻屬psbA基因的突變的形式將通過同源重組與野生型版本互換(RuffleandSayre,1998)。轉(zhuǎn)化體可以根據(jù)它們?cè)诖嬖谝种菩詽舛?1_10μΜ)的莠去津的情況下光合地生長(zhǎng)的能力來選擇。轉(zhuǎn)化體可以通過PCR和含有診斷性限制性內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因的限制性消化分析來確認(rèn)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體可以利用最初在Sayre實(shí)驗(yàn)室為衣藻屬開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)篩選操作(RuffleandSayre,1998)變?yōu)閷?duì)轉(zhuǎn)基因是同型異源的(homoplasmy)。然后可以測(cè)定同質(zhì)的莠去津抗性轉(zhuǎn)化體的DNA序列。光合污染物不可能在存在莠去津(1-10μM)的情況下生長(zhǎng)。降低藻類培養(yǎng)物中潛在的微生物污染物的另一種方法涉及向小球藻屬中導(dǎo)入草甘膦抗性(Schonbrunnetal,2001；Yeetal，2001)。草甘膦是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的轉(zhuǎn)變態(tài)類似物，與EPSP合酶的活性位點(diǎn)緊密地結(jié)合，EPSP合酶是涉及芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵的酶。EPSP合酶催化5-0-(1-羧基乙烯基)-3-磷酸莽草酸鹽從PEP和莽草酸_3_磷酸鹽的合成，最終導(dǎo)致芳香族氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生產(chǎn)。值得注意地，許多細(xì)菌和原生生物是草甘膦敏感性的。來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合成酶基因可以通過隨機(jī)的整合導(dǎo)入到小球藻屬核的基因組中(Schonbrunnetal.，2001)。然后可以根據(jù)它們?cè)诖嬖诓莞熟⒌那闆r下生長(zhǎng)的能力選擇轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體將通過轉(zhuǎn)基因的PCR和DNA序列分析來確認(rèn)。在2001年，Chen等人報(bào)道了兔嗜中性粒細(xì)胞肽-I(NP-I)在轉(zhuǎn)基因小球藻屬中的表達(dá)。NP-I是小的富含半胱氨酸的陽(yáng)離子肽的防御素家族的成員，其具有廣泛宿主范圍的、抗微生物和細(xì)胞毒性活性。Chen等人篩選了多種啟動(dòng)子并確定了遍在蛋白-1啟動(dòng)子、Ubi-I和煙草花葉病毒翻譯增強(qiáng)子元件、TMV之間的融合物在小球藻屬中得到了最高水平的NP-I表達(dá)。表達(dá)所述肽的轉(zhuǎn)基因的和完整的小球藻屬細(xì)胞對(duì)芽胞桿菌屬(格蘭氏陽(yáng)性)、大腸桿菌(革蘭氏陰性)和鐮孢菌屬(Fusarium)(真菌)感染具有抗性。NP-I基因可以成功地導(dǎo)入小球藻屬中。轉(zhuǎn)化體可以通過PCR確認(rèn)，最具感染抗性的轉(zhuǎn)化體將利用抗微生物活性的平板分析來鑒定(Chenetal.，2001)。最后，注意的是，多種抗細(xì)菌的抗性基因已經(jīng)用作小球藻屬和衣藻屬轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記物(Walkeretal.，2005)。這些基因賦予了針對(duì)卡那霉素、鏈霉素、壯觀霉素、勻霉素、博來霉素和諾爾絲菌素的抗性。表達(dá)這些可選擇標(biāo)記物基因的轉(zhuǎn)基因株將對(duì)它們的相關(guān)的抗生素有抗性。最后，堆疊多種可選擇標(biāo)記物基因?qū)⑻峁┒嘀氐倪x擇系統(tǒng)來降低微生物污染的可能性。一般地，抗生素或除草劑將不會(huì)應(yīng)用于培養(yǎng)物，除非有發(fā)生污染的證據(jù)，以避免對(duì)多藥物/除草劑抗性株的選擇。為了確認(rèn)有效性，表達(dá)如上所述的性狀的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以在存在合適的抗生素或除草劑的情況下在開放的空氣培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。感染的水平然后可以在顯微鏡下以及通過基于平板的生長(zhǎng)分析來測(cè)定。在最低藥物成本下提供最大的污染物抗性的性狀可以被考慮導(dǎo)入商業(yè)性生長(zhǎng)的細(xì)胞中?；蚨询B技術(shù)如表4中所示，多達(dá)12種轉(zhuǎn)基因可以互補(bǔ)性地在小球藻屬中利用，以提高它的生物燃料生產(chǎn)潛力。值得注意地，這些基因的至少四種可以直接用作可選擇標(biāo)記物基因，包括rbcl(導(dǎo)入葉綠體rbcl刪除菌株)、psbAatrr、EPSPglypr和NP-I。如果這些性狀與缺少可容易選擇的性狀的基因(例如，ACCase)共轉(zhuǎn)化，則其他四種或更多種性狀可能需要利用未在表1中列出的其他可選擇標(biāo)記物基因轉(zhuǎn)化到小球藻屬中。迄今為止，對(duì)綠藻轉(zhuǎn)化已經(jīng)描述了至少五種抗生素選擇系統(tǒng)(Maliga，2004;Walkeretal.,2005)0如果我們假定除了表1中列出的之外不需要其他基因?qū)氲叫∏蛟鍖僦?，則我們當(dāng)前有足夠數(shù)量的獨(dú)立的可選擇標(biāo)記物基因來將所有計(jì)劃的轉(zhuǎn)基因?qū)胄∏蛟鍖僦?，一次兩個(gè)，每個(gè)質(zhì)粒含有新的可選擇標(biāo)記物基因。理想地，成對(duì)導(dǎo)入的基因應(yīng)當(dāng)具有不相同的和異源的啟動(dòng)子和終止子，以及被連接來降低基因沉默的可能性。各種核基因啟動(dòng)子可以被考慮，包括來自小球藻屬病毒的異源啟動(dòng)子(Mitra，1994)。然而，基于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組概況的結(jié)果，可以利用其他基因來優(yōu)化小球藻屬中的生物燃料生產(chǎn)。如果為篩選的其它基因的數(shù)量變得很大，則可以利用可選擇的基因整合策略，包括用粘粒的共同轉(zhuǎn)化，一種被Chen等人(2001)使用來工程化小球藻屬的策略。表1可能賦予轉(zhuǎn)基因性狀的可選擇標(biāo)記物實(shí)施例為了促進(jìn)對(duì)本發(fā)明的更完整的了解，以下提供了許多實(shí)施例。然而，本發(fā)明的范圍不應(yīng)限于在這些實(shí)施例中公開的具體的實(shí)施方式，其僅用于例示的目的。棚列1身帛絲剖乍應(yīng)增強(qiáng)的光合作用以下基因?qū)⒈欢询B來增強(qiáng)光合碳效率_預(yù)計(jì)的是，這些基因一起將提高二氧化碳固定和生物質(zhì)產(chǎn)量至兩倍。這將通過天線大小的減小(RNAiCao，或RNAiLHC-IIb，但不是兩者一起)和通過卡爾文循環(huán)的碳通量的提高(改變的LSRubisCO和FBPase/SBPase)來實(shí)現(xiàn)。編碼改變的LSRubisCO和FBPase/SBPase的基因是葉綠體基因，可以與之前描述的賦予莠去津抗性的psbA基因共同轉(zhuǎn)化。將在莠去津抗性的基礎(chǔ)上選擇轉(zhuǎn)化體。賦予降低的天線大小的RNAi構(gòu)建體(RNAiCao，或RNAiLHC-IIb)可以與如下所述用于增強(qiáng)油產(chǎn)量的RNAi構(gòu)建體(PDC、PFLl/PFLA和AGPase)堆疊，并連接到GlyprEPSP合酶基因作為核轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記物。預(yù)計(jì)的是，這些轉(zhuǎn)化體將是草甘膦抗性的。實(shí)施例2基因的堆疊以提供增強(qiáng)的油產(chǎn)量以下基因?qū)⒈欢询B以提高油產(chǎn)量提高的脂肪酸合成將通過將丙酮酸導(dǎo)向乙酸鹽和脂肪酸合成(RNAiPDC和RNAiPFL1/PFLA)、過量表達(dá)ACCase，以及通過抑制淀粉合成(RNAiAGPase)來實(shí)現(xiàn)。四種RNAi元件(PDC、PFLl/PFLA和AGPase)可以與抑制葉綠素b的積累的基因(RNAiCao或RNAiLHC-IIb)一起組合到一個(gè)基因表達(dá)盒中。每個(gè)目標(biāo)的反向重復(fù)元件(一般獨(dú)特編碼的或非編碼序列的200bp)將與插入的內(nèi)含子一起產(chǎn)生來形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)?？梢允褂靡坏絻蓚€(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒，其含有與合適的抗生素抗性基因(例如，賦予腐草霉素抗性的ble基因，賦予壯觀霉素抗性的spec基因)連接的、驅(qū)動(dòng)ACCase、DGAT、油體鈣蛋白、油質(zhì)蛋白和/或殺菌肽NP-I的過量表達(dá)的盒(如下所述)。強(qiáng)藻類組成型基因啟動(dòng)子，例如，遍在蛋白、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白或其他啟動(dòng)子可以用于驅(qū)動(dòng)ACCase、DGAT、油體鈣蛋白、油質(zhì)蛋白和NP-I的表達(dá)(見下文)。提高的油積累提高的三?；视偷暮铣蓪⑼ㄟ^DGAT的過量表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。提高的三?；视偷姆e累將通過油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白的過量表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。降低的藻類和細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)將通過以下基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)藻類污染物將通過在轉(zhuǎn)基因藻類中堆疊除草劑抗性基因來降低。我們將用賦予莠去津抗性的修飾的PsbA基因(如上所述)轉(zhuǎn)化葉綠體基因組。我們將用細(xì)菌EPSP合酶的草甘膦抗性形式(如上所述)轉(zhuǎn)化核基因組。細(xì)菌污染物將通過殺菌肽(NP-I)的過量表達(dá)來降低。共同地，用于增強(qiáng)光合作用、脂質(zhì)積累和污染物抗性的所有性狀可以利用帶有不同的可選擇標(biāo)記物基因，包括除草劑抗性基因作為標(biāo)記物的質(zhì)粒堆疊在一個(gè)生物體中。少至四個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒(三個(gè)核的靶向、一個(gè)葉綠體靶向的)，每一個(gè)具有獨(dú)特的可選擇標(biāo)記物，是堆疊所有性狀所需要的。公開物以下參考文獻(xiàn)和在此引用但未列于此的其他參考文獻(xiàn)，以提供示范性的過程和補(bǔ)充在此闡述的內(nèi)容的其他細(xì)節(jié)的程度，通過引用專門地合并在此。#BeckerEW(1994)Microalgaebiotechnologyandmicrobiology.CambridgeUniv.Press.NewYork，NY.#Bouvier-NaveP，BenvenisteP，OelkersP，SturleySLandSchallerH(2000)ExpressioninyeastandtobaccoofplantcDNAsencodingacylCoAdiacylglycerolacyltransferase.EuropeanJournalofBiochemistry267:85-96.#BrownLM(1996)Uptakeofcarbondioxidefromfluegasbymicroalgae.EnergyConversionandManagement371363-1367.36·CeruttiH,JohnsonAM,GillhamNffandBoyntonJE(1997)EpigeneticsilencingofaforeigngeneinnucleartransformantsofChlamydomonas.PlantCell9:925-945.#ChenY,WangY，SunY，ZhangLandLiW(2001)Highlyefficientexpressionofrabbitneutrophilpeptide一1geneinChlorellaellipsoideacells.CurrentGenetics39:365_370.·ChowK-CandTungWL(1999).ElectrotransformationofChlorellavulgaris.PlantCellReports18:778-780.·Cleland，W.W.，Andrews,T.J.，Gutteridge，S.，Hartman,F.C.，andLorimer,G.H.(1998).MechanismofRubisCO:TheCarbamateasGeneralBase.Chem.Rev.98，549-562.·DahlqvistA，StahlU，LenmanM，BanasA，LeeM，SandagerL，et.al.(2000)Phospholipid:diacylglycerolacyltransferase:anenzymethatcatalyzestheacyl-CoA-independentformationoftriacylglycerolinyeastandplants.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97:6487_6492.·Dawson,H.N.，Burlingame，R.andCannons，A.C.(1997)StableTransformationofChlorella:RescueofNitrateReductase-DeficientMutantswiththeNitrateReductaseGene.CurrentMicrobiol.37，·Doucha，J.，andLivansky,K.(2006).Productivity,C02/02exchangeandhydraulicsinoutdooropenhighdensitymicroalgal(Chlorellasp.)photobioreactorsoperatedinamiddleandsouthernEuropeanclimate.JournalofAppliedPhycology18,811-826.#Eggink,L.L.,LoBrutto,R.,Brune,D.C.,Brusslan,J.,Yamasato,A.,Tanaka,A.,etal.(2004).Synthesisofchlorophyllb-localizationofchlorophyllideaoxygenaseanddiscoveryofastableradicalinthecatalyticsubunit.BMCPlantBiology4，5-20.·El-SheekhMM(1999).StabletransformationoftheintactcellsofChlorellakessleriwithhighvelocitymicroprojectiles.BiologiaPlantarum42:209-216.·Espineda，C.E.，Linford，A.S.，Devine，D.，andBrusslan，J.A.TheAtCAOgene,encodingchlorophyllaoxygenase,isrequiredforchlorophyllbsynthesisinArabidopsisthaliana.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences96，10507-10511.·Finn,M.W.,andTabita,F.R.(2003).SynthesisofcatalyticalIyactiveformIIIribulose1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaseinarchaea.J.Bacteriol.185，3049-3059.·FrandsenGIiMundyJandTzenTC(2001).Oilbodiesandtheirassociatedproteins，oleosinandcaleosin.PhysiologiaPlantarum112,301-307.·Gibson，J.L.，andF.R.Tabita.(1977).DifferentmolecularformsofD—ribulose—l，5-bisphosphatecarboxylasefromRhodopseudomonassphaeroides.J.Biol.Chem.252,943-949.·GrossmanA(2005)Pathstowardsalgalgenomics.PI.Physiol.137,410-437.·Hanson，Τ.E.，andTabita,F.R.(2001).Aribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase(RubisCO)-likeproteinfromChlorobiumtepidumthatisinvolvedwithsulfurmetabolismandtheresponsetooxidativestress.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A98，4397-4402.·HarrisonEP,WillinghamNM,LoydJCandRainesCA(1998)Reducedseduheptulose—l，7—bisphosphataselevelsintransgenictobaccoleadtodecreasedphotosyntheticcapacityandalteredcarbohydrateaccumulation.Planta20427-36.37·Hortensteiner,S.，Chinner,J.，Matile，P.，Thomas，H.，andDonnison，I.S.(2000).ChlorophyllbreakdowninChlorellaprotothecoides!characterizationofdegreeningandcloningofdegreening-relatedgenes.PlantMolecularBiology42，439-450.·Keffer,J.E.，andKleinheinz，G.Τ.(2002).UseofChlorellavulgarisforC02mitigationinaphotobioreactor.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology29，275-280.·KimD-H.，KimYT，Cho,BaeJ.-H.HurS.-B.，HwangI.andChoi，T-J(2002).Stableintegrationandfunctionalexpressionoffloundergrowthhormonegeneintransformedmicrcalga，Chlorellaellipsoidea.MarineBiotechnology4:63—73.#Klyachko-GurvichaGL,TsoglinaLN,DouchabJ，KopetskiibJ，ShebalinaIBandSemenenkoaVE(1999).Desaturationoffattyacidsasanadaptiveresponsetoshiftsinlightintensity.PhysiologiaPlantarum107:240-249··Ko_manJ，SonnewaldUandWilmitzerL(1994)Reductionofthechloroplasticfructose-1,6-bisphosphataseintransgenicpotatoplantsimpairsphotosynthesisandplantgrowth.PlantJ.6:637-650.#Kreel,N.E.,andTabita,F.R.(2007).Substitutionsatmethionine295ofArchaeoglobusfulgidusribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaseaffectoxygenbindingandC02/02specificity.J.Biol.Chem.282,1341-1351.·LeeSJiYoonB-DandOhH-M(1998).RapidmethodforthedeterminationoflipidfromthegreenalgaBotryococcusbraunii.BiotechnologyTechniques12553-556.·Lefebvre，S，LawsonT，F(xiàn)ryerM，ZakhleniukOV,LloydJCandRainesCA(2005).Increasedsedoheptulose-1，7-bisphosphataseactivityintransgenictobaccoplantsstimulatesphotosynthesisandgrowthfromanearlystageindevelopment.PlantPhysiology138:451-460··Long，S.P.，Zhu,X.-G.，Naidu，S.L，andOrt，D.R.(2006).Canimprovementinphotosynthesisincreasecropyields？Plant，Cell&Environ.29,315-330.·Lu，S.，VanEck，J.，Zhou，X.，Lopez,A.B.,O'Halloran,D.M.，Cosman，K.M.，Conlin，B.J.，Paolillo，D.J.，Garvin,D.F.，Vrebalov,J.，Kochian,L.V.，Kiipper,H.，Earle，Ε.D.，Cao,J.andLi，L(2006)TheCauliflowerOrGeneEncodesaDnaJCysteine-RichDomain-ContainingProteinThatMediatesHigh-Levelsofbeta-CaroteneAccumulation.PlantCellpublishedDecember15，2006，·MalagaP(2004)Plastidtransformationinhigherplants.Ann.Rev.PlantBiol.55:289-313.38·Mandalam，R.K.，andPalsson,B.0.(1998).Elementalbalancingofbiomassandmediumcompositionenhancesgrowthcapacityinhigh-densityChlorellavulgariscultures.BiotechnologyandBioengineering59,605-611.·MauseriH.,King,W.A.,GreadyiJ.E.,andAndrews，T.J.(2001).C02fixationbyRubisCO!computationaldissectionofthekeystepsofcarboxylation,hydration,andC-Cbondcleavage.J.Am.Chem.Soc.123，10821-10829.·MelecchiMIS,PeresVF,DarivaC，ZiniCA,AbadFC,MartinezMMandCaramaoEB(2006).OptimizationofthesonicationextractionmethodofHibiscusTiliaceusLflowers.UltrasonSonochem13，242—250.·Miao,X.，andWu,Q.(2006).Biodieselproductionfromheterotrophicmicroalgaloil.BioresourceTechnology97,841-846.#Mitra,A,Higgins,DWandRohe，NJ(1994)·AChlorellavirusgenepromoterfunctionsasastrongpromoterbothinplantsandbacteria.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications204:187-194··MiyagawaY，TamoiMandShigeokaS(2001).Overexpressionofacyanobacterialfructose-1,6-/sedoheptulose-1，7-bisphosphataseintobaccoenhancesphotosynthesisandgrowth.NatureBiotechnology19:965—969.·Morita,M.，Watanabe,Y.，andSaiki,H.(2000).HighphotosyntheticproductivityofgreenmicroalgaChlorellasorokiniana.AppliedBiochemistryandBiotechnology,87，203-218.·MusFiDubiniAiSeibertMiPosewitzMC,andGrossmanAR(2007)AnaerobicAcclimationinChlamydomonasreinhardtiiAnoxicgeneexpression,hydrogeaseiinductionandmetabolicpathways.J.Biol.Chem.282:25475-25486.·MussgnugJH,Thomas-HallS，RupprechtJ，F(xiàn)ooA，KlassenV，McDowallA，SchenkPM,Kruse0，HankamerB(2007)Engineeringphotosyntheticlightcaptureimpactsonimprovedsolarenergytobiomassconversion.PlantBiotech.J.5802-814.·Naested，H.，F(xiàn)randsen,G.I.，Jauh,G.-Y.，Hernandez-Pinzon,I.，Nielsen，H.B.，Murphy,D.J.etal.(2000).Caleosins:Ca2+_bindingproteinsassociatedwithlipidbodies.PlantMolecularBiology44,463-476.·Nakajima，Y.，andUeda，R.(1999).Improvementofmicroalgalphotosyntheticproductivitybyreducingthecontentoflightharvestingpigment.JournalofAppliedPhycology11,195-201.·OdaY(2003)Invivoisotopiclabelingofproteinsforqualitativeproteomics.Prooteinsandproteomics,ed.Simpson.ColdSpringHarborPress，NY·OettmeierW(1999)HerbicideresistanceandsupersensitivityinphotosystemII.CellularandMolecularLifeSciences55:1255-1277·#Plumley,F.G.,andSchmidt,G.W.(1995).Light-harvestingchlorophylla/bcomplexes!interdependentpigmentsynthesisandproteinassembly.PlantCell7,689-704.·Polle，J.，KanakagiriS，Benemann,J.R.andMelis，A.(1999)Maximizingphotosyntheticefficienciesandhydrogenproductionbymicroalgalcultures.Proc.1999U.S.DOEHydrogenProg.Rev.·RainesCA(2003)TheCalvincyclerevisited.PhotosynthesisResearch75:1-10.·RajamaniS，SiripornadulsilS，F(xiàn)alcaoV，TorresM，ColepicoloP，SayreR.(2006)Phycoremediationofheavymetalsusingtransgenicmicroalgae.InTransgenicMicroalgaeasGreenFactories.EmilioFernandes，AuroraGalvan，RosaLeon，eds.LandesPress.#RamazanovAandRomazanovZ(2006)IsolationandcharacterizationofastarchlessmutantofChlorellapyrenoidosaSTL—PIwithahighgrowthrateandhighproteinandpolyunsaturatedfattyacidcontent.PhycologicalResearch54255-259.39·RichmondA(2004)Handbookofmicroalgalculturebiotechnologyandappliedphycology.BlackwellPublishing，Ames，la.#Ruffle,S.V.andSayre,R.T.(1998)FunctionalanalysisofphotosystemII.In:MolecularBiologyofChlamydomonasChloroplastsandMitochondria，Chapter16.Pgs.287—322；M.Goldshmidt—Clermont，S.Merchant，J.-D.Rochaixeds.，KluwerAcademicPublishers.·Satagopan,S.，Scott,S.A.，andTabita，F(xiàn).R.(2007).IdentificationofasuppressormutantsubstitutioninSynechococcusRubisCOthatcausesoxygen“insensitivity，，andimprovesthestabilityofthewild-typeenzyme.Abst.Ann.Mting.Amer.Soc.PlantBiol.·Sato，N.，Tsuzuki,Μ.，andKawaguchi,Α.(2003).GlycerolipidsynthesisinChlorellakessleriIlhI.Existenceofaeukaryoticpathway.BiochmicaetBiophysicaActa1633，27-34.·Schneider,G.，LindqvistiY.，andBranden,C.I.(1992).RUBISCOstructureandmechanism.AnnuRevBiophysBiomolStruct21，119—143.·SchneiderLVandHallMP(2005)Stableisotopemethodsforhighprecisionproteomics.DrugDiscoveryToday10:353-365.·SchonbrunnE.EschenburgS.ShuttleworthWA,SchlossJV,Amrheini,N.，Evans,JNSandKabschW(2001).Interactionoftheherbicideglyphosatewithitstargetenzyme5~enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthaseinatomicdetailProceedingsoftheNationalAcademyofSciences98:1376_1380··Sheehan，J.，Dunahay,Τ.，Benemann,J.，andRoessler,P.(1998).AlookbackattheU.S.DepartmentofEnergy'saquaticspeciesprogram-biodieselfromalgae.NationalRenewableEnergyLaboratory,Golden，Colorado.#SiripornadulsilS，DabrowskiKandSayreRT(2006)Microalgalvaccines.In-TransgenicMicroalgaeasGreenFactories.EmilioFernandes,AuroraGalvan,RosaLeon，eds.LandesPress.#Smith,S.A.,andTabita,F.R.(2003).Positiveandnegativebioselectionofmutantformsofprokaryotic(cyanobacterial)ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase.J.Mo1.Biol.331，557-569.·Smith,S.A.,andTabita,F.R.(2004).Glycine176affectscatalyticpropertiesandstabilityoftheSynechococcussp.strainPCC6301ribulose1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase.J.Biol.Chem.279，25632—25637·#Spreitzer,R.J.，andSalvucci，Μ·Ε·(2002)·RubisCO!structure，regulatoryinteractions，andpossibilitiesforabetterenzyme.Annu.Rev.PlantBiol.53,449-475.·StauberEJiFinkAiMarkertCiKruse0，JohanningmeierUiHipplerM(2003)ProteomicsofChlamydomonasreinhardtiilight-harvestingproteins.EukaryoticCell2:978-994.·Tabita,F.R.andMcFadden,B.A.(1974)(a)D-Ribulose1,5-diphosphatecarboxylasefromRhodospirillumrubrum.I.Levels,purification，andeffectofmetallicions.J.Biol.Chem.249，3453-3458.(b)D-Ribulose1，5-diphosphatecarboxylasefromRhodospiri1Iurnrubrum.II.Quaternarystructure,composition,catalyticandimmunologicalproperties.J.Biol.Chem.249,3459-3464.40#Tabita,F.R.(1988).Molecularandcellularregulationofautotrophiccarbondioxidefixationinmicroorganisms.Microbiol.Rev.52,155-189.·Tabita，F(xiàn).R.(1999).Microbialribulose1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase:adifferentperspective.PhotosynthesisResearch60,1-28.·Tabita,F.R.(2004).Researchoncarbondioxidefixationinphotosyntheticmicroorganisms(1971-present).Photosynth.Res.80，315-332.·Tabita,F.R.，Hanson，Τ.E·，Li，H·，Satagopan,S.，Singh，J.，andChan，S.Function,structure，andevolutionoftheRubisCO-IikeproteinsandtheirRubisCOhomologs.Submittedforpublication.·Tanaka，A.，Ito,H.，Tanaka,R.，Tanaka，N.K.，Yoshida，K.，andOkada,K.(1998).Chlorophyllaoxygenase(CAO)isinvolvedinchlorophyllbformationfromchlorophylla.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences95，12719-12723.·TiehmA(2001)CombinationofUltrasonicandBiologicalPollutantDegradation.InAdvancesinSonochemistry:U1trasoundinEnvironmentalProtectionVol.6，MasonTJandTiehmA，Eds.，JAIPress:Stamford，CT，25—58.·WalkerTL，ColletCandPurtonS(2005)Algaltransgenicsinthegenomicera.JournalofPhycology41:1077一1093.·Watson,G.M.F.,Yu,J.-P.&Tabita,F.R.(1999).Unusualribulose1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaseofanoxicArchaea.J.Bacteriol.181,1569-1575.·Xiong，LandSayre,R.T.(2004)EngineeringthechloroplastencodedproteinsofChlamydomonas.PhotosynthesisResearch80:411—419·參Xu，H.，Miao，X.,andWu,Q.(2006).HighqualitybiodieselproductionfromamicroalgaChlorellaprotothecoidesbyheterotrophicgrowthinfermenters.JournalofBiotechnology126，499-507.#YangC.，HuaQ.andShimizuK.(2000).Energeticsandcarbonmetabolismduringgrowthofmicroalgalcellsunderphotoautotnophic，mixotrophicandcycliclightautotrophic/dark-heterotrophicconditions.BiochemicalEngineeringJournal6:87_102.·YeG-N,HajdukiewiczPTJ，BroylesD，RodriguezD，XuCW,NehraNandStaubJM(2001).Plastid-expressed5~enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegenesprovidehighlevelglyphosatetoleranceintobacco.ThePlantJournal25261-270.·ZabawinskiC，VanDenKoornhuyseN，D'HulstC，SchlichtingR，GierschC，DelrueB.，LacroixJM,PreissJ.andBallS(2001).StarchlessMutantsofChlamydomonasreinhardtiilackthesmallsubunitofaheterotetramericADP-glucosepyrophosphorylase.JournalofBacteriology183:1069-1077·權(quán)利要求一種增強(qiáng)藻類物種中的脂質(zhì)生產(chǎn)的方法，包括提供含油藻類；和向所述含油藻類飼喂生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有有效量的甘油，與飼喂不含有甘油的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的相應(yīng)含油藻類相比，其提高所述含油藻類的脂質(zhì)生產(chǎn)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述藻類已經(jīng)遺傳地修飾。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述藻類是光合的。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述光合的藻類在所述藻類的光合過程基本上無(wú)活性的時(shí)期期間飼喂生長(zhǎng)培養(yǎng)基。5.一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼小抑制性核糖核酸(“siRNA”)分子的核苷酸序列，所述小抑制性核糖核酸分子抑制選自由編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成的組的一種或更多種代謝基因的表達(dá)。6.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼兩種所述代謝基因。7.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼三種所述代謝基因。8.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼四種所述代謝基因。9.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼五種所述代謝基因。10.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼PDC、PFL1/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)。11.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼LHCII-b、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)。12.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中所述代謝基因編碼Cao、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)。13.一種分離的小抑制性核糖核酸(“siRNA”)分子，其抑制編碼AGPase、Cao、LHC-IIb、PDC或PFL1/PFLA的一種或更多種核酸分子的表達(dá)。14.一種基因堆疊表達(dá)載體，其包含與表達(dá)控制序列相連的一種或更多種核酸序列，所述核酸序列編碼刺激提高的脂質(zhì)生產(chǎn)的一種或更多種多肽，其中所述多肽選自由ACCase、DGAT、油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白構(gòu)成的組。15.權(quán)利要求14的基因堆疊表達(dá)載體，與抗生素抗性基因可操作連接。16.權(quán)利要求14的基因堆疊表達(dá)載體，進(jìn)一步包含選自以下的一種或更多種基因(i)能夠?yàn)檗D(zhuǎn)化的藻類賦予莠去津抗性的突變的PsbA基因，()來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合酶基因，(iii)編碼兔嗜中性粒細(xì)胞肽-I(NP-I)多肽的基因，(iv)一種或更多種賦予抗生素抗性的基因。17.權(quán)利要求14的基因堆疊表達(dá)載體，進(jìn)一步包含編碼多肽NP-I的核酸序列。18.權(quán)利要求14的基因堆疊表達(dá)載體，進(jìn)一步包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含編碼小抑制性核糖核酸("siRNA")分子的核苷酸序列，所述小抑制性核糖核酸分子抑制選自由編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFLl/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成的組的一種或更多種代謝基因的表達(dá)。19.一種表達(dá)載體，包含與表達(dá)控制序列可操作連接的、編碼PCC7942ftp-l基因的核酸序列。20.權(quán)利要求19的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含與表達(dá)控制序列可操作連接的，編碼選自組ACCase、DGAT、油體鈣蛋白和油質(zhì)蛋白的一種或更多種多肽的核酸序列。21.權(quán)利要求19的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含編碼小抑制性核糖核酸(“siRNA")分子的核苷酸序列，所述小抑制性核糖核酸分子抑制選自由編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFL1/PFLA和AGPase蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成的組的一種或更多種代謝基因的表達(dá)。22.權(quán)利要求19的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含選自以下的一種或更多種基因(i)能夠?yàn)檗D(zhuǎn)化的藻類賦予莠去津抗性的突變的PsbA基因，()來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合酶基因，(iii)編碼兔嗜中性粒細(xì)胞肽-I(NP-I)多肽的基因，(iv)一種或更多種賦予抗生素抗性的基因。23.—種重組藻類，包含一種或更多種以下的根據(jù)權(quán)利要求5-12的表達(dá)盒；根據(jù)權(quán)利要求14-18的基因堆疊表達(dá)載體；或根據(jù)權(quán)利要求19-22的表達(dá)載體。24.一種遺傳修飾藻類物種的方法，包括(a)向所述藻類的基因組中導(dǎo)入選自以下的兩種或更多種核酸序列以獲得轉(zhuǎn)化的藻類(i)編碼小抑制性核糖核酸(“siRNA”)分子的一種或更多種核苷酸序列，所述小抑制性核糖核酸分子抑制編碼Cao、LHCII-b、PDC、PFL1/PFLA或AGPase蛋白質(zhì)的一種或更多種代謝基因的表達(dá)；()編碼選自由ACCase、DGAT、油體鈣蛋白或油質(zhì)蛋白的一種或更多種多肽的一種或更多種核酸序列；(iii)與表達(dá)控制序列可操作連接的、編碼PCC7942ftp-l基因的核酸序列；(iv)能夠?yàn)檗D(zhuǎn)化的藻類賦予莠去津抗性的psbA基因的突變的形式，(ν)來自土壤桿菌屬的草甘膦抗性EPSP合酶基因，(vi)編碼兔嗜中性粒細(xì)胞肽-I(NP-I)多肽的基因，(vii)一種或更多種賦予抗生素抗性的基因，和(b)選擇在培養(yǎng)中展現(xiàn)了提高的生長(zhǎng)或油生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化的藻類。全文摘要本發(fā)明的實(shí)施方式利用了理論的遺傳學(xué)和化學(xué)工程化策略來實(shí)現(xiàn)來自微藻的生物燃料生產(chǎn)中的再更高的效率。這些提高的效率可以通過在此公開的靶向的和良好設(shè)計(jì)的化學(xué)和遺傳工程化方法的應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)。示范性的實(shí)施方式集中于提高單細(xì)胞油產(chǎn)量，提高藻類培養(yǎng)密度和提高油生產(chǎn)的效率。單獨(dú)地或組合地，示范性的實(shí)施方式可以降低生產(chǎn)一桶生物燃料的成本以允許商業(yè)上的生存性。文檔編號(hào)A01H1/00GK101932706SQ200880126118公開日2010年12月29日申請(qǐng)日期2008年12月4日優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日發(fā)明者R·T·塞爾,S·L·佩雷拉申請(qǐng)人:俄亥俄州州立大學(xué)研究基金會(huì)